CN110361343A - 一种基于寡聚核苷酸调控四氧化三锰催化活性的重金属比色检测方法 - Google Patents
一种基于寡聚核苷酸调控四氧化三锰催化活性的重金属比色检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于寡聚核苷酸调控四氧化三锰催化活性的重金属比色检测方法，制备已知靶标重金属(汞(II)或镉(II))浓度的待测样液A1品；制备空白对照溶液A2品；取A1品和A2品分别微板分光光度计进行测定450nm处溶液的吸光度值，获得吸光度差值(ΔA)；根据吸光度差值绘制得到靶标重金属浓度与吸光度变化量标准曲线；根据标准曲线建立有关靶标重金属浓度与吸光度之间相互关系的回归方程；制备未知靶标重金属浓度的待测溶液(河水、湖水、自来水)C品；取C品用微板分光光度计测定450nm处溶液的吸光度值，计算C品与A2品的吸光度差值，将该差值代入线性回归方程中，即可获得C品中靶标重金属的浓度。该方法具有构建方便、灵敏度高、特异性好等优势。
Description
技术领域
本发明涉及一种汞(II)或镉(II)重金属检测方法，特别是一种基于寡聚核苷酸调控四氧化三锰催化活性的汞(II)或镉(II)重金属检测方法。
背景技术
重金属在食物链中具有生物累积性，即使在非常低的浓度下也会对人类健康和自然环境造成严重威胁。为了避免潜在的健康风险，美国环境保护署(EPA)已将饮用水中重金属的允许浓度设定为2-15μg/L。因此，微量重金属的检测对于环境监测、食品安全、医疗和临床检验都具有重要意义。传统的分析方法如原子吸收光谱法(AAS)、原子荧光光谱法(AFS)和电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)已广泛应用于重金属的超灵敏检测。虽然这些方法灵敏、准确，但通常需要较长的分析时间、专业的操作人员和精密的仪器。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种基于寡聚核苷酸调控四氧化三锰催化活性的重金属比色检测方法。本方法以八面体形状的四氧化三锰纳米粒子作为识别工具，寡聚核苷酸作为催化活性抑制剂，3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)作为底物，都不需要任何的接枝和修饰。既可以克服传统的缺陷，又可以简便可靠的构建比色传感器，提高检测的特异性和灵敏度。该方法具有构建方便、灵敏度高、特异性好等优势，可应用于水中靶标重金属的快速检测。
本发明的技术方案：一种基于寡聚核苷酸调控四氧化三锰催化活性的重金属比色检测方法，包括有以下步骤：
(1)A：绘制靶标重金属(汞(II)或镉(II))浓度与吸光度变化量的标准曲线；
①：制备已知靶标重金属浓度的待测样液，得A1品；
②：制备空白对照溶液，得A2品；
③：取A1品和A2品，分别用微板分光光度计进行测定450nm处溶液的特征吸收峰对应的吸光度值为A和A0，并获得其光度差值(ΔA)；
④：根据吸光度差值制得到靶标重金属浓度与吸光度变化量标准曲线；
(2)：根据靶标重金属(汞(II)或镉(II))浓度与吸光度变化量标准曲线建立有关靶标重金属浓度与吸光度变化之间相互关系的回归方程；
(3)：制备未知靶标重金属浓度的待测溶液，得C品；
(4)：取C品用微板分光光度计进行测定450nm处溶液的吸光度值，计算C品与A2品的吸光度差值，将该吸光度差值代入线性回归方程中，即可获得C品中靶标重金属的浓度。
前述的基于寡聚核苷酸调控四氧化三锰催化活性的重金属比色检测方法中，所述(1)，绘制汞(II)或镉(II)浓度与吸光度变化量标准曲线的具体方法为：
A1：取多支刻度离心管，每支刻度离心管加入一定浓度的八面体形状的四氧化三锰纳米粒子(Mn3O4NPs)和寡聚核苷酸(ssDNA(Hg))混匀后孵育，然后加入已知浓度的汞(II)或镉(II)标准液，再加入定量的盐离子溶液，混匀后孵育，加入NaAc缓冲液，最后加入底物TMB混匀即可制备得到待测样液，为A1品；
