CN109490264A - 基于聚集发光的双端互补核酸适配体探针及黄曲霉毒素b1均相免标记检测方法 - Google Patents

基于聚集发光的双端互补核酸适配体探针及黄曲霉毒素b1均相免标记检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于聚集发光的双端互补核酸适配体探针，所述核酸适配体可特异性识别黄曲霉毒素B1，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所示，所述探针与上述核酸适配体双端互补，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所示。本发明所述黄曲霉毒素B1免标记均相检测方法，步骤如下：(1)制备探针‑核酸适配体杂交反应液；(2)建立黄曲霉毒素B1浓度与荧光强度的标准曲线；(3)实际物质所含黄曲霉毒素B1的检测。使用本发明所述方法，不需对所述核酸适配体及探针进行标记，在均相溶液环境进行荧光检测，就可得到测试样品中所含黄曲霉毒素B1的浓度，因而可简化操作，缩短检测时间，降低检测成本。

Description

基于聚集发光的双端互补核酸适配体探针及黄曲霉毒素B1均 相免标记检测方法
技术领域
本发明属于黄曲霉毒素B1检测领域，涉及一种与可特异性识别黄曲霉毒素B1的核酸适配体双端互补的探针及利用聚集诱导发光技术(AIE)和所述核酸适配体、与核酸适配体双端互补的探针均相免标记检测黄曲霉毒素B1的方法。
背景技术
黄曲霉菌是广泛分布于自然界的腐生真菌，可以寄生于粮食、食品及饲料中进行生长繁殖，并在此过程中产生真菌毒素——黄曲霉毒素(Aflatoxin)。黄曲霉毒素(Aflatoxin)是化学结构相似的一类衍生物，是黄曲霉菌和寄生曲霉菌分泌的一种次级代谢产物。该毒素容易污染粮食作物及其制品，是目前已发现的最强的天然致癌物质，其中，黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，简称AFB1)是一种毒性最强的黄曲霉毒素，被国际癌症研究机构确认为一种最主要的致癌物。因此，黄曲霉毒素B1的快速、廉价、不依赖大型仪器的检测方法非常需要。
我国针对黄曲霉毒素B1的国家标准检测方法有五种，即同位素稀释液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱-柱前衍生法、高效液相色谱-柱后衍生法、薄层色谱法和酶联免疫吸附筛查法。上述方法由于仪器设备昂贵或/和操作步骤复杂繁琐、耗时长，检测环境条件要求高，或抗体较为昂贵，并且不易保存等因素，不便于在企业实际生产中应用和推广。
核酸适配体(aptamer)是一段能够与靶分子高亲和力、高特异性结合的单链寡核苷酸，已用于黄曲霉毒素B1的检测，目前已公开的利用核酸适配体检测黄曲霉毒素B1的方法需在核苷酸序列上进行标记，或结合其它纳米材料，因而检测成本仍然较为昂贵，并且不能实现在同一试管内均相检测黄曲霉毒素B1。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于聚集发光的双端互补核酸适配体探针及黄曲霉毒素B1均相免标记检测方法，以简化分析步骤，降低分析成本。
本发明中的核酸适配体可特异性识别黄曲霉毒素B1，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所示，简称“AFB1核酸适配体”，本发明中的探针与AFB1核酸适配体双端互补，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所示，命名为“Block探针”。
本发明所述黄曲霉毒素B1均相免标记检测方法，步骤如下：
(1)制备探针-核酸适配体杂交反应液
将Block探针、AFB1核酸适配体溶解在核酸外切酶缓冲溶液1×Exonuclease Ibuffer中并混合均匀形成反应体系，然后在80～90℃保温3～5min退火，再置于室温杂交反应30～40min 即形成探针-核酸适配体杂交反应液；反应体系中，Block探针与AFB1核酸适配体的摩尔比为1:1，核酸外切酶缓冲溶液1×Exonuclease I buffer的量以能完全溶解所加入的Block探针和 AFB1核酸适配体计量；
