CN106366320A - 用于检测17β‑雌二醇的分子印迹聚合物试纸条及其制备方法 - Google Patents

用于检测17β‑雌二醇的分子印迹聚合物试纸条及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测17β‑雌二醇的分子印迹聚合物试纸条及其制备方法，试纸条上修饰有分子印迹聚合物，分子印迹聚合物上具有17β‑雌二醇的特异性结合位点。所述结合位点，既可以和酶标17β‑雌二醇特异性结合，也可以和17β‑雌二醇特异性结合，通过待测17β‑雌二醇和酶标17β‑雌二醇与结合位点的竞争性结合作用实现检测。本发明的分子印迹聚合物可以实现对目标模板分子的特异性结合。通过酶和底物的颜色反应起到信号放大的作用。本发明所述检测方法无需复杂的样品前处理过程，操作简单、价格低廉、可靠，可用于食品及临床中17β‑雌二醇的检测。

Description

用于检测17β-雌二醇的分子印迹聚合物试纸条及其制备方法
技术领域
本发明属于分子印迹技术领域，具体涉及一种用于检测17β-雌二醇的分子印迹聚合物试纸条及其制备方法与检测方法。
背景技术
雌二醇(estradiol，C18H24O2)是一种甾体雌激素，有α，β两种类型，17β-雌二醇(17β-estradiol，17β-E2)是环境类雌激素中活性最强的物质之一，由于17β-雌二醇存在明显的致癌性，欧美等国家已相继禁止或严格禁止使用，但17β-雌二醇具有促生长作用，目前在发展中国家普遍存在滥用现象，在动物性食品中残留几率大。另外，17β-雌二醇可通过生态系统中食物链在生物体中富集，造成一种长期的不利影响，对人类和大自然生物的健康造成严重威胁。目前检测雌激素的方法主要有仪器分析方法和快速检测方法，仪器分析方法主要有高效液相色谱法，气相色谱法，色谱-质谱联用技术。而这些方法在实际操作过程中需要对样品进行复杂的前处理，花费高，过程复杂，不适合用于实时现场的测定。快速检测方法主要是免疫学方法，包括酶联免疫吸附方法和试纸条方法，该方法由于抗原抗体的特异性结合具有高选择性，但由于抗体不易筛选，不易保存，易失效等缺点，比如中国专利《一种利用磁微粒化学发光免疫技术检测雌二醇的试剂盒》，申请号：200910091848.9，其公开了一种利用磁微粒化学发光免疫技术检测雌二醇的试剂盒。所以开发一种有效的快速检测方法十分必要。
发明内容
本发明针对上述现有技术，本发明提供一种用于检测17β-雌二醇的分子印迹聚合物试纸条及其制备方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
用于检测17β-雌二醇的分子印迹聚合物试纸条，该试纸条为包含分子印迹聚合物的尼龙膜，所述分子印迹聚合物具有用于特异性识别17β-雌二醇的结合位点；
所述分子印迹聚合物(Molecularly imprinted polymer，MIP)，是表面带有特异性结合位点的高聚物，当模板分子与功能单体和交联剂接触以后就产生了多种作用位点，再经过聚合作用就会将这种作用记录下来。当模板分子被洗掉，聚合物内部就会形成和模板分子的空间形状结构相同的，具有特异性结合位点的孔洞，这样的孔洞就会对模板分子有特异识别的特性。所述结合位点，既可以和酶标17β-雌二醇特异性结合，也可以和17β-雌二醇特异性结合，通过加入底物后显色程度可定性以及半定量分析17β-雌二醇含量。
制备有规则的分子印迹聚合物的模板分子、功能单体、交联剂、催化剂和溶剂等物质的添加比例，以及洗脱剂的种类和比例，对试纸条检测雌二醇的效果具有重大影响。本发明对功能单体、交联剂、催化剂、溶剂等物质作了筛选优化，得到应用在试纸条上检测效果较好的相关物质及其配比量。
