CN109444101B - 比例型核酸适配体荧光探针及其检测赭曲霉毒素a的方法 - Google Patents

比例型核酸适配体荧光探针及其检测赭曲霉毒素a的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用带标记的核酸适配体和核酸四链体染料构建的荧光比例探针，所述核酸适配体可特异性识别赭曲霉毒素A，即OTA核酸适配体，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所示。本发明所述赭曲霉毒素A检测方法如下：（1）制备OTA核酸适配体‑硫黄素T混合反应溶液，即比例型核酸适配体荧光探针溶液；（2）建立定量检测赭曲霉毒素A的标准曲线；（3）实际样品所含赭曲霉毒素A的检测。使用本发明所述的荧光比例探针进行赭曲霉毒素A检测的方法，可以抵抗其他核酸或杂质的干扰，降低传统方法检测一次荧光信号带来的实验误差，过程可控，操作简单，并且灵敏度高，检测限仅为0.38 ng/mL，同时本方法在均相溶液环境中便可进行荧光检测，不需要洗脱分离，在临场快速检测中具有较大的应用潜力和推广价值。

Description

比例型核酸适配体荧光探针及其检测赭曲霉毒素A的方法
技术领域
本发明属于赭曲霉毒素A检测领域，涉及一种比例型核酸适配体荧光探针，包括可特异性识别赭曲霉毒素A并带荧光显色基团标记的核酸适配体和核酸四链体染料硫黄素T，并利用该探针快速均相检测赭曲霉毒素A的方法。
背景技术
赭曲霉毒素A（Ochratoxin A）是某些曲霉菌属或青霉菌属产生的代谢产物，是一种真菌毒素，在自然界中广泛分布，毒性很强，经常污染谷类、豆制品、咖啡和葡萄酒等农产品或食品。早在1993年，国际癌症研究机构就把赭曲霉毒素A列为人类致癌物。目前赭曲霉毒素A的检测手段主要以色谱法（如高效液相色谱法，薄层色谱法等）和基于抗体作用的酶联免疫吸附法（ELISA）为主，这些方法或需要大型的仪器设备及复杂的前处理过程，或需要较高的成本，并且抗体的制备和保存都比较困难。发展对于食品中真菌毒素的快速、低成本、操作过程简单的临场检测是我国食品安全问题中的热点问题，是目前我国亟需解决的技术领域。
核酸适配体（Aptamer）最早在1990年被提出，近年来逐渐发展成为一种新型的生物传感器，其本质是一段可与靶分子特异性结合的单链DNA或者RNA，与靶标产生类似于抗原-抗体的识别过程。由于核酸适配体具有结构响应性、高稳定性、高特异性、易修饰、低成本等特点，使其逐渐成为抗体的替代品，目前已初步应用于食品危害因子的检测中，但是部分利用核酸适配体检测赭曲霉毒素A的方法较复杂。因此可依赖核酸适配体构建一些快速、操作简单的赭曲霉毒素A检测方法，并且通过比例型探针设计，提高检测方法对环境的干扰能力，进而增加方法的准确性和稳定性，适应于食品领域的临场检测，具有极大的应用价值和发展潜力。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种比例型核酸适配体荧光探针，由可特异性识别赭曲霉毒素A并在5’端标记荧光显色基团的核酸适配体和核酸四链体染料硫黄素T组成，并利用该探针检测赭曲霉毒素A的方法。
本发明中的核酸适配体可特异性识别赭曲霉毒素A，其核苷酸序列为序列表中SEQID NO：1所示，简称“OTA核酸适配体”。
进一步的，所述荧光显色基团为FITC、TET、JOE、HEX、Alexa Fluor 488。
进一步的，所述的比例型核酸适配体荧光探针的制备方法包含以下步骤：
将可特异性识别赭曲霉毒素A并在5’端标记荧光显色基团的核酸适配体（即OTA核酸适配体）、核酸四链体染料硫黄素T溶解在结合缓冲溶液中并混合均匀，再置于低温（4℃）静止保存，得到比例型核酸适配体荧光探针。