A2：取1支刻度离心管，用二蒸水替代已知浓度的汞(II)或镉(II)标准液，按照A1的方法即可制备得到空白对照溶液，为A2品；
A3：取A1品和A2品，分别用微板分光光度计进行测定450nm处溶液的吸光度值；
A4：根据吸光度值，将不同浓度的A1品与A2品之间的吸光度差值作为纵坐标，汞(II)或镉(II)浓度作为横坐标绘制得到靶标重金属浓度与吸光度变化量标准曲线；
所述步骤(2)中，当汞(II)浓度为10μg/L≤C≤200μg/L时，其浓度与吸光度变化量之间相互关系的回归方程为：y＝0.006C+0.036；当镉(II)浓度为5μg/L≤C≤100μg/L时，其浓度与吸光度变化量之间相互关系的回归方程为：y＝0.0095C+0.109；
y为吸光度差值＝含靶标重金属的待测品的吸光度值-A2品的吸光度值；
所述步骤(3)中：用实际样液替代已知浓度的靶标重金属标准液，按照A1的方法即可制备得到未知靶标重金属浓度的待测溶液，为C品。
所述的Mn3O4NPs溶液的浓度为20μg/mL；NaCI溶液的浓度为5mM；NaAc缓冲液为25mM，pH 3.0；TMB溶液为0.05mM。
前述的基于寡聚核苷酸调控四氧化三锰催化活性的重金属比色检测方法，能调控四氧化三锰(八面体)催化活性的寡聚核苷酸有ssDNA(Kana)其序列为：5’-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’；ssDNA(S-18)其序列为：5’-TGTAATTTGTCTGCAGCGGTTCTTGATCGCTGACACCATATTATGAAGA-3’；ssDNA(Pb)其序列为：5’-GGGTGGGTGGGTGGGT-3’；ssDNA(PW)其序列为：5’-GGGTAGGGCGGGTTGGG-3’；ssDNA(STR1)其序列为：5’-TAGGGAATTCGTCGACGGATCCGGGGTCTGGTGTTCTGCTTTGTTCTGTCGGGTCGTCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’；ssDNA(OTA)其序列为：5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’；ssDNA(TET)其序列为：5’-CGTACGGAATTCGCTAGCCCCCCGGCAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGCGCGTGGATCCGAGCTCCACGTG-3’；ssDNA(Hg)的序列为：5’-GCTTTCTTCTTTCTTCCCCCCTTGTTTGTTGTTTGC-3’，其浓度均为20nM。
所述Mn3O4NPs溶液的制备方法为：按下述比例备料，0.0525g高锰酸钾(KMnO4)，15mL双蒸水，15mL聚乙二醇(PEG-200)，将KMnO4(0.0525g)完全溶解在15mL双蒸水中，15mL聚乙二醇(PEG-200)被加入上述溶液中，在室温下磁力搅拌30分钟，将悬浮液转移至聚四氟乙烯内衬不锈钢高压反应釜中在120℃反应8小时。自然冷却至室温后，将高压釜中产生的棕色沉淀物离心后，然后用无水乙醇和双蒸馏水洗涤数次。最后，将得到的棕色沉淀放入40℃烘箱中干燥12小时得到粉体。称取一定量的Mn3O4NPs(八面体)粉体，超声分散于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，室温下保存以备使用。
所述的步骤③及步骤(4)中，获得特征吸收峰的具体方法：取待测品置于96孔微孔板中，用微板分光光度计进行测定波长扫描范围300-800nm处溶液的吸光度值，获得其吸收光谱。
前述的基于寡聚核苷酸调控四氧化三锰催化活性的重金属比色检测方法，其特征在于：所述的A1品、A2品或C品制备过程中：
在刻度离心管中加入已知浓度八面体形状的四氧化三锰纳米粒子(Mn3O4NPs)和寡聚核苷酸(ssDNA(Hg))混匀后置于30-35℃条件下孵育15-20min孵育，然后加入已知浓度的汞(II)或镉(II)标准液，二蒸水或实际样液，再加入定量的盐离子溶液，混匀后置于30-35℃条件下孵育25-30min孵育，之后加入NaAc缓冲液混匀，最后加入底物TMB。