所述分子印迹聚合物是通过模板分子、功能单体、交联剂、催化剂、溶剂混合通过加热反应聚合而成，具体是：所述分子印迹聚合物是以17β-雌二醇为模板分子，以3-氨丙基三乙氧基硅烷为功能单体(APTES)，加入四乙氧基硅烷交联剂(TEOS)、乙酸催化剂发生共聚反应制备得到的，所述17β-雌二醇：APTES：TEOS：乙酸：有机溶剂＝(0.05～0.5)g：(100～2000)μL:(100～2000)μL：(10～200)μL：(5～20)mL，其中乙酸的浓度为0.1mol/L。优选的，所述17β-雌二醇：APTES：TEOS：乙酸：有机溶剂＝(0.05～0.12)g：(900～1100)μL:(900～1000)μL：(80～110)μL：(11～20)mL。优选的，所述尼龙膜的孔径为0.45微米。经过大量实验验证与分析，当膜孔径为0.45微米时，尼龙膜与分子印迹聚合物结合的较牢固，从而使得17β-雌二醇检测效果更加准确。
尼龙膜是一种合成的长链聚酰胺薄膜，经过大量实验验证与分析，本发明选用的尼龙膜对特定分子印迹聚合物具有很强的特异性结合能力，而且在活化时尼龙膜不溶于乙醇，非特异性吸附较少。NC膜在活化时溶解成凝胶状，定性滤纸非特异性吸附比较强，不能实现对17β-雌二醇的检测。
优选的，所述包含分子印迹聚合物的尼龙膜的制备方法，包括以下步骤：
将尼龙膜浸于17β-雌二醇分子印迹聚合溶液中，在50～70℃加热1～3小时，使之发生聚合反应，洗涤，洗脱模板分子，干燥后即得。
优选的，采用60℃水浴加热1～3h。经过大量实验验证与分析，采用上述条件可高效制得分子印迹聚合物。
其中，所述洗涤和洗脱、干燥的具体过程为：对修饰有分子印迹聚合物的尼龙膜用乙醇彻底清洗来清除未反应的交联剂、功能单体、和粘附的分子印迹聚合物微粒；随后，用甲醇和乙酸的混合溶液(其中，甲醇体积分数为50％～90％)彻底清洗(洗脱三次)，最后用去离子水彻底清洗，获得的带有17β-雌二醇特定作用位点的分子印迹聚合物试纸条，将其置于气流中风干。
其中，所述17β-雌二醇分子印迹聚合溶液是以17β-雌二醇为模板分子，以3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)为功能单体，以四乙氧基硅烷(TEOS)为交联剂，以乙酸为催化剂溶于有机溶剂中，混匀，得到17β-雌二醇分子印迹聚合溶液。
优选的，所述17β-雌二醇：APTES：TEOS：乙酸：有机溶剂＝(0.05～0.5)g：(100～2000) μL:(100～2000)μL：(10～200)μL：(5～20)mL，其中乙酸的浓度为0.1mol/L。
其中，有机溶剂为乙腈或者四氢呋喃，优选乙腈。经过大量实验验证与分析，本发明得到最佳合成条件为：12mL乙腈为溶剂；模板分子，功能单体，交联剂的物质的量之比为1:12:12；100μL催化剂；洗脱条件为甲醇：乙酸＝9:1(v/v)时，本发明试纸条的检测效果最好。
本发明还提供一种用于检测17β-雌二醇的分子印迹聚合物试纸条的制备方法，包括以下步骤：
(1)17β-雌二醇的分子印迹聚合物溶液的制备：
以17β-雌二醇为模板分子，以3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)为功能单体，以四乙氧基硅烷(TEOS)为交联剂，以乙酸为催化剂溶于有机溶剂中，混匀，得到17β-雌二醇分子印迹聚合溶液，其中，所述17β-雌二醇：APTES：TEOS：乙酸：有机溶剂＝(0.05～0.5)g：(100～2000)μL:(100～2000)μL：(10～200)μL：(5～20)mL，其中乙酸的浓度为0.1mol/L。