进一步的，所述核酸适配体与硫黄素T的摩尔浓度比为1:20~60。
进一步的，所述结合缓冲溶液成分为20~40 mM Tris、8~10 mM镁盐离子、50~70 mM钾盐离子和1 mM DTT。
本发明所制得的比例型核酸适配体荧光探针可以应用于赭曲霉毒素A的简便检测。
本发明所述赭曲霉毒素A的简便检测方法，步骤如下：
（1）制备OTA核酸适配体-核酸四链体染料硫黄素T混合反应溶液，即比例型核酸适配体荧光探针溶液：
将一定量的带荧光显色基团标记的OTA核酸适配体，硫黄素T，溶解结合缓冲溶液中并混合均匀，结合缓冲溶液成分为20~40 mM Tris、8~10 mM镁盐离子、50~70 mM钾盐离子和1 mM DTT，然后在低温下静置保存，在硫黄素T的诱导下，OTA核酸适配体可在短时间形成G-四链体结构并使得硫黄素T嵌入其中产生较强荧光；反应体系中，硫黄素T的摩尔浓度与OTA核酸适配体的摩尔浓度比可为20~60:1；
（2）建立定量检测赭曲霉毒素A的标准曲线
配制一系列不同浓度赭曲霉毒素A标准品溶液，然后将一定量不同浓度赭曲霉毒死A标准品溶液分别与一定量步骤（1）制备完成的荧光比例探针溶液混合均匀，于室温静置3反应20~60 min，加入的赭曲霉毒素A可与OTA核酸适配体反应，置换出嵌入其中的硫黄素T，使得荧光信号减弱，然后进行两次荧光检测，激发波长分别设置为ThT最适激发波长425nm和标记的荧光显色基团最适激发波长485~495nm处，并根据两次荧光检测信号的比值（485ex/425ex）建立以赭曲霉毒素A浓度为横坐标、比值为纵坐标的标准曲线；
（3）实际样品所含赭曲霉毒素A的检测
将待测实际样品进行前处理后得到待测样，然后将待测液与一定量步骤（1）制备的荧光比例探针溶液混合均匀，于室温静置20~60min，进行赭曲霉毒素A的识别过程，然后进行两次荧光检测，激发波长分别为ThT激发波长425nm和标记的荧光显色基团激发波长485~495nm处，将测得的两次信号比值（485ex/425ex）带入步骤（2）所建立标准曲线的方程，即可计算出实际物质所含赭曲霉毒素A的浓度。
本发明所述赭曲霉毒素A检测方法，其检测原理如图1所示，硫黄素T的加入可以诱导OTA核酸适配体形成G-4链体结构，从而包裹住硫黄素T，嵌入其中的硫黄素T会产生一个较强的荧光信号，并且由于发生荧光共振能量转移（FRET），硫黄素T原有的荧光会转移到FAM的峰上（522nm处,如图3），当加入赭曲霉毒素A后，赭曲霉毒素A会和核酸适配体发生特异性结合，从而改变原有结构，使得荧光信号下降（如图3），荧光信号的变化和赭曲霉毒素A的浓度变化存在一定的线性关系；同时我们在OTA核酸适配体的一端标记上荧光显色基团，荧光显色基团的信号在赭曲霉毒素A存在或不存在的情况下都比较稳定（如图4），通过该显色基团的信号除以硫黄素T荧光信号的变化，构建荧光比例探针，建立以两个荧光信号比例为纵坐标，赭曲霉毒素A浓度为横坐标的标准曲线，即可完成检测，该比例探针可以排除特异性干扰，同时减少单个荧光信号波动带来的误差。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
1、本发明提供了一种检测赭曲霉毒素A的比例型荧光探针，该比例型荧光探针与传统的基于核酸四链体染料的荧光探针相比，具有抗特异性干扰能力强，信号稳定等优点，并且能降低直接检测一次荧光信号带来的实验误差。
2、本发明所述赭曲霉毒素A的检测方法不需酶的参与，过程可控，灵敏度较高，检测限达到了0.38 ng/mL。
3、本发明所述赭曲霉毒素A的检测方法不需要复杂昂贵的仪器，整个实验方法操作简单，样品前处理容易，并且检测速度快，只需十分钟即可完成赭曲霉毒素A的识别过程，在临场检测中具有很大的应用潜力。