所述的A1品、A2品或C品制备过程中：已知浓度的Mn3O4NPs、ssDNA(Hg)、靶标重金属标准液、二蒸水、实际样液、盐离子溶液的用量为10.0μL；加入450.0μL的NaAc缓冲液；TMB溶液的用量为：10.0μL；最后得到500μL的最终体积。
所述盐离子溶液为NaCI溶液。
所述寡聚核苷酸使用前，将其溶解于Tris-HCl缓冲溶液中，并在90℃下变性处理5分钟，然后冷却至室温，Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10mM，pH值为8.0。
本发明的有益效果：与现有技术相比，本方法检测原理为：本文利用富胸腺嘧啶(T)序列(ssDNA(Hg))调节Mn3O4NPs的氧化酶模拟活性，并首次利用该序列调节Mn3O4NPs的氧化酶模拟活性构建用于检测重金属离子的比色传感器。本传感器中使用的ssDNA(Hg)序列有两个用途：作为抑制剂调节Mn3O4NPs的催化活性，并作为识别元件结合重金属离子的目标。ssDNA(Hg)序列在一定形状的Mn3O4NPs表面吸附，抑制了其对基质TMB的催化氧化，导致450nm处的吸收峰降低，感测溶液由最初的黄色变为浅绿色。在靶标重金属离子存在下，ssDNA(Hg)序列首先与它们结合，通过错配碱基对形成一些配合物。因此，调控序列不再抑制Mn3O4NPs的氧化酶模拟活性，传感溶液的颜色恢复为黄色。传感体系颜色的恢复与靶标重金属的量成正比，因而该方法可以用于重金属检测。目标重金属的平均回收率在80％到108％之间，根据每种浓度的三次实验，计算出0.74％到9.62％的平均相对标准差(RSD)。该方法在KCl,CaCl2,MgCl2,FeSO4,CuSO4,Pb(NO3)2,ZnCl2,AgNO3,FeCl3,Co(NO3)2和Na2CrO4等的干扰中可以特异性地检测汞(II)和镉(II)。所提出的传感策略具有成本效益高、操作简单的优点，可以通过替换相应的适配体扩展到检测其他感兴趣的目标。
附图说明
附图1、2均为靶标重金属检测的可行性示意图；
附图3为检测靶标重金属的原理图；
附图4为不同种类寡聚核苷酸(ssDNA)对Mn3O4NPs(八面体)催化活性影响；
附图5为不同浓度汞(II)与溶液的吸光度差值(ΔA)的对应关系；
附图6为不同浓度镉(II)与溶液的吸光度差值(ΔA)的对应关系；
附图7为其它金属离子对汞(II)检测的影响示意图；
附图8为其它金属离子对镉(II)检测的影响示意图；
附图9为实际样品中靶标重金属的检测示意图。
附图1、2和附图3是该发明的原理推测及可行性研究，表明本发明方法可用于重金属检测。
图1中，1-四氧化三锰(八面体)+底物(TMB)；2-四氧化三锰(八面体)+寡聚核苷酸(ssDNA(Hg))+氯化钠+底物(TMB)；3-四氧化三锰(八面体)+寡聚核苷酸(ssDNA(Hg))+氯化钠+50μg/L汞(II)+底物(TMB)；4-四氧化三锰(八面体)+寡聚核苷酸(ssDNA(Hg))+氯化钠+400μg/L汞(II)+底物(TMB)。
图2中，1-四氧化三锰(八面体)+400μg/L汞(II)+底物(TMB)；2-四氧化三锰(八面体)；3-底物(TMB)；4-寡聚核苷酸(ssDNA(Hg))+氯化钠+400μg/L汞(II)+底物(TMB)；5-寡聚核苷酸(ssDNA(Hg))+底物(TMB)；6-400μg/L汞(II)+底物(TMB)。
附图4中可以看出，多种寡聚核苷酸均能很好地抑制四氧化三锰(八面体)纳米粒子的氧化酶活性。
附图5展示了本发明检测汞(II)的线性范围是10-200μg/L的，并具有最低检测限为3.8μg/L；附图6展示了本发明检测镉(II)的线性范围是5-100μg/L的，并具有最低检测限为2.4μg/L；表明该发明具有稳定性好、灵敏度高的特点。
附图7、8中可以看出，本发明建立的方法可以特异性地检测出汞(II)或镉(II)，其他竞争性的靶标对汞(II)或镉(II)的检测几乎无干扰。
