CN107167443B - 一种利用紫外光谱仪检测pcb77的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用紫外光谱仪检测PCB77的方法，包括一个制备功能核酸适配体母液的步骤，一个建立已知PCB77浓度的检测体系的步骤；分别取1000μL的标准溶液和空白对照液，置于石英荧光比色皿中，利用紫外光谱仪测定520nm和650nm处的波长，PCB77和空白对照液的吸光度分别为A＝A650/A520和A0＝A650/A520，计算增强的吸光度ΔA＝A‑A0；以不同浓度PCB77与对应增强吸光度ΔA作图，绘制标准曲线；制备样品检测体系，按上述方法测定吸光度比值并计算ΔA；根据计算所得的ΔA值，查标准曲线，可以求得样品中PCB77含量。本方法的方法灵敏度高、特异性好。
Description
技术领域
本发明属于化工领域，涉及检测水样中PCB77的方法，具体来说是一种利用紫外光谱仪检测PCB77的方法。
背景技术
多氯联苯是一类具有209种同系物的持久性有机污染物。20世纪以来，由于人类的不正当使用，多氯联苯的污染越来越严重，威胁着人类的健康。
近年来，很多研究结果发现多氯联苯具有三致作用(致癌性、致突变性、致死)，并且在自然界中很难降解。多氯联苯能够在生物体残留蓄积，最终可以通过食物链在人体内富集，即便少量的多氯联苯，也会对生物体产生危害。PCB77(3，3′，4，4′-四氯联苯)是一种典型的多氯联苯同系物，具有较强的毒性。目前，针对多氯联苯的检测多为传统色谱学检测法，比如液质连用、气质联用等，虽然具有较高的精确度和准确度，但是这些方法操作时间较长、必须使用大型仪器，而且耗材昂贵。免疫检测法对多氯联苯的检测具有较强的特异性和较低的检测限，但是，抗体的制备较为复杂，并且不易保存，有些情况下，检测结果会出现假阳性，从而导致实验的失败。因此，我们需要开发一种简单、快速的检测体系实现对PCB77的实时检测。
核酸适配体是一类具有特定生物功能的核酸分子序列，一般是一段DNA或者RNA，通过技术SELEX(指数富集配体的系统进化技术)筛选而来，它能特异性识别和结合靶物质。近年来核酸适配体已被广泛应用于检测领域，并实现了对蛋白质、金属离子以及小分子等进行定量检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用紫外光谱仪检测PCB77的方法，所述的这种利用紫外光谱仪检测PCB77的方法要解决现有技术中采用色谱学方法和免疫学方法检测多氯联苯的过程操作复杂、周期较长和假阳性的技术问题。
本发明提供了一种利用紫外光谱仪检测PCB77的方法，包括以下步骤：
1)一个制备功能核酸适配体母液的步骤，所述的功能核酸适配体的核苷酸序列为：5'-GGCGG GGCTA CGAAG TAGTG ATTTT TTCCG ATGGC CCGTG-3'，所述的功能核酸适配体母液的浓度为2μmol/L；
2)一个建立已知PCB77浓度的检测体系的步骤，取12支离心管，分别加入25μL2μmol/L的核酸适配体，加入浓度为10ppm不同体积的PCB77溶液，充分混匀后将离心管置于25℃条件下孵育20～30分钟，在反应液中加入200μL纳米金溶液，充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育20～30分钟，在上述混合液中加入50μL、2mol/L的氯化钠溶液，最后用丙磺酸缓冲液定容，使得检测体系溶液总体积达到1000μL，留作以下测定用；
3)另取1支离心管将PCB77溶液用超纯水替代，按照上述步骤(1)的方法处理后作为空白对照体系溶液；
4)分别取1000μL步骤(1)和步骤(2)制备的标准溶液和空白对照液，置于石英荧光比色皿中，用紫外光谱仪进行扫描测定信号，扫描波长范围为450nm到700nm，并且得到520nm和650nm处的波长吸光度，PCB77和空白对照液的吸光度分别为A＝A650/A520和A0＝A650/A520，计算增强的吸光度ΔA＝A-A0；
5)以不同浓度PCB77(C)与对应增强吸光度ΔA作图，绘制标准曲线；
6)制备样品检测体系：取10μL待测样品，按照步骤1)的方法制备检测体系离心管，按步骤4)方法测定吸光度比值并计算ΔA；
7)根据计算所得的ΔA值，查标准曲线，可以求得样品中PCB77含量。
进一步的，所述的纳米金溶液通过以下方法制备：在100mL煮沸的质量百分比浓度为0.01％的氯金酸溶液中，加入3.5mL质量百分比浓度为1％的柠檬酸三钠溶液，搅拌20～40分钟，移除加热装置后继续搅拌混合物5～15分钟，最后，使溶液达到室温并且使用0.2μm超滤膜过滤，然后储存在恒温为4℃的棕色玻璃瓶中备用。
进一步的，上述步骤2)中，检测体系中核酸适配体的最终浓度为50nmol/L，检测体系中氯化钠的最终浓度为100mmol/L。
进一步的，所述的丙磺酸缓冲液的浓度为10mM，PH＝10。