(2)活化试纸条：制作试纸条的基底材料为带正电荷的尼龙膜，孔径0.45μm，活化方法为：3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷溶解于乙醇溶液中，然后将空白试纸条浸于已配好的溶液中温育，多余3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷用乙醇溶液漂洗来清除，随后，将处理过的试纸条干燥即可。
(3)将步骤(2)中已活化的试纸条浸于17β-雌二醇分子印迹聚合溶液中，在50～70℃加热1～3小时，使之发生聚合反应，洗涤，洗脱，干燥。
(4)封闭：采用牛血清白蛋白溶液封闭分子印迹聚合物试纸条，封闭后洗涤，干燥后即得。
步骤(1)中，有机溶剂为乙腈或者四氢呋喃，优选乙腈。
经过大量实验验证与分析，本发明得到最佳合成条件为：12mL乙腈为溶剂；模板分子，功能单体，交联剂的物质的量之比为1:12:12；100μL乙酸催化剂，本发明试纸条的检测效果最好。
步骤(2)中，为更加有效的活化试纸条，空白试纸条温育温度为室温(25～37℃)，时间为0.5～1.5小时。
优选的，所述3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷与乙醇溶液的添加比例为：50～150mg：5～150ml，所述乙醇溶液的质量分数为75～85％(优选80％)。
活化试纸条的好处是：采用3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷活化，在纸片表面覆盖一层碳碳双键，使得分子印迹聚合物更容易附着在试纸条上，从而使得检测效果更加 准确。
步骤(3)中，优选的，采用60℃水浴加热1～3h。
所述洗涤和洗脱、干燥的具体过程为：对修饰有分子印迹聚合物的尼龙膜用乙醇彻底清洗来清除未反应的交联剂、功能单体和粘附的分子印迹聚合物微粒；随后，用甲醇和乙酸的混合溶液(甲醇体积分数为50％～90％)彻底清洗，最后用去离子水彻底清洗，获得的带有17β-雌二醇特定作用位点的分子印迹聚合物试纸条，将其置于气流中风干。
优选的，洗脱条件为甲醇：乙酸＝9:1(v/v)时，本发明试纸条的检测效果最好。
步骤(4)中，牛血清白蛋白溶液的质量分数为1％，封闭后采用磷酸盐缓冲溶液和吐温溶液的混合溶液洗涤，优选所述混合溶液中磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/L，吐温的质量分数为0.06％。
本发明还提供一种上述试纸条的应用，用于检测待测样品中17β-雌二醇的定性和/或半定量检测。
本发明还提供一种含有上述试纸条的试剂盒，包括上述试纸条、浓度为1mg/L～2mg/L的辣根过氧化物酶(HRP)标记的17β-雌二醇(17β-雌二醇-HRP)、标准比色卡、冲洗液和显色液。
其中，17β-雌二醇-HRP的合成方法为：通过将17β-雌二醇连接羧基，通过羧基和氨基的缩合反应得到辣根过氧化物酶(HRP)标记的17β-雌二醇。具体为：
1)17β-雌二醇-3-羧甲基醚的合成：
0.1～1g 17β-雌二醇溶于1～10mL干燥的二甲基亚砜中，加入0.5～5g氢氧化钾粉末，0.1～1g溴乙酸，继续搅拌，反应1～2小时后加入冰水；乙酸乙脂萃取回收未反应的17β-雌二醇，水相用盐酸酸化，出现白色沉淀，过滤，沉淀物用水洗至中性，干燥。
2)17β-雌二醇-3-羧甲基醚与HRP的偶联：