附图9所示，用本发明方法测定当地的河水、湖水、自来水的水样，往样品中分别加入100μg/L、200μg/L、400μg/L的汞(II)；分别加入50μg/L、100μg/L、200μg/L的镉(II)；得到的回收率为80％-108％，证明本方法可靠性。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
本发明的实施例：一种基于寡聚核苷酸调控四氧化三锰催化活性的重金属比色检测方法，包括有以下步骤：
寡聚核苷酸对四氧化三锰(八面体)催化活性的调控，如附图4所示，具体方式为：取几支左右1.5mL刻度离心管，每支刻度离心管加入10.0μL的浓度为20μg/mL的八面体四氧化三锰(Mn3O4NPs)和10.0μL浓度为20nM的不同种类寡聚核苷酸(空白用同体积的二蒸水代替)，充分混匀后置于30℃条件下孵育30min，随后加入470μL的浓度为25mM(pH 3.0)的NaAc缓冲溶液混匀，最后加入10.0μL的底物(TMB)充分混匀，即可制备得到500.0μL的待测溶液，并置于酶标仪专用的96孔微孔板中，用微板分光光度计进行测定450nm处溶液的特征吸收峰对应的吸光度值。附图4中可以看出，多种寡聚核苷酸均能很好地抑制四氧化三锰(八面体)纳米粒子的氧化酶活性。
本发明的实施例1：一种基于寡聚核苷酸调控四氧化三锰催化活性的重金属比色检测方法，包括有以下步骤：
(1)绘制靶标重金属浓度与吸光度变化量标准曲线，该标准曲线如附图5、6所示，其中包括有以下步骤：
A1：制备已知靶标重金属(汞(II)或镉(II))浓度的待测样液，得A1品。具体方式为：取18支左右1.5mL刻度离心管，每支刻度离心管加入10.0μL的浓度为20μg/mL的八面体四氧化三锰(Mn3O4NPs)和10.0μL浓度为20nM的ssDNA(Hg)，充分混匀后置于30℃条件下孵育20min，然后加入10.0μL已知浓度的靶标重金属，再加入10.0μL的浓度为5mM NaCI盐离子溶液，溶液充分混匀后置于30℃条件下再孵育30min，随后加入450μL的浓度为25mM(pH 3.0)的NaAc缓冲溶液混匀，最后加入10.0μL的底物(TMB)充分混匀，即可制备得到500.0μL的待测溶液，为A1品。
A2：制备空白对照溶液，得A2品。具体方式为：另取1支1.5mL刻度离心管，用同体积10.0μL的二蒸水替代靶标重金属标准液，按步骤A1的方法即可制得空白对照溶液A2品。
A3：将准备好的不同靶标重金属浓度的待测样液A1品，和1支空白对照溶液A2品置于酶标仪专用的96孔微孔板中，用微板分光光度计进行测定450nm处溶液的特征吸收峰对应的吸光度值为A和A0，并获得其吸光度变化值(ΔA)；
A4：根据吸光度变化值(ΔA)制得到靶标重金属浓度与吸光度变化量标准曲线。具体绘制方法为：将不同浓度的A1品与A2品之间的吸光度变化值(ΔA)作为纵坐标，靶标重金属浓度作为横坐标绘制得到靶标重金属浓度与吸光度变化量标准曲线。
(2)、根据靶标重金属浓度与吸光度变化量标准曲线建立有关靶标重金属浓度与吸光度变化值之间相互关系的回归方程。当汞(II)的浓度为10μg/L≤C≤200μg/L时，其浓度与吸光度变化量之间相互关系的回归方程为：y＝0.006C+0.036；当镉(II)浓度为5μg/L≤C≤100μg/L时，其浓度与吸光度变化量之间相互关系的回归方程为：y＝0.0095C+0.109；
(3)：制备未知靶标重金属浓度的待测溶液(河水)，得C品。具体的方法为：用同体积的实际样液替代已知浓度的靶标重金属标准液，按照A1的方法即可制备得到未知靶标重金属浓度的待测溶液，为C品。
(4)：取C品用微板分光光度计进行测定450nm处溶液的吸光度值，计算C品与A2品的吸光度差值，将该吸光度差值代入线性回归方程中，即可获得C品中靶标重金属的浓度。
本发明的实施例2：一种基于寡聚核苷酸调控四氧化三锰催化活性的重金属比色检测方法，包括有以下步骤：
(1)绘制靶标重金属浓度与吸光度变化量标准曲线，该标准曲线如附图5、6所示，其中包括有以下步骤：