4、本发明所述赭曲霉毒素A的检测方法所用试剂，对操作者和环境基本无污染，有利于环境保护。
附图说明
图1是本发明所述赭曲霉毒素A检测方法的原理图，图中，OTA为赭曲霉毒素A，ThT为硫黄素T，FAM为荧光显色基团。
图2是赭曲霉毒素A浓度与不同激发波长下荧光信号之比的标准曲线。
图3是加或不加赭曲霉毒素A时，在ThT最适激发波长425nm处激发的荧光光谱图，不加赭曲霉毒素A的样品展现出较高荧光强度，加了赭曲霉毒素A以后荧光强度降低。
图4是加或不加赭曲霉毒素A时，在FAM最适激发波长485nm处激发的荧光光谱图，其FAM的荧光信号在加或不加赭曲霉毒素A时都较稳定。
具体实施方式
下面通过实施例并结合附图对本发明所述一种利用带标记的核酸适配体和硫黄素T构建的荧光比例探针和赭曲霉毒素A检测方法作进一步说明。
下述实施例中，赭曲霉毒素A购自普瑞邦生物工程有限公司；硫黄素T购自北京鼎国昌盛有限公司；甲醇购自成都市科隆化学品有限公司；全功能微孔板检测仪型号为SynergH1，由美国佰腾仪器公司生产。超纯水是指电阻率达到18 MΩ*cm（25℃）的水，用美国Millipore公司Milli-Q超纯水仪制备。
下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1：制备荧光比例探针溶液
在洁净反应管中加入35 μL结合缓冲溶液(成分为20~40 mM Tris、8~10 mM镁盐离子、50~70 mM钾盐离子和1 mM DTT)、35 μL 浓度为10 μM的OTA核酸适配体（从现有技术中获得）、35 μL 浓度为300 μM的ThT溶液、225 μL超纯水，共计330 μL，混匀后将其在低温（4℃）下储存备用。
实施例2：建立赭曲霉毒素A浓度与荧光比例信号的标准曲线
本实施例的步骤依次如下：
（1）取八只洁净的一次性，分别加入超纯水和赭曲霉毒素A配制六种不同浓度的赭曲霉毒素A标准品溶液各2 μL，赭曲霉毒素A标准品溶液的浓度分别为0 ng/mL、5 ng/mL、40ng/mL、70 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、300 ng/mL、700 ng/mL；
（2）向八只试管中分别加入33 μL实施例1制备的荧光比例探针溶液并混合均匀，然后在室温下静置10 min；
（3）用全功能微孔板检测仪连续进行两次荧光检测，荧光检测的激发波长分别为425 nm和485 nm，发射波长范围分别为470~650 nm和515~650 nm，根据两次荧光检测信号相除的比例结果建立以赭曲霉毒素A浓度为横坐标、两次荧光信号之比为纵坐标的标准曲线，如图2所示，所述标准曲线的方程为y= 0.0031x+2.3647，R2=0.996，式中，x为赭曲霉毒素A浓度，y为荧光强度。
实施例3：咖啡中所含赭曲霉毒素A的检测
本实施例的步骤依次如下：
（1）取三只洁净离心管，分别加入咖啡和不同浓度的赭曲霉毒素A并稀释20倍，加入量以三个测试样品中赭曲霉毒素A的终浓度分别为200 ng/mL、300 ng/mL、400 ng/mL计量，将赭曲霉毒素A终浓度为200 ng/mL的测试样品命名为l号测试样品，将赭曲霉毒素A终浓度为300 ng/mL测试样品命名为2号测试样品，将赭曲霉毒素A终浓度为400 ng/mL测试样品命名为3号测试样品；
（2）取三只洁净离心管，向三只洁净离心管中分别加入2 μL赭曲霉毒素A终浓度为200 ng/mL、300 ng/mL、400 ng/mL的测试样品和33 μL实施例1制备的荧光比例探针溶液并混合均匀，然后在室温下静置10 min；