(2)建立黄曲霉毒素B1浓度与荧光强度的标准曲线
配制一系列不同浓度黄曲霉毒素B1标准品水溶液，然后将一定量不同浓度黄曲霉毒素 B1标准品水溶液分别与一定量步骤(1)制备的探针-核酸适配体杂交反应液混合均匀，于室温静置30～60min，进行黄曲霉毒素B1识别，使杂交反应后的所述探针和核酸适配体离解，再分别加入核酸外切酶Exonuclease I并混合均匀在37℃静置30～60min对离解的探针进行切割，使其碎片化，再分别加入具有聚合诱导发光特性的染料DSAI并混合均匀，继后进行荧光检测，并根据荧光检测结果建立以黄曲霉毒素B1浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标的标准曲线；
(3)实际物质所含黄曲霉毒素B1的检测
将待测实际物质进行处理得到测试样品，将一定量测试样品与一定量步骤(1)制备的探针-核酸适配体杂交反应液混合均匀，于室温静置30～60min，进行黄曲霉毒素B1识别，使杂交反应后的所述探针和核酸适配体离解，再分别加入核酸外切酶Exonuclease I并混合均匀在 37℃静置30～60min对离解的探针进行切割，使其碎片化，再分别加入具有聚合诱导发光特性的染料DSAI并混合均匀，继后进行荧光检测得到荧光强度，将所得荧光强度带入步骤(2) 所建立标准曲线的方程，即可计算出实际物质所含黄曲霉毒素B1的浓度。
上述方法的步骤(3)中，将待测实际物质进行处理得到测试样品的操作如下：
在室温下将待测实际物质加入提取液中震荡40～60min，震荡完成后离心8～10min，转速为5000～6000rpm，然后取上清液作为测试样品；所述提取液由甲醇和超纯水组成，甲醇与超纯水的体积比为7:3，待测实际物质与提取液的体积比为1:(3～5)，或待测实际物质与提取液的质量与体积之比为1:(3～5)，所述质量的单位为g，所述体积的单位为mL。
上述方法的步骤(2)中，黄曲霉毒素B1标准品水溶液与探针-核酸适配体杂交反应液的体积比优选1:8，核酸外切酶Exonuclease I与黄曲霉毒素B1标准品水溶液的体积比优选1:2，染料DSAI的浓度为100μM，浓度100μM的染料DSAI与黄曲霉毒素B1标准品水溶液的体积比优选1:2；上述方法的步骤(3)中，测试样品与探针-核酸适配体杂交反应液的体积比优选1:8，核酸外切酶Exonuclease I与测试样品的体积比优选1:2，染料DSAI的浓度为100μM，浓度100μM的染料DSAI与测试样品的体积比优选1:2。
上述方法的步骤(2)和步骤(3)中，荧光检测的激发波长均为405nm，发射波长均为425～700nm。
上述方法中，染料DSAI的化学式为C36H38I2N2。
本发明所述黄曲霉毒素B1均相免标记检测方法，其检测原理如图1所示，Block探针与 AFB1核酸适配体通过杂交反应结合以后会形成两端互补的稳定结构，但Block探针与AFB1 核酸适配体的结合力弱于AFB1与AFB1核酸适配体的结合力，因此当含AFB1的测试样品与探针-核酸适配体杂交反应液混合后，AFB1会与AFB1核酸适配体相结合，使AFB1适配体与Block探针发生解离，解离后的Block探针通过核酸外切酶Exonuclease I作用以后被切割成碎片化的碱基，当加入具有聚合诱导发光(AIE)特性的DSAI分子后，产生的荧光信号较弱，若测试样品中不含AFB1，当测试样品与探针-核酸适配体杂交反应液混合后，Block 探针和AFB1核酸适配体形成的稳定双链结构不能被核酸外切酶Exonuclease I切割，再加入具有聚合诱导发光特性的DSAI分子后，则可被DSAI吸附聚集产生较强的荧光信号。即荧光信号的强度会随着AFB1浓度的增加而减弱，因此可配制一系列不同浓度AFB1标准品水溶液，将AFB1标准品水溶液与探针-核酸适配体杂交反应液混合进行AFB1识别，再进行荧光检测，并根据荧光检测结果建立以黄曲霉毒素B1浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标的标准曲线，在此基础上构建黄曲霉毒素B1均相免标记检测方法。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