进一步的，在步骤4)中，利用紫外光谱仪测定520nm和650nm处的波长。
纳米金是一种传到信号的优良材料，分散时呈红色，聚集时呈蓝色，本方法基于适配体和纳米金，利用紫外光谱仪建立了一种比色传感检测体系，实现了PCB77的定量检测。
本发明所述实验方法的原理在于：当反应体系中存在靶物质PCB77时，核酸适配体则跟PCB77特异性结合形成复合物，加入纳米金溶液，则纳米金处于分散状态，再加入氯化钠溶液，纳米金则产生聚集，溶液颜色呈蓝色；当反应体系中不存在PCB77时，核酸适配体则跟加入的纳米金溶液静电结合，加入的氯化钠溶液不能使纳米金产生聚集，溶液呈红色。使用紫外光谱仪测定溶液的吸光度，本方法通过反应体系吸光度的变化与PCB77在不同浓度下的线性关系来实现对PCB77的定量检测。
本发明和已有技术相比，其技术进步是积极和明显的。本发明提供了一种操作简单、灵敏度高、成本低且高效的PCB77的检测方法。本发明的检测方法操作简单、成本低、检测灵敏度高，特异性好，操作简便快捷且不依赖大型仪器设备，可用于水溶液中PCB77的定量检测。采用本发明的方法测定水样中PCB77的浓度范围为0-1500ppb，线性区间为0-200ppb，线性拟合直线方程y＝1.08×10-4x+1.21×10-3，最低检测限为10.1ppb。
附图说明
图1显示了本发明的原理示意图。
图2显示了实施例中氯化钠浓度优化示意图。
图3显示了实施例中适配体浓度优化示意图。
图4显示了靶物质以及干扰物加入检测体系后增强的吸光度比值示意图。
图5显示了实施例中不同浓度的PCB77与增强的吸光度比值关系示意图。
具体实施方式
以下将结合附图1-5对本发明的技术方案进行详细说明。
本发明下述所提供的实施例是为了进一步描述并证明本发明的实施例，这些实施例不应当解释为对本发明保护范围的限定。
实施例1
氯化钠浓度优化
在1.5mL离心管中加入200μL纳米金溶液，再分别加入(800，790，780，770，760，750，740，730)μL的丙磺酸缓冲液(浓度为10mmol/L、PH为7.0)，混匀，依次加入浓度为0，20，40，60，80，100，120，140mmol/L的氯化钠溶液，使得体系总体积达到1000μL，然后取1000μL反应液于石英比色皿中，利用紫外光谱仪测定520nm和650nm处的吸光度，计算比值A＝A650/A520(空白组为A0)，计算差值△A＝A-A0绘制曲线，峰值最高对应的氯化钠浓度为100mmol/L，如图2所示。
实施例2
核酸适配体浓度优化
将收到的核酸适配体样品配制成2μmol/L的母液，然后分别设置八组浓度(0，10，20，30，40，50，60，70nmol/L)适配体，每组中加入200μL纳米金溶液和(750,745,740,735,730,725,720,715)μL的丙磺酸缓冲液，充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育20min，加入实施例1中优化好的氯化钠溶液，混匀，使得检测体系溶液总体积达到1000μL，利用紫外光谱仪测定520nm和650nm处的吸光度，计算比值A＝A650/A520(空白组为A0)，计算差值△A＝A-A0，绘制曲线，峰值最高处对应的适配体浓度为50nmol/L，如图3。
上述核酸适配体的核苷酸序列为：5'-GGCGG GGCTA CGAAG TAGTG ATTTTTTCCGATGGC CCGTG-3'，购于上海生工。
实施例3
特异性实验
取5支分别加入25μL，2μmol/L适配体的离心管，设置空白组，其余四组分别加入100μL，10ppm的PCB77(3，3′，4，4′-四氯联苯)、PCB28(2，4，4′-三氯联苯)、PCB52(2，2′，5，5′-四氯联苯)、PCB118(2，3′，4，4′，5-五氯联苯)溶液，充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育20min，在上述混合液中加入200μL纳米金溶液和630μL的丙磺酸缓冲液，充分混匀置于25℃条件下孵育20min，在上述混合液中加入50μL、2mol/L氯化钠溶液，使得检测体系溶液总体积达到1000μL，分别取上述反应液1000μL于石英比色皿中，利用紫外光谱仪测定520nm和650nm处的吸光度，计算比值A＝A650/A520(空白组为A0)，计算差值△A＝A-A0，绘制柱状图，如图4所示，PCB77具有较好的特异性。
实施例4
灵敏度实验
本实施例提供一种利用紫外光谱仪检测PCB77(3，3′，4，4′-四氯联苯)的方法(如图5所示)，具体包括如下步骤：