A1：制备已知靶标重金属(汞(II)或镉(II))浓度的待测样液，得A1品。具体方式为：取18支左右1.5mL刻度离心管，每支刻度离心管加入10.0μL的浓度为20μg/mL的八面体四氧化三锰(Mn3O4NPs)和10.0μL浓度为20nM的ssDNA(Hg)，充分混匀后置于30℃条件下孵育20min，然后加入10.0μL已知浓度的靶标重金属，再加入10.0μL的浓度为5mM NaCI盐离子溶液，溶液充分混匀后置于30℃条件下再孵育30min，随后加入450μL的浓度为25mM(pH 3.0)的NaAc缓冲溶液混匀，最后加入10.0μL的底物(TMB)充分混匀，即可制备得到500.0μL的待测溶液，为A1品。
A2：制备空白对照溶液，得A2品。具体方式为：另取1支1.5mL刻度离心管，用同体积10.0μL的二蒸水替代靶标重金属标准液，按步骤A1的方法即可制得空白对照溶液A2品。
A3：将准备好的不同靶标重金属浓度的待测样液A1品，和1支空白对照溶液A2品置于酶标仪专用的96孔微孔板中，用微板分光光度计进行测定450nm处溶液的特征吸收峰对应的吸光度值为A和A0，并获得其吸光度变化值(ΔA)；
A4：根据吸光度变化值(ΔA)制得到靶标重金属浓度与吸光度变化量标准曲线。具体绘制方法为：将不同浓度的A1品与A2品之间的吸光度变化值(ΔA)作为纵坐标，靶标重金属浓度作为横坐标绘制得到靶标重金属浓度与吸光度变化量标准曲线。
(2)、根据靶标重金属浓度与吸光度变化量标准曲线建立有关靶标重金属浓度与吸光度变化值之间相互关系的回归方程。当汞(II)的浓度为10μg/L≤C≤200μg/L时，其浓度与吸光度变化量之间相互关系的回归方程为：y＝0.006C+0.036；当镉(II)浓度为5μg/L≤C≤100μg/L时，其浓度与吸光度变化量之间相互关系的回归方程为：y＝0.0095C+0.109；
(3)：制备未知靶标重金属浓度的待测溶液(湖水)，得C品。具体的方法为：用同体积的实际样液替代已知浓度的靶标重金属标准液，按照A1的方法即可制备得到未知靶标重金属浓度的待测溶液，为C品。
(4)：取C品用微板分光光度计进行测定450nm处溶液的吸光度值，计算C品与A2品的吸光度差值，将该吸光度差值代入线性回归方程中，即可获得C品中靶标重金属的浓度。
本发明的实施例3：一种基于寡聚核苷酸调控四氧化三锰催化活性的重金属比色检测方法，包括有以下步骤：
(1)绘制靶标重金属浓度与吸光度变化量标准曲线，该标准曲线如附图5、6所示，其中包括有以下步骤：
A1：制备已知靶标重金属(汞(II)或镉(II))浓度的待测样液，得A1品。具体方式为：取18支左右1.5mL刻度离心管，每支刻度离心管加入10.0μL的浓度为20μg/mL的八面体四氧化三锰(Mn3O4NPs)和10.0μL浓度为20nM的ssDNA(Hg)，充分混匀后置于30℃条件下孵育20min，然后加入10.0μL已知浓度的靶标重金属，再加入10.0μL的浓度为5mM NaCI盐离子溶液，溶液充分混匀后置于30℃条件下再孵育30min，随后加入450μL的浓度为25mM(pH 3.0)的NaAc缓冲溶液混匀，最后加入10.0μL的底物(TMB)充分混匀，即可制备得到500.0μL的待测溶液，为A1品。
A2：制备空白对照溶液，得A2品。具体方式为：另取1支1.5mL刻度离心管，用同体积10.0μL二蒸水替代靶标重金属标准液，按步骤A1的方法即可制得空白对照溶液A2品。
A3：将准备好的不同靶标重金属浓度的待测样液A1品，和1支空白对照溶液A2品置于酶标仪专用的96孔微孔板中，用微板分光光度计进行测定450nm处溶液的特征吸收峰对应的吸光度值为A和A0，并获得其吸光度变化值(ΔA)；
A4：根据吸光度变化值(ΔA)制得到靶标重金属浓度与吸光度变化量标准曲线。具体绘制方法为：将不同浓度的A1品与A2品之间的吸光度变化值(ΔA)作为纵坐标，靶标重金属浓度作为横坐标绘制得到靶标重金属浓度与吸光度变化量标准曲线。
