CN104597258A - 基于核酸适配体的比色法检测17β-雌二醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种基于核酸适配体的比色法检测17β-雌二醇的方法，所述方法包括绘制标准曲线：制备所述17β-雌二醇标准体系，记录其中标准溶液和对照溶液在650nm和520nm波长条件下的吸光度值，以标准溶液与对照溶液对应的相对吸光度的比值之差ΔA作图，绘制标准曲线；17β-雌二醇样品检测：向含有核酸适配体的缓冲液中加入待测样品，混匀，孵育，同时以加入水的处理为对照溶液；加入阳离子聚合物溶液，混匀，孵育；加入纳米金溶液，混匀，孵育；待测样品中17β-雌二醇含量的计算：根据样品测得的A650/A520与空白对照组的A650/A520的差值ΔA，对应标准曲线，即可求出待测样品中17β-雌二醇的浓度。

Description

基于核酸适配体的比色法检测17β-雌二醇的方法
技术领域
本发明属于水体中17β-雌二醇的检测领域，涉及一种基于核酸适配体的比色法检测17β-雌二醇的方法，尤其涉及核酸适配体、阳离子聚合物和纳米共同作用的比色法检测17β-雌二醇的方法。
背景技术
17β-雌二醇是一种天然存在的类固醇类激素，并且是人体中具有较强雌激素活性的一种雌激素。它是由人体内的类固醇合成，对于女性的性别特征的形成和维持具有十分重要的作用。同时17β-雌二醇也是一种典型的环境内分泌干扰物，暴露实验结果表明即使水体中低浓度17β-雌二醇也能够扰乱鱼的内分泌系统使得雄鱼趋于雌性化。17β-雌二醇可以通过人类和动物的代谢或者雌激素类药物生产产生的污水等途径进入到环境，间接或者直接的方式危害生殖系统的形态和功能，导致免疫缺陷，从而破坏神经-内分泌-免疫系统网络，从而威胁着水生生物以及人类的健康与安全。
传统的17β-雌二醇的检测方法有气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法和液相色谱-质谱联用等方法，虽然这些方法早已发展成熟以及检测结果准确可靠，但是在实际操作过程中需要对样品进行复杂的前处理，如萃取、浓缩和衍生化等，同时这些方法在实际应用中需要昂贵复杂的仪器设备以及训练有素的技术人员，费力费时，难以满足大规模应用及实时实地检测的需要。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是克服传统的大型仪器的检测雌二醇需要对样品进行复杂的前处理以及需要专业人员进行操作等的缺点和不足，提供一种基于核酸适配体的比色法检测17β-雌二醇的方法，具体为一种基于核酸适配体、纳米金和阳离子聚合物的比色法检测水中内分泌干扰物17β-雌二醇的方法。由于核酸适配体能够与靶标17β-雌二醇和阳离子聚合物分别形成17β-雌二醇-核酸适配体复合物和核酸适配体-阳离子聚合物的超分子结构，从而引起纳米金颗粒发生不同程度的聚集导致的颜色变化。体系的颜色和比色信号的变化与加入的17β-雌二醇的量具有一定的线性关系。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明涉及一种比色法检测17β-雌二醇的标准体系的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
步骤一、标准溶液和对照溶液的制备：向含有核酸适配体的缓冲液中加入17β-雌二醇溶液，配置浓度已知的17β-雌二醇浓度梯度溶液，混匀，孵育，得标准溶液；以含有核酸适配体的缓冲液中加入水为对照溶液；
步骤二、阳离子聚合物的加入：向上述标准溶液和对照溶液中加入阳离子聚合物溶液，混匀，孵育；
步骤三、纳米金溶液的加入：向上述加入阳离子聚合物后的标准溶液和对照溶液中加入纳米金溶液，混匀，孵育，即得比色法检测17β-雌二醇的标准体系。
优选地，步骤一中，所述标准液含15个浓度梯度；所述浓度梯度的范围为1～600μM。
优选地，步骤一中，所述标准溶液由17β-雌二醇母液配制，所述母液的配制为：称取0.2724g 17β-雌二醇溶于5mL无水乙醇中，即得。
优选地，步骤一中，所述孵育的条件为25℃、30分钟。
优选地，步骤一中，所述水为超纯水。
优选地，步骤一中，所述缓冲液的配置方法具体如下：称取0.5232g丙磺酸溶于超纯水中，定容至100mL，调节pH＝7。
优选地，步骤二中，所述阳离子聚合物包括聚二烯基丙二甲基氯化铵(PDDA)，为市售试剂；所述阳离子聚合物溶液的浓度为101nM。
优选地，步骤二中，所述孵育的条件为25℃、20分钟。