①0.1～1g 17β-雌二醇3-羧甲基醚，0.1～1g N-羟基琥珀酰胺，0.1～1g二环乙基碳二亚胺，加入10～100mL二甲基亚砜，混匀，反应1～2h。
②1～10mg HRP溶于碳酸氢钠溶液，将①溶液慢慢滴入HRP溶液中，混匀反应1～2小时，维持pH 7.0左右。反应完全后，HRP溶液用0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液透析(4℃，2天)，得到17β-雌二醇-HRP。
其中，所述标准比色卡的制备方法，包括以下步骤：
在上述分子印迹聚合物试纸条上滴加17β-雌二醇-HRP溶液温育100～500秒，采用磷酸盐缓冲溶液和吐温溶液的混合溶液洗涤；干燥后滴加不同浓度的17β-雌二醇标准溶液(0～1μg/mL)到分子印迹聚合物试纸条上，温育100～500秒，随后用磷酸盐缓冲溶液和吐温溶液 的混合溶液洗涤，然后加入显色液显色，制备成为标准比色卡。
根据各试纸条的颜色，可制成5种浓度的标准比色卡，分别为0μg/L、0.1μg/L、0.25μg/L、0.5μg/L、1μg/L。
优选的，所述混合溶液中磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/L，吐温的质量分数为0.06％。
其中，所述冲洗液为磷酸盐缓冲溶液和吐温溶液的混合溶液，优选所述混合溶液中磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/L，吐温的质量分数为0.06％。
其中，所述显色液为底物A和底物B的混合溶液。底物A：将2.50gβ-环糊精、8.20g无水醋酸钠、150.0mg过氧化氢脲，加双蒸水充分混合定容至1000mL，用固体柠檬酸约3.1-3.2g调pH值至5.0，于4℃中保存，使用时需达到室温。底物B：将50mg 3,3′,5,5′-四甲基对二氨基联苯(TMB)和5mL二甲基亚砜(DMSO)充分混合，使用前室温避光保存。显色液包括：底物A和底物B提前混合15分钟后使用。
将本发明的试纸条制成试剂盒，共同出售，可使检测过程更加方便快捷，实现17β-雌二醇的快速检测。
本发明还提供一种采用上述试剂盒的检测17β-雌二醇的快速检测方法，包括以下步骤：
在所述的试纸条上滴加17β-雌二醇-HRP溶液温育100～500秒，采用冲洗液洗涤，干燥；然后将待测样品滴加到该试纸条上，温育100～500秒，温育后采用冲洗液洗涤，然后加入显色液显色，然后根据试纸条显示的颜色与标准比色卡对比，实现定性和/或半定量检测。
本发明的有益效果是：
(1)本发明的用于检测17β-雌二醇的分子印迹聚合物试纸条，试纸条上修饰有分子印迹聚合物，分子印迹聚合物上具有17β-雌二醇的特异性结合位点。所述结合位点，既可以和酶标17β-雌二醇特异性结合，也可以和17β-雌二醇特异性结合，通过待测17β-雌二醇和酶标17β-雌二醇与结合位点的竞争性结合作用实现检测。
(2)本发明采用特定分子印迹聚合物应用到试纸条上，可以实现对目标模板分子的特异性结合。通过酶和底物的颜色反应起到信号放大的作用。经过大量实验验证与分析，其他的分子印迹聚合物，检测效果不理想，不能实现定性和/或半定量检测。
(3)本发明利用分子印迹聚合物试纸条来检测17β-雌二醇，克服了现有技术中17β-雌二醇检测方法前处理复杂，时间长，成本高，抗体不易筛选、容易失效等缺点，可用于待测样品中的在线定性和/或半定量检测。