(2)、根据靶标重金属浓度与吸光度变化量标准曲线建立有关靶标重金属浓度与吸光度变化值之间相互关系的回归方程。当汞(II)浓度为10μg/L≤C≤200μg/L时，其浓度与吸光度变化量之间相互关系的回归方程为：y＝0.006C+0.036；当镉(II)浓度为5μg/L≤C≤100μg/L时，其浓度与吸光度变化量之间相互关系的回归方程为：y＝0.0095C+0.109；
(3)：制备未知靶标重金属浓度的待测溶液(自来水)，得C品。具体的方法为：用同体积的实际样液替代已知浓度的靶标重金属标准液，按照A1的方法即可制备得到未知靶标重金属浓度的待测溶液，为C品。
(4)：取C品用微板分光光度计进行测定450nm处溶液的吸光度值，计算C品与A2品的吸光度差值，将该吸光度差值代入线性回归方程中，即可获得C品中靶标重金属的浓度。
以上实施例中，所使用Mn3O4NPs溶液的制备方法为：按下述比例备料，0.0525g高锰酸钾(KMnO4)，15mL双蒸水，15mL聚乙二醇(PEG-200)，将KMnO4(0.0525g)完全溶解在15mL双蒸水中，15mL聚乙二醇(PEG-200)被加入上述溶液中，在室温下磁力搅拌30分钟，将悬浮液转移至聚四氟乙烯内衬不锈钢高压反应釜中在120℃反应8小时。自然冷却至室温后，将高压釜中产生的棕色沉淀物离心后，然后用无水乙醇和双蒸馏水洗涤数次。最后，将得到的棕色沉淀放入40℃烘箱中干燥12小时得到粉体。称取一定量的Mn3O4NPs(八面体)粉体，超声分散于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，室温下保存以备使用。
以上实施例中，寡聚核苷酸ssDNA(Hg)由上海生物科技有限公司合成及纯化，其序列为：5’-GCTTTCTTCTTTCTTCCCCCCTTGTTTGTTGTTTGC-3’，使用前，将ssDNA(Hg)溶解于浓度为10mM，pH为8.0的Tris-HCl缓冲溶液中，并在90℃下剧烈变性处理5分钟，然后冷却至室温(25-30℃)。
序列表
<110> 贵州大学
<120> 一种基于寡聚核苷酸调控四氧化三锰催化活性的重金属比色检测方法
<130> 1
<160> 8
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 寡聚核苷酸ssDNA(Hg)
<400> 1
GCTTTCTTCTTTCTTCCCCCCTTGTTTGTTGTTTGC
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 寡聚核苷酸ssDNA(Kana)
<400> 2
TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 寡聚核苷酸ssDNA(S-18)
<400> 3
TGTAATTTGTCTGCAGCGGTTCTTGATCGCTGACACCATATTATGAAGA
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 寡聚核苷酸ssDNA(Pb)
<400> 4
GGGTGGGTGGGTGGGT
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 寡聚核苷酸ssDNA(PW)
<400> 5
GGGTAGGGCGGGTTGGG
<210> 6
<211> 79
<212> DNA
<213> 寡聚核苷酸ssDNA(STR1)
<400> 6
TAGGGAATTCGTCGACGGATCCGGGGTCTGGTGTTCTGCTTTGTTCTGTCGGGTCGTCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 寡聚核苷酸ssDNA(OTA)
<400> 7
GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA
<210> 8
<211> 76
<212> DNA
<213> 寡聚核苷酸ssDNA(TET)
<400> 8
