CN103923071A - 一种用于识别肼的特异性荧光探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种用于识别肼的特异性荧光探针及其应用，其属于精细化工领域。该荧光探针为4-三氟甲基-7-氨基香豆素衍生物。按照比例将4-三氟甲基-7-羟基香豆素、邻苯二甲酸酐和乙酸钠置于反应瓶中，加入醋酸回流，得到该荧光探针。该荧光探针及相应肼含量检测过程不会受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种生物体系中肼含量的定量测定。该探针具有高特异性，可与肼特异性反应后水解，水解产物具有良好的荧光特性。原料廉价易得，可经化学合成获得，合成工艺简单易行；灵敏度高，适合对细胞中肼含量进行检测，通过绘制标准曲线进行肼定量测定。该探针为比率型探针，有效的避免了探针分布不均匀、环境因素、激发器等对测量结果的影响。

Description

一种用于识别肼的特异性荧光探针及其应用
技术领域
本发明涉及一种用于识别肼的特异性荧光探针及其应用，其属于精细化工领域。
背景技术
肼的化学式为N2H4,是一种重要的工业原料,极易溶于水后形成水合肼。肼是一种还原剂,在化学化工、制药工业及农业产业中发挥中重要作用,可用于制备包括催化剂、防腐剂、纺织染料和医药中间在内的多种工业产品。肼也是一种重要的商能燃料,广泛用于火箭助推系统及导弹系统中。但是肼也具有很强的毒性,在制造、使用、运输和处理中容易造成对环境的严重污染。事实上,肼被美国环境保护署(Environmental Protection Agency)划分为人类致癌剂,并对其浓度阈值设定了极其严格的标准:自然水体中肼的溶度不得高于10ppb。作为一种神经毒素及致癌剂, 肼会对哺乳动物的肝脏、肾脏和中枢神经系统造成严重的损伤。肼可经口腔吸入或皮肤接触等方式被人体吸收,对人体产生巨大的伤害。因此,实现对水样中微量肼含量的准确监测有重要的生物学及医学意义。
本发明提供了一类4-三氟甲基-7-氨基香豆素衍生物用于特异性识别肼（N2H4）的探针，其与肼反应后可生成波长红移的水解产物。该反应具有高选择性、高灵敏度、反应迅速的特点。该探针可用于比色及比率检测实际水相中微量的肼含量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种识别肼的特异性荧光探针，该探针本身具有蓝色的荧光，与肼反应后产物具有黄色荧光。该探针可用于比色及比率检测实际水相中微量的肼含量。
本发明的技术方案为：一种用于识别肼的特异性荧光探针，所述荧光探针为4-三氟甲基-7-氨基香豆素衍生物，其结构式如下：
所述荧光探针的制备方法为：将1 mmol 4-三氟甲基-7-氨基香豆素、1.1 mmol 邻苯二甲酸酐及2 mmol乙酸钠置于25 ml两口瓶中，加入10 ml醋酸，110℃ 回流 48小时，减压蒸馏除去溶剂，残余固体用水洗，过滤得荧光探针，为淡黄色固体。
所述荧光探针应用于生物样本中肼含量的定量评价。该探针作为肼的特异性探针，发生水解反应，通过定量检测水解产物的荧光强度与反应前荧光强度比值来测定细胞中肼的含量。具体测定方法为：
体系中以4-三氟甲基-7-氨基香豆素衍生物作为特异性探针，探针浓度选择1~10μM；在PBS或Tris-HCl等常用缓冲液：DMSO混合溶液（体积比1:1）中，反应温度为20℃至60℃之间，优选25℃为最优反应时间；反应体系pH介于5.5~10.5之间，优选pH7.4为最优反应pH值；反应时间为5~120分钟；测定水解产物荧光强度作为肼含量的评价指标。
探针本身具有蓝色荧光，其水解产物均具有黄绿色荧光，可采用荧光检测器实现产物及底物的快速灵敏检测。荧光检测条件为：激发波长为380 nm，450 nm和495 nm。
本发明的有益效果为：该荧光探针为4-三氟甲基-7-氨基香豆素衍生物。其合成方法为：按照比例将4-三氟甲基-7-羟基香豆素、邻苯二甲酸酐和乙酸钠置于25 ml两口瓶中，加入醋酸回流，减压蒸馏出去溶剂，残余固体用水洗，过滤得荧光探针。该荧光探针及相应肼含量检测过程不会受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种生物体系中肼含量的定量测定。该荧光探针具有高特异性，可以与肼特异性反应后水解，水解产物具有良好的荧光特性。原料廉价易得，可经化学合成获得，合成工艺简单易行；灵敏度高，适合对细胞中肼含量进行检测，通过绘制标准曲线进行肼定量测定。该探针为比率型探针，有效的避免了探针分布不均匀、环境因素、激发器等因素对测量结果的影响。 