(4)本发明的17β-雌二醇分子印迹聚合物试纸条，适用于检测食品和临床样品中17β-雌二醇的快速定性和/或半定量检测，该试纸条检测17β-雌二醇快速、灵敏、简便、低廉、 可靠。检测限低达0.25μg/L，总分析时间在10分钟以内。
(5)本发明的试纸条和试剂盒制备方法简单、成本低、特异性强、操作简单、携带方便、不需要借助大型设备等，可以大规模投入生产。
(6)由于不采用抗体等物质，所以本发明的试纸条稳定性较好，室温储存可达180d。
(7)本发明的试纸条首先进行活化，使得分子印迹聚合物更容易附着在试纸条上，从而使得检测效果更加准确。经过大量实验验证与分析，不活化试纸条，检测效果不理想。
(8)将本发明的试纸条制成试剂盒，共同出售，可使检测过程更加方便快捷，实现17β-雌二醇的快速检测。
附图说明
图1是17β-雌二醇标准溶液颜色梯度(A)和在尿(B)、牛奶(C)中的样品检测图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
17β-雌二醇-HRP的合成
本实施例所用17β-雌二醇购自上海瑞永生物科技有限公司，HRP购于sigma-aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。
步骤如下：
(1)17β-雌二醇-3-羧甲基醚的合成：
300mg 17β-雌二醇溶于6mL干燥的二甲基亚砜中，加入1g氢氧化钾粉末，搅拌5分钟后加入300mg溴乙酸，继续搅拌，反应2小时后加入冰水；乙酸乙脂萃取回收未反应的17β-雌二醇，水相用2mol/L盐酸酸化，出现白色沉淀，漏斗过滤，沉淀物用去离子水洗至中性，0.08MPa真空干燥。
(2)17β-雌二醇-3-羧甲基醚与HRP的偶联：
①称取330mg 17β-雌二醇-CME，145mg N-羟基琥珀酰胺，260mg二环乙基碳二亚胺，加入50mL二甲基亚砜，搅拌2小时。
②4mg HRP溶于5mL碳酸氢钠溶液，将①溶液慢慢滴入HRP溶液中，轻轻搅拌2小时，维持pH 7.0左右。反应完全后，HRP溶液用0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液透析(4℃，2天)。
实施例2
17β-雌二醇-HRP的合成
步骤如下：
(1)17β-雌二醇-3-羧甲基醚的合成：
1g 17β-雌二醇溶于10mL干燥的二甲基亚砜中，加入5g氢氧化钾粉末，搅拌5分钟后加入1g溴乙酸，继续搅拌，反应2小时后加入冰水；乙酸乙脂萃取回收未反应的17β-雌二醇，水相用2mol/L盐酸酸化，出现白色沉淀，漏斗过滤，沉淀物用去离子水洗至中性，0.08MPa真空干燥。
(2)17β-雌二醇-3-羧甲基醚与HRP的偶联：
①称取1g 17β-雌二醇-CME，0.8g N-羟基琥珀酰胺，0.5g二环乙基碳二亚胺，加入80mL二甲基亚砜，搅拌2小时。
②8mg HRP溶于5mL碳酸氢钠溶液，将①溶液慢慢滴入HRP溶液中，轻轻搅拌2小时，维持pH 7.0左右。反应完全后，HRP溶液用0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液透析(4℃，2天)。
实施例3
分子印迹聚合物试纸条的合成：
本实施例所用纸片为INYC00010 Charged nylon带正电荷尼龙膜NY+购自Millipore Corporation(Billerica，USA)。
步骤如下：
(一)活化试纸条
100mg 3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷溶解于10mL乙醇溶液中，然后将空白试纸条浸于已配好的溶液中室温下温育1小时，多余硅烷可通过用乙醇溶液漂洗来清除，随后，将处理过的试纸条置于气流中吹干即可。