（3）用全功能微孔板检测仪连续进行两次荧光检测，荧光检测的激发波长分别为425 nm和485 nm，发射波长范围分别为470~650 nm和515~650 nm，将两次荧光检测信号相除的比例结果代入实施例2所建立标准曲线的方程，计算各测试样品中赭曲霉毒素A的浓度及回收率，结果见表1。
表1各测试样品中赭曲霉毒素A的浓度及回收率表
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
从表1可以看出，本发明所述方法可对咖啡中赭曲霉毒素A进行有效检测。
实施例4：燕麦中所含赭曲霉毒素A的检测
本实施例的步骤依次如下：
（1）取三只洁净离心管，分别加入5g不含赭曲霉毒素A的燕麦片、14 mL甲醇、6 mL超纯水和不同量的赭曲霉毒素A并混合均匀，然后震荡30 min，震荡完成后在8000 rpm转速下离心5 min，然后分别取三只离心管中的上清液作为三个待测样品，三只离心管中赭曲霉毒素A的加入量以终浓度分别为200 ng/mL、300 ng/mL、400 ng/mL计量，将赭曲霉毒素A的终浓度为200 ng/mL测试样品命名为l号测试样品，将赭曲霉毒素A的终浓度为300 ng/mL测试样品命名为2号测试样品，将赭曲霉毒素A的浓度为400 ng/mL测试样品命名为3号测试样品；
（2）取三只洁净离心管，向三只洁净离心管中分别加入2 μL赭曲霉毒素A终浓度为200 ng/mL、300 ng/mL、400 ng/mL的测试样品和33 μL实施例1制备的荧光比例探针溶液并混合均匀，然后在室温下静置10 min；
（3）用全功能微孔板检测仪连续进行两次荧光检测，荧光检测的激发波长分别为425 nm和485 nm，发射波长范围分别为470~650 nm和515~650 nm，将两次荧光检测信号相除的比例结果代入实施例2所建立标准曲线的方程，计算各测试样品中赭曲霉毒素A的浓度及回收率，结果见表2。
表2各测试样品中赭曲霉毒素A的浓度及回收率表
Figure 527630DEST_PATH_IMAGE002
从表2可以看出，本发明所述方法可对燕麦中赭曲霉毒素A进行有效检测。
序列表
<110> 四川大学
<120> 比例型核酸适配体荧光探针及其检测赭曲霉毒素A的方法
<160> 1
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
Gatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatc 31

Claims (10)

1.一种比例型核酸适配体荧光探针，其特征在于：该比例型核酸适配体荧光探针由可特异性识别赭曲霉毒素A并在5’端标记荧光显色基团的核酸适配体即OTA核酸适配体和核酸四链体染料硫黄素T组成，该探针的检测限为0.38ng/mL，检测线性范围为5 ng/mL-700ng/mL；所述OTA核酸适配体可特异性识别赭曲霉毒素A，其核苷酸序列为序列表中SEQ IDNO：1所示。
2.根据权利要求1中所述的比例型核酸适配体荧光探针，其特征在于：所述荧光显色基团为FITC、TET、JOE、HEX、Alexa Fluor 488。
3.一种如权利要求1或2所述的比例型核酸适配体荧光探针的制备方法，其特征在于：该制备方法包含以下步骤：
将在5’端标记荧光显色基团的OTA核酸适配体、核酸四链体染料硫黄素T溶解在结合缓冲溶液中并混合均匀，再置于4℃静止保存，得到比例型核酸适配体荧光探针。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述OTA核酸适配体与硫黄素T的摩尔浓度比为1:20~60。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述结合缓冲溶液成分为20~40 mM Tris、8~10 mM镁盐离子、50~70 mM钾盐离子和1 mM DTT。