优选地，步骤三中，所述纳米金溶液的制备方法包括：将10.5mL 1.0wt％柠檬酸三纳加入到100mL煮沸的0.03wt％氯金酸溶液中，不断加热搅拌至溶液由灰色变为酒红色，继续煮沸5分钟；停止加热并冷却到室温，0.2μm超滤膜过滤，即得纳米金溶液；纳米金溶液置于4℃温度下保存待用。
优选地，步骤三中，所述孵育的条件为25℃、5分钟。
第二方面，本发明涉及基于所述标准体系的比色法检测17β-雌二醇的方法，所述方法包括如下步骤：
绘制标准曲线：制备所述17β-雌二醇标准体系，记录其中标准溶液和对照溶液在650nm和520nm波长条件下的吸光度值，以标准溶液与对照溶液对应的相对吸光度的比值之差ΔA作图，绘制标准曲线；
17β-雌二醇样品检测：向含有核酸适配体的缓冲液中加入待测样品，混匀，孵育，同时以加入水的处理为对照溶液；加入阳离子聚合物溶液，混匀，孵育；加入纳米金溶液，混匀，孵育；
待测样品中17β-雌二醇含量的计算：根据样品测得的A650/A520与空白对照组的A650/A520的差值ΔA，对应标准曲线，即可求出待测样品中17β-雌二醇的浓度。
优选地，绘制标准曲线的步骤中，所述标准曲线的回归曲线方程为ΔA＝0.05438C17β- 雌二醇+0.25547。
优选地，17β-雌二醇样品检测的步骤中，所述加入阳离子聚合物溶液后的孵育条件为25℃、20分钟；所述加入纳米金溶液后的孵育条件为25℃、5分钟。
优选地，所述核酸适配体序列如SEQ ID No.1所示。
本发明的技术方案是基于以下原理实现的：当溶液中没有加入17β-雌二醇时，阳离子聚合物能够与17β-雌二醇的核酸适配体静电结合形成一个二聚体，从而使得加入的纳米金仍然处于分散的状态，溶液仍然显红色；而当体系中加入17β-雌二醇之后，核酸适配体首先和17β-雌二醇特异性结合，形成17β-雌二醇-核酸适配体的复合结构，接下来加入的阳离子聚合物不会再和核酸适配体反应，而会使得纳米金发生聚集，使得体系的颜色发生变化，溶液的颜色随着17β-雌二醇浓度的增加逐渐由红色变为蓝色，见图1。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
(1)本发明方法用于检测水体中的17β-雌二醇，方法操作简便，核酸适配体无需标记，无需使用大型的仪器设备，克服了适配体需要标记而导致成本提高和电化学操作相对复杂的不足，降低了检测成本；
(2)本发明方法的选择性好，这是由核酸适配体本身的特点和结构决定的，在筛选适配体的过程中加入17β-雌二醇，经过十几轮的筛选后，选出能与17β-雌二醇特异性结合而不与其他物质发生特异性反应的核酸适配体；
(3)本发明方法用于检测水体的17β-雌二醇具有操作简便，检测速度快，灵敏高等优点。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明方法的检测原理图；
图2为不同浓度17β-雌二醇的吸光度；
图3为样品组与对照组A650/A520之差ΔA与不同浓度17β-雌二醇的关系；
图4为不同物质加入到检测体系中形成检测体系后的吸光度比值A650/A520。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本实施例涉及一种比色法检测17β-雌二醇的方法，具体包括如下步骤：
(1)制备17β-雌二醇核酸适配体组成的检测体系：在1.5mL的刻度离心管中，加入15μL初始浓度为500nM的17β-雌二醇核酸适配体(序列如SEQ ID No.1所示)，补加205μL缓冲液放置在25℃条件下备用；所述缓冲液的制备为：称取0.5232g丙磺酸溶于超纯水中，定容至100mL，调节pH＝7；
(2)制备已知浓度的17β-雌二醇检测体系：分别取15只按照步骤(1)方法制备的由17β-雌二醇适配体形成的检测体系混合液的离心管，分别加入50μL初始浓度为10，20，40，60，80，100，200，400，600，800，1000，1500，2000，4000，6000μM不同浓度的17β-雌二醇标准溶液，使得整个检测体系中的17β-雌二醇终浓度分别为1，2，4，6，8，10，20，40，60，80，100，150，200，400，600μM(吸光度具体如图2示)；经过充分混匀后将离心管置于25℃的条件下孵育30分钟后；再分别加入30μL初浓度为101nM的聚二烯基丙二甲基氯化铵溶液，再在25℃的条件下孵育20分钟；最后将孵育好的离心管取出，分别加入200μL纳米金溶液，再放在25℃的条件下孵育5分钟；
(3)另取一只按照步骤(1)方法制备的由17β-雌二醇适配体形成的检测体系混合液的离心管，向其中加入50μL超纯水，按照步骤(2)的操作处理后作为空白对照；
(4)分别取200μL步骤(2)和步骤(3)制备的标准溶液和空白对照液，置于96孔板中并将孔板放在酶标仪中测定混合液在650nm和520nm波长条件下的吸光度值；