(二)试纸条上的分子印迹聚合物合成：
(1)聚合溶液包含0.1g 17β-雌二醇(模板分子)，1014μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES，功能单体)，963μL四乙氧基硅烷(TEOS，交联剂)，0.1mol/L乙酸(催化剂)溶于12mL乙腈溶液中，对该溶液进行5分钟的超声处理。
(2)将已活化的试纸条50片浸于聚合溶液，在60℃水浴加热2小时使发生聚合过程，对已获得的分子印迹聚合物试纸条用乙醇溶液彻底清洗来清除未反应的交联剂、功能单体和粘附的分子印迹聚合物微粒。随后，用甲醇和乙酸的混合溶液(甲醇的体积分数为90％)彻底清洗，用去离子水清洗之后，获得的带有17β-雌二醇识别位点的分子印迹聚合物试纸条，将其置于气流中风干。
(三)封闭的方法
2％牛血清白蛋白封闭分子印迹聚合物试纸条3分钟，封闭后用磷酸盐缓冲溶液和吐温 溶液的混合溶液洗涤，混合溶液中磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/L，吐温的质量分数为0.06％，洗涤3次，干燥后即可使用。
对合成条件中溶剂及模板分子、功能单体和交联剂的配比进行优化，详情见下表1和表2。
表1.溶剂的选择
表2模板分子、功能单体和交联剂合成聚合物的配比
经过大量实验验证与分析，使得本发明灵敏度，选择性，重现性，稳定性最好的聚合物MIP8，其合成条件为：12mL乙腈为溶剂；模板分子，功能单体，交联剂的物质的量之比为1:12:12；100μL乙酸催化剂；活化试纸条用量为50片，每片0.18mm，反应条件为：60℃水浴加热2小时。MIP7、MIP6、MIP5、MIP4相比于MIP8非特异性吸附较高，MIP8可完全消除非特异性吸附。
实施例4
一种含有上述试纸条的试剂盒，包括实施例3的试纸条、浓度为1mg/L～2mg/L的实施例1的辣根过氧化物酶(HRP)标记的17β-雌二醇(17β-雌二醇-HRP)、标准比色卡、冲洗液和显色液。
所述标准比色卡的制备方法，包括以下步骤：
在上述分子印迹聚合物试纸条上滴加17β-雌二醇-HRP溶液温育100～500秒，采用磷酸盐缓冲溶液和吐温溶液的混合溶液洗涤；干燥后滴加不同浓度的17β-雌二醇标准溶液(0～1μg/mL)到分子印迹聚合物试纸条上，温育100～500秒，随后用磷酸盐缓冲溶液和吐温溶液的混合溶液洗涤，然后加入显色液显色，制备成为标准比色卡。
根据各试纸条的颜色，可制成5种浓度的标准比色卡，分别为0μg/L、0.1μg/L、0.25μg/L、0.5μg/L、1μg/L。
所述混合溶液中磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/L，吐温的质量分数为0.06％。
所述冲洗液为磷酸盐缓冲溶液和吐温溶液的混合溶液，优选所述混合溶液中磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/L，吐温的质量分数为0.06％。
所述显色液为底物A和底物B的混合溶液，底物A：将2.50gβ-环糊精、8.20g无水醋酸钠、150.0mg过氧化氢脲，加双蒸水充分混合定容至1000mL，用固体柠檬酸约3.1-3.2g调pH值至5.0，于4℃中保存，使用时需达到室温。底物B：将50mg 3,3′,5,5′-四甲基对二氨基联苯(TMB)和5mL二甲基亚砜(DMSO)充分混合，使用前室温避光保存。
显色液包括：底物A和底物B提前混合15分钟后使用。.