附图说明
图 1 是一种用于识别肼的特异性荧光探针的1H-NMR谱图。
图 2 是一种用于识别肼的特异性荧光探针的13C-NMR谱图。
图 3 是一种用于识别肼的特异性荧光探针的高分辨质谱。
图4 是荧光探针与不同物质反应后荧光变化结果。
图5 是荧光探针与不同浓度肼反应后荧光强度变化曲线。
图 6是荧光探针与肼反应荧光强度变化与时间的关系。
图7 是荧光探针的细胞成像图片。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1  荧光探针的化学合成
将1 mmol 4-三氟甲基-7-氨基香豆素与1.1 mmol 邻苯二甲酸酐，2 mmol乙酸钠置于25 ml两口瓶中，加入10 ml醋酸，110℃ 回流 48小时，减压蒸馏出去溶剂，残余固体用水洗，过滤得到112 mg 淡黄色固体为荧光探针，荧光探针的表征结果见图1、图2和图3。
实施例2  对于不同物质的选择性
（1）预先准备 99 μl 代谢反应体系，包括pH 7.4的PBS缓冲液（10 mM）：DMSO（体积比1:9），氟离子（100μM）、氯离子（50μM）、溴离子（100μM）、碘离子（100μM）、钠离子（100μM）、钾离子（100μM）、钙离子（100μM）、镁离子（100μM）、硝酸根离子（100μM）、肼（100μM）
（2）向反应体系中加入1 μl终浓度为10 μM 探针起始反应；
（3）40 min后，进行荧光检测；计算各体系中荧光强度（见图4）。
实施例3  与肼浓度线性关系
（1）预先准备 99 μl 代谢反应体系，包括pH 7.4的PBS缓冲液（10 mM）：DMSO（体积比1:1），肼(0-200 μM)，于37℃条件下反应40分钟；
（2）向反应体系中加入1 μl终浓度为10 μM探针起始反应；
（3）40 min后，进行荧光检测；计算各体系中荧光强度，建立荧光强度与肼浓度标准曲线，标准曲线为y = 762.68x + 1845.5，R2 = 0.9973 ，其中，y代表496 nm处荧光强度与450 nm处荧光强度的比值，x代表肼浓度（肼浓度在1 uM至150 uM之间线性关系满足）（见图5）。 
实施例4为探针与肼反应荧光强度变化与时间的关系
（1）预先准备 99 μl 代谢反应体系，包括pH 7.4的PBS缓冲液（10 mM）：DMSO（体积比1:1），肼(300 μM)，于37℃条件下反应40分钟；
（2向反应体系中加入1 μl终浓度为10 μM探针起始反应；
（3）40 min后，进行荧光检测；计算各体系中荧光强度，建立荧光强度与肼反应时间线性关系曲线（见图6）。
实施例5 定量测定人肺腺癌A549细胞中肼含量
（1）人肺腺癌A549细胞系培养于盖玻片上，采用的培养基是DMEM培养基（含10%小牛血清）以及100 μg/ml的双抗，培养环境为25℃的5%二氧化碳培养箱中；
（2）使用之前，贴壁细胞采用不含血清的DMEM培养基冲洗3次，加入终浓度为10 μM的探针，于25℃温孵40分钟；
（3）之后，采用PBS缓冲液冲洗3次。在激光共聚焦显微镜下观察细胞，通过荧光分布位置与强度来显示细胞中含量（见图7）。

Claims (2)

1.一种用于识别肼的特异性荧光探针，其特征在于：所述荧光探针为4-三氟甲基-7-氨基香豆素衍生物，其结构式如下：
   
所述荧光探针的制备方法包括如下步骤：
将1 mmol 4-三氟甲基-7-氨基香豆素与1.1 mmol 邻苯二甲酸酐，2 mmol乙酸钠置于25 ml两口瓶中，加入10 ml醋酸，110℃ 回流 48小时，减压蒸馏除去溶剂，残余固体用水洗，过滤得到荧光探针。
2.根据权利要求1所述的一种用于识别肼的特异性荧光探针，其特征在于：所述荧光探针应用于生物样本中肼含量的定量评价。
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