(5)以不同浓度的17β-雌二醇与对应的相对吸光度的比值之差ΔA作图(具体如图3所示)，绘制标准曲线，其回归方程为ΔA＝0.05438C17β-雌二醇+0.25547；
(6)本发明方法测定17β-雌二醇的浓度范围1～8μM，17β-雌二醇最低检测限为39.2nM。
另外，本发明所涉的核酸适配体，基于其序列特异性及自然结构特点，在检测中与检测靶标物质17β-雌二醇能特异性结合，而不与其他物质发生特异性反应，该性能不仅可以屏蔽检测样品中其他非靶标物质的干扰，另一方面明显增强了17β-雌二醇检测的灵敏度，最终大大增强了样品中17β-雌二醇检测的准确性；同时，本发明检测方法基于上述核酸适配体的优势性能，与现有技术相比，在样品检测过程中无需通过对样品进行预处理从而达到避免干扰物质的目的，所以检测方法更加简单、便捷、节约成本。如图4所示，铜离子、镉离子、氨苄青霉素、氨基头孢烷酸、滴滴涕、己烯雌酚加入检测体系后，对整个检测体系中17β-雌二醇的检测不会造成决定性影响。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (9)

1.一种比色法检测17β-雌二醇的标准体系的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
步骤一、标准溶液和对照溶液的制备：向含有核酸适配体的缓冲液中加入17β-雌二醇溶液，配置浓度已知的17β-雌二醇浓度梯度溶液，混匀，孵育，得标准溶液；以含有核酸适配体的缓冲液中加入水为对照溶液；
步骤二、阳离子聚合物的加入：向上述标准溶液和对照溶液中加入阳离子聚合物溶液，混匀，孵育；
步骤三、纳米金溶液的加入：向上述加入阳离子聚合物后的标准溶液和对照溶液中加入纳米金溶液，混匀，孵育，即得比色法检测17β-雌二醇的标准体系。
2.根据权利要求1所述的比色法检测17β-雌二醇的标准体系的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述标准液含15个浓度梯度；所述浓度梯度的范围为1～600μM；所述孵育的条件为25℃、30分钟。
3.根据权利要求1所述的比色法检测17β-雌二醇的标准体系的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述阳离子聚合物包括聚二烯基丙二甲基氯化铵；所述孵育的条件为25℃、20分钟。
4.根据权利要求1所述的比色法检测17β-雌二醇的标准体系的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述纳米金溶液的制备方法包括：将10.5mL 1.0wt％柠檬酸三纳加入到100mL煮沸的0.03wt％氯金酸溶液中，不断加热搅拌至溶液由灰色变为酒红色，继续煮沸5分钟；停止加热并冷却到室温，0.2μm超滤膜过滤，即得纳米金溶液；所述孵育的条件为25℃、5分钟。
5.根据权利要求1所述的比色法检测17β-雌二醇的标准体系的制备方法，其特征在于，所述核酸适配体序列如SEQ ID No.1所示。
6.一种基于所述标准体系的比色法检测17β-雌二醇的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
绘制标准曲线：制备所述17β-雌二醇标准体系，记录其中标准溶液和对照溶液在650nm和520nm波长条件下的吸光度值，以标准溶液与对照溶液对应的相对吸光度的比值之差ΔA作图，绘制标准曲线；
17β-雌二醇样品检测：向含有核酸适配体的缓冲液中加入待测样品，混匀，孵育，同时以加入水的处理为对照溶液；加入阳离子聚合物溶液，混匀，孵育；加入纳米金溶液，混匀，孵育；
待测样品中17β-雌二醇含量的计算：根据样品测得的A650/A520与空白对照组的A650/A520的差值ΔA，对应标准曲线，即可求出待测样品中17β-雌二醇的浓度。
7.根据权利要求6所述的基于所述标准体系的比色法检测17β-雌二醇的方法，其特征在于，绘制标准曲线的步骤中，所述标准曲线的回归曲线方程为ΔA＝0.05438C17β- 雌二醇+0.25547。
8.根据权利要求6所述的基于所述标准体系的比色法检测17β-雌二醇的方法，其特征在于，17β-雌二醇样品检测的步骤中，所述加入阳离子聚合物溶液后的孵育条件为25℃、20分钟；所述加入纳米金溶液后的孵育条件为25℃、5分钟。
9.根据权利要求6所述的基于所述标准体系的比色法检测17β-雌二醇的方法，其特征在于，所述核酸适配体序列如SEQ ID No.1所示。
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