实施例5
17β-雌二醇的检测
供试品溶液：尿和牛奶。
步骤如下：
在分子印迹聚合物试纸条上滴加30μL 17β-雌二醇-HRP溶液温育240秒，将试纸条用PBST溶液(含有0.06％吐温溶液的0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液)冲洗3次，干燥后滴加30μL不同浓度的17β-雌二醇标准溶液(0～1μg/mL)供试品溶液(空白、原液、以及配制0.1μg/L、0.25μg/L、0.5μg/L、1μg/L)到分子印迹聚合物试纸条上，温育240秒，随后用0.01mol/L磷酸缓冲溶液+0.06％吐温溶液彻底清洗3次，然后加入显色液显色。(显色液包括：底物A和底物B提前混合15分钟后使用)
由图1可见，当17β-雌二醇浓度为0.25μg/L时，能看到颜色相比对照组明显变浅，可得本发明的检测限为0.25μg/L。本方法总分析时间在10分钟以内，因此，这种快速、简便、低廉、可靠的检测方法有望用于食品和临床样品中17β-雌二醇的检测，从而有助于对样品的定性及半定量测定。
结果：由于牛奶试纸条显色包含在标准比色卡颜色变化范围内，说明此牛奶含有17β-雌二醇，实现了雌二醇的定性检测。经与标准比色卡比对，如图1所示，由于试纸条颜色与左起第四个颜色相近，因此判定牛奶供试品溶液中17β-雌二醇的含量与标准比色卡第左起第三个颜色代表的含量相近，即牛奶供试品中大约含有0.25μg/L的17β-雌二醇，实现了雌二醇的半定量检测。将此牛奶供试品采用传统的方法定量测量，得到的结果与试纸条测得的结果相一致。
而尿的试纸条显色没有在标准卡颜色变化范围内，说明不含有17β-雌二醇或者含量低于0.25μg/L。将此尿供试品采用传统的方法定量测量，得到的结果与试纸条测得的结果相一致。
实施例6
稳定性试验：
将实施例4中的试剂盒的试纸条和各个试剂在4℃和37℃放置5d、15d、30d、45d、60d后进行使用，使用结果表明，实施例4的试剂盒指标均在正常范围内，不同条件对使用结果均没有明显影响，说明在试剂盒的稳定性非常好，室温下可以保存半年，由此说明含有分子印迹聚合物的试纸条的稳定性非常好。
实验例7
特异性实验
选取与17β-雌二醇结构上相似的四种雌激素类物质，分别是雌酮(Estrone，E1)，雌三醇(Estriol，E3)，孕酮(Progesterone，P4)和炔雌醇(Ethinylestradiol，EE)。结果表明，雌酮，雌三醇，孕酮和炔雌醇并不能够对试纸条上事先包被上的17β-E2-HRP产生竞争反应，17β-雌二醇可对试纸条上的17β-E2-HRP产生竞争，说明含有分子印迹聚合物的试纸条具有良好的特异性。
对比例1
对比功能单体APTES，甲基丙烯酸甲酯(MMA)，4-乙烯基吡啶(4-VP)，丙烯酰胺(AM)，甲基丙烯酰胺(MA)，a-甲基丙烯酸(MAA)和交联剂TEOS，二羟甲基丙烷，二甲基丙烯酸酯发现，当功能单体为APTES，交联剂为TEOS时，合成的分子印迹聚合物试纸条最稳定，非特异性吸附可完全消除，检测灵敏度最高，其他的功能单体和交联剂合成的试纸条效果并不理想。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需 要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.用于检测17β-雌二醇的分子印迹聚合物试纸条，其特征是：该试纸条为包含分子印迹聚合物的尼龙膜，所述分子印迹聚合物具有用于特异性识别17β-雌二醇的结合位点，所述分子印迹聚合物是以17β-雌二醇为模板分子，以3-氨丙基三乙氧基硅烷为功能单体，加入四乙氧基硅烷交联剂、乙酸催化剂发生共聚反应制备得到的，其中，所述17β-雌二醇：APTES：TEOS：乙酸：有机溶剂＝(0.05～0.5)g：(100～2000)μL:(100～2000)μL：(10～200)μL：(5～20)mL。
2.如权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述尼龙膜的孔径为0.45微米；
所述包含分子印迹聚合物的尼龙膜的制备方法，包括以下步骤：将尼龙膜浸于17β-雌二醇分子印迹聚合溶液中，在50～70℃加热1～3小时，使之发生聚合反应，洗涤，洗脱模板分子，干燥后即得；