6.权利要求1或2所述的比例型核酸适配体荧光探针或权利要求3或4所述制备方法得到的比例型核酸适配体荧光探针在检测赭曲霉毒素A中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述比例型核酸适配体荧光探针检测赭曲霉毒素A的方法包括以下步骤：
（1）制备比例型核酸适配体荧光探针溶液：
将在5’端标记荧光显色基团的OTA核酸适配体、核酸四链体染料硫黄素T溶解在结合缓冲溶液中并混合均匀，结合缓冲溶液成分为20~40 mM Tris、8~10 mM镁盐离子、50~70 mM钾盐离子和1 mM DTT，再置于4℃静止保存；得荧光探针溶液；
（2）建立定量检测赭曲霉毒素A的标准曲线
配制不同浓度赭曲霉毒素A标准品溶液，然后将不同浓度赭曲霉毒素A标准品溶液分别与荧光比例探针溶液混合均匀，于室温静置10 min，进行赭曲霉毒素A的识别过程，使赭曲霉毒素A与核酸适配体发生特异性反应，从而置换出嵌入在适配体其中的硫黄素T，然后分别连续进行两次荧光检测，并根据两次荧光检测信号之比的结果，建立以赭曲霉毒素A浓度为横坐标、荧光比例信号为纵坐标的标准曲线；
（3）实际样品所含赭曲霉毒素A的检测
将待测样品与荧光比例探针溶液混合均匀，于室温静置10 min，进行赭曲霉毒素A识别过程，然后分别连续进行两次荧光检测，并根据两次荧光检测信号之比的结果，代入步骤（2）所建立的标准曲线方程，即可计算出待测样品所含赭曲霉毒素A的浓度。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述OTA核酸适配体和硫黄素T的摩尔浓度比为1:20~60。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述步骤（2）和步骤（3）中，连续两次荧光检测的激发波长分别为425 nm和485 nm，发射波长分别为460~650 nm和515~650 nm。
10.一种检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
（1）制备比例型核酸适配体荧光探针溶液：
将在5’端标记荧光显色基团的OTA核酸适配体、核酸四链体染料硫黄素T溶解在结合缓冲溶液中并混合均匀，结合缓冲溶液成分为20~40 mM Tris、8~10 mM镁盐离子、50~70 mM钾盐离子和1 mM DTT，再置于4℃静止保存；得荧光探针溶液；所述OTA核酸适配体和硫黄素T的摩尔浓度比为1:20~60；
（2）建立定量检测赭曲霉毒素A的标准曲线
配制不同浓度赭曲霉毒素A标准品溶液，然后将不同浓度赭曲霉毒素A标准品溶液分别与荧光比例探针溶液混合均匀，于室温静置10 min，进行赭曲霉毒素A的识别过程，使赭曲霉毒素A与核酸适配体发生特异性反应，从而置换出嵌入在适配体其中的硫黄素T，然后分别连续进行两次荧光检测，连续两次荧光检测的激发波长分别为425 nm和485 nm，发射波长分别为460~650 nm和515~650 nm；并根据两次荧光检测信号之比的结果，建立以赭曲霉毒素A浓度为横坐标、荧光比例信号为纵坐标的标准曲线；
（3）实际样品所含赭曲霉毒素A的检测
将待测样品与荧光比例探针溶液混合均匀，于室温静置10 min，进行赭曲霉毒素A识别过程，然后分别连续进行两次荧光检测，连续两次荧光检测的激发波长分别为425 nm和485nm，发射波长分别为460~650 nm和515~650 nm；并根据两次荧光检测信号之比的结果，代入步骤（2）所建立的标准曲线方程，即可计算出实际样品所含赭曲霉毒素A的浓度。
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