(1)建立已知PCB77浓度的检测体系的步骤，取12支分别加入25μL，2μmol/L核酸适配体的离心管，加入浓度为10ppm不同体积的PCB77溶液，充分混匀后将离心管置于25℃条件下孵育20分钟，在反应液中加入200μL纳米金溶液和相应体积(475～625μL)的丙磺酸缓冲液，充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育20分钟，在上述混合液中加入50μL、2mol/L的氯化钠溶液，使得检测体系溶液总体积达到1000μL，留作以下测定用；
(2)另取1支离心管将PCB77溶液用超纯水替代，按照上述步骤(1)的方法处理后作为空白对照体系溶液；
(3)分别取1000μL步骤(1)和步骤(2)制备的标准溶液和空白对照液，置于石英荧光比色皿中，用紫外光谱仪进行扫描测定信号，扫描波长范围为450nm到700nm，并且得到520nm和650nm处的波长吸光度，PCB77和空白对照液的吸光度分别为A＝A650/A520和A0＝A650/A520，计算增强的吸光度ΔA＝A-A0；
(4)以不同浓度PCB77(C)与对应增强吸光度ΔA作图，绘制标准曲线；
(5)制备样品检测体系：取10μL待测样品，加入到步骤(1)方法制备的检测体系离心管中，充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育20min后，在混合液中加入50μL、2mol/L的氯化钠溶液，混匀，使检测体系总体积达到1000μL，按步骤(3)方法测定吸光度比值并计算ΔA。
(6)根据计算所得的ΔA值，查标准曲线，可以求得样品中PCB77含量。
(7)验证：用本发明方法测定含PCB77浓度分别为100ppb、500ppb和1000ppb的水样各一份，得到的平均回收率分别为104.6％，87.0％和111.4％，从而证明了本方法的可靠性。
(8)采用本发明的方法测定水样中PCB77的浓度范围为0-1500ppb，线性区间为0-200ppb，线性拟合直线方程为y＝1.08×10-4x+1.21×10-3，最低检测限为10.1ppb。
序列表
<110> 上海市环境科学研究院
<120> 一种利用紫外光谱仪检测PCB77的方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 功能核酸适配体
<400> 1
ggcggggcta cgaagtagtg attttttccg atggcccgtg 40
Claims (3)
1.一种利用紫外光谱仪检测PCB77的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)一个制备功能核酸适配体母液的步骤，所述的功能核酸适配体的核苷酸序列为：
5'-GGCGG GGCTA CGAAG TAGTG ATTTT TTCCG ATGGC CCGTG-3'，所述的功能核酸适配体母液的浓度为2μmol/L；
2)一个建立已知PCB77浓度的检测体系的步骤，取10支以上离心管，分别加入25μL 2μmol/L的核酸适配体，加入浓度为10ppm不同体积的PCB77溶液，充分混匀后将离心管置于25℃条件下孵育20～30分钟，在反应液中加入200μL纳米金溶液，充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育20～30分钟，在上述混合液中加入50μL、2mol/L的氯化钠溶液，最后用丙磺酸缓冲液定容，使得检测体系溶液总体积达到1000μL，留作以下测定用；
3)另取1支离心管将PCB77溶液用超纯水替代，按照上述步骤(1)的方法处理后作为空白对照体系溶液；
4)分别取1000μL在步骤(1)和步骤(2)中制备的标准溶液和空白对照液，置于石英荧光比色皿中，用紫外光谱仪进行扫描测定信号，扫描波长范围为450nm到700nm，并且得到520nm和650nm处的波长吸光度，PCB77和空白对照液的吸光度分别为A＝A650/A520和A0＝A650/A520，计算增强的吸光度ΔA＝A-A0；
5)以不同浓度PCB77与对应增强吸光度ΔA作图，绘制标准曲线；
6)制备样品检测体系：取10μL待测样品，按照步骤1)的方法制备检测体系离心管，按步骤4)方法测定吸光度比值并计算ΔA；
7)根据计算所得的ΔA值，查标准曲线，可以求得样品中PCB77含量。
2.根据权利要求1所述的一种利用紫外光谱仪检测PCB77的方法，其特征在于：所述的纳米金溶液通过以下方法制备：在100mL煮沸的质量百分比浓度为0.01％的氯金酸溶液中，加入3.5mL质量百分比浓度为1％的柠檬酸三钠溶液，搅拌20～40分钟，移除加热装置后继续搅拌混合物5～15分钟，最后，使溶液达到室温并且使用0.2μm超滤膜过滤，然后储存在恒温为4℃的棕色玻璃瓶中备用。
3.根据权利要求1所述的一种利用紫外光谱仪检测PCB77的方法，其特征在于，上述步骤2)中，检测体系中核酸适配体的最终浓度为50nmol/L，检测体系中氯化钠的最终浓度为100mmol/L。
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