其中，所述17β-雌二醇分子印迹聚合溶液是以17β-雌二醇为模板分子，以3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)为功能单体，以四乙氧基硅烷(TEOS)为交联剂，以乙酸为催化剂溶于有机溶剂中，混匀，得到17β-雌二醇分子印迹聚合溶液；优选的，所述有机溶剂为乙腈；优选的，所述17β-雌二醇：APTES：TEOS：乙酸：有机溶剂＝(0.05～0.12)g：(900～1100)μL:(900～1000)μL：(80～110)μL：(11～20)mL。
3.一种用于检测17β-雌二醇的分子印迹聚合物试纸条制备方法，其特征是：
(1)17β-雌二醇的分子印迹聚合物溶液的制备：
以17β-雌二醇为模板分子，以3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)为功能单体，以四乙氧基硅烷(TEOS)为交联剂，以乙酸为催化剂溶于有机溶剂中，混匀，得到17β-雌二醇分子印迹聚合溶液，其中，所述17β-雌二醇：APTES：TEOS：乙酸：有机溶剂＝(0.05～0.5)g：(100～2000)μL:(100～2000)μL：(10～200)μL：(5～20)mL；
(2)活化试纸条：所述空白试纸条的材料为尼龙膜，3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷溶解于乙醇溶液中，然后将空白试纸条浸于已配好的溶液中温育，清除多余3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，然后将处理过的试纸条干燥即可；
(3)将步骤(2)中已活化的试纸条浸于17β-雌二醇分子印迹聚合溶液中，在50～70℃加热1～3小时，使之发生聚合反应，洗涤，洗脱，干燥；
(4)封闭：采用牛血清白蛋白溶液封闭步骤(3)中的试纸条，封闭后洗涤，干燥后即得。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征是：步骤(1)中，17β-雌二醇、APTES和TEOS的物质的量比为1:12:12，乙酸的添加量为100μL，所述有机溶剂为乙腈，其添加量为12ml。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征是：步骤(2)中，空白试纸条温育温度为室温，时间为0.5～1.5小时。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征是：采用60℃水浴加热1～3h；优选的，所述洗涤和洗脱、干燥的具体过程为：对修饰有分子印迹聚合物的尼龙膜用乙醇彻底清洗来清除未反应的交联剂、功能单体和粘附的分子印迹聚合物微粒；随后，用甲醇和乙酸的混合溶液彻底清洗，最后用去离子水彻底清洗，获得的带有17β-雌二醇特定作用位点的分子印迹聚合物试纸条，将其置于气流中风干；其中混合溶液中甲醇的体积分数为50％～90％。
7.权利要求1或2所述试纸条的应用，其特征是：用于检测待测样品中17β-雌二醇的定性和/或半定量检测。
8.一种含有权利要求1或2所述试纸条的试剂盒，其特征是：包括权利要求1或2所述的试纸条、浓度为1mg/L～2mg/L的辣根过氧化物酶(HRP)标记的17β-雌二醇、标准比色卡、冲洗液和显色液。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征是，17β-雌二醇-HRP的合成方法为：通过将17β-雌二醇连接羧基，通过羧基和氨基的缩合反应得到辣根过氧化物酶(HRP)标记的17β-雌二醇。
10.一种采用权利要求8试剂盒的17β-雌二醇快速检测方法，其特征是：在权利要求1或2所述的试纸条上滴加17β-雌二醇-HRP溶液温育100～500秒，采用冲洗液洗涤，干燥；然后将待测样品滴加到该试纸条上，温育100～500秒，温育后采用冲洗液洗涤，然后加入显色液显色，然后根据试纸条显示的颜色与标准比色卡对比，实现定性和/或半定量检测。
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