CGTACGGAATTCGCTAGCCCCCCGGCAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGCGCGTGGATCCGAGCTCCACGTG
Claims (8)
1.一种基于寡聚核苷酸调控四氧化三锰催化活性的重金属比色检测方法，其特征在于：包括有以下步骤：
(1)绘制靶标重金属汞(II)或镉(II)浓度与吸光度变化量的标准曲线；
(2)根据汞(II)或镉(II)浓度与吸光度变化量标准曲线建立有关汞(II)或镉(II)浓度与吸光度变化之间相互关系的回归方程；
(3)制备未知汞(II)或镉(II)浓度的待测溶液，得C品；
(4)取C品用微板分光光度计进行测定450nm处溶液的吸光度值，计算C品与A2品的吸光度差值，将该吸光度差值代入线性回归方程中，即可获得C品中汞(II)或镉(II)的浓度。
2.根据权利要求1所述的基于寡聚核苷酸调控四氧化三锰催化活性的重金属比色检测方法，其特征在于：所述步骤(1)绘制靶标重金属(汞(II)或镉(II))浓度与吸光度变化量标准曲线的具体方法为：
A1：取多支刻度离心管，每支刻度离心管加入一定浓度的八面体形状的四氧化三锰纳米粒子和寡聚核苷酸混匀后孵育，然后加入已知浓度的汞(II)或镉(II)标准液，再加入定量的盐离子溶液，混匀后孵育，加入NaAc缓冲液，最后加入底物TMB混匀即可制备得到待测样液，为A1品；
A2：取1支刻度离心管，用二蒸水替代已知浓度的汞(II)或镉(II)标准液，按照A1的方法即可制备得到空白对照溶液，为A2品；
A3：取A1品和A2品，分别用微板分光光度计进行测定450nm处溶液的吸光度值；
A4：根据吸光度值，将不同浓度的A1品与A2品之间的吸光度差值作为纵坐标，汞(II)或镉(II)浓度作为横坐标绘制得到靶标重金属浓度与吸光度变化量标准曲线。
3.根据权利要求1所述的基于寡聚核苷酸调控四氧化三锰催化活性的重金属比色检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中，当汞(II)浓度为10μg/L≤C≤200μg/L时，其浓度与吸光度变化量之间相互关系的回归方程为：y＝0.006C+0.036；当镉(II)浓度为5μg/L≤C≤100μg/L时，其浓度与吸光度变化量之间相互关系的回归方程为：y＝0.0095C+0.109；
y为吸光度差值(ΔA)＝含靶标重金属的待测品的吸光度值-A2品的吸光度值。
4.根据权利要求2所述的基于寡聚核苷酸调控四氧化三锰催化活性的重金属比色检测方法，其特征在于：所述的制备未知靶标重金属浓度的待测溶液C品的具体方法为：用实际样液替代已知浓度的靶标重金属标准液，按照A1的方法即可制备得到未知靶标重金属浓度的待测溶液，为C品。
5.根据权利要求2所述的基于寡聚核苷酸调控四氧化三锰催化活性的重金属比色检测方法，其特征在于：所述的Mn3O4 NPs溶液的浓度为10-30μg/mL；NaCI溶液的浓度为5-10mM；NaAc缓冲液为15-50mM，pH 3.0-5.0；TMB溶液为0.04-0.1mM。
6.根据权利要求2所述的基于寡聚核苷酸调控四氧化三锰催化活性的重金属比色检测方法，其特征在于：寡聚核苷酸，其浓度为20-100nM。
7.根据权利要求2所述的基于寡聚核苷酸调控四氧化三锰催化活性的重金属比色检测方法，其特征在于：所述盐离子溶液为NaCI溶液。
8.根据权利要求2所述的基于寡聚核苷酸调控四氧化三锰催化活性的重金属比色检测方法，其特征在于：所述寡聚核苷酸使用前，将其溶解于Tris-HCl缓冲溶液中，并在90℃下变性处理5分钟，然后冷却至室温，Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10mM，pH值为8.0。
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| CN110361343B (zh) | 2022-03-22 |
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