1、本发明提供了一种与AFB1核酸适配体双端互补的探针，该探针具有的特性，为构建基于聚集诱导发光技术的均相免标记黄曲霉毒素B1检测方法垫定了基础(见上述检测原理和图1)。
2、本发明所述黄曲霉毒素B1均相免标记检测方法不需对AFB1核酸适配体及与该核酸适配体双端互补的探针进行标记，将测试样品、探针-核酸适配体杂交反应液、核酸外切酶Exonuclease I和具有聚合诱导发光特性的染料DSAI进行混合，在均相溶液环境进行荧光检测，就可得到测试样品中所含黄曲霉毒素B1的浓度，因而不仅简化了操作，缩短了检测时间，而且降低了检测成本，有利于在企业实际生产中应用和推广。
3、本发明所述均相免标记检测黄曲霉毒素B1方法使用具有聚合诱导发光(AIE)特性的DSAI分子作为染料，可以使更多的DSAI分子结合到Block探针和AFB1适配体形成的稳定双链结构上，获得高亮度荧光，提高检测效率，而不必担心象传统的荧光分子那样发生聚集导致的荧光猝灭。
4、本发明所述黄曲霉毒素B1均相免标记检测方法所用试剂及检测操作，对操作者和环境基本无污染，有利于环境保护。
附图说明
图1是本发明所述黄曲霉毒素B1均相免标记检测方法的原理图，图中，AFB1为黄曲霉毒素B1，Exo 1为核酸外切酶Exonuclease I，DSAI为具有聚合诱导发光特性的染料。
图2是黄曲霉毒素B1浓度与荧光强度的标准曲线。
具体实施方式
下面通过实施例并结合附图对本发明所述基于聚集发光的双端互补核酸适配体探针及黄曲霉毒素B1均相免标记检测方法作进一步说明。
下述实施例中，核酸外切酶Exonuclease I、核酸外切酶缓冲溶液10×Exonuclease I buffer 购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)公司；黄曲霉毒素B1购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；甲醇购自成都市科隆化学品有限公司；荧光分光光度计型号为F-7000，由日本日立集团生产。超纯水是指电阻率达到18MΩ*cm(25℃)的水，用美国Millipore公司Milli-Q超纯水仪制备。
具有聚合诱导发光特性的染料DSAI，根据文献资料“Fluorescent AptasensorBased on Aggregation-Induced Emission Probe and GrapheneOxide.Anal.Chem.2014,86,298-303”自行合成。
下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1：基于聚集发光的双端互补核酸适配体探针的设计与合成
本实施例利用https://sg.idtdna.com/calc/analyzer和http://www.nupack.org网站，通过核酸杂交热力学辅助计算，设计与AFB1核酸适配体双端互补的Block探针。所述AFB1核酸适配体从现有技术中获得(见Patent:PCT/CA2010/001292)，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所示，所述Block探针的苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所示。
将所上述核苷酸序列交由专业合成公司——生工生物工程(上海)股份有限公司，委托其合成，从该公司取得AFB1核酸适配体及Block探针。
实施例2：制备探针-核酸适配体杂交反应液
在容器中加入30μL核酸外切酶缓冲溶液10×Exonuclease I buffer、30μl AFB1核酸适配体、 30μL Block探针、150μL超纯水，混匀后在90℃下保温5min退火，然后置于室温杂交反应 35min，即形成探针-核酸适配体杂交反应液，将其在低温(4℃)下储存备用。
实施例3：建立黄曲霉毒素B1浓度与荧光强度的标准曲线
本实施例的步骤依次如下：
(1)取六只试管，分别加入超纯水和黄曲霉素B1配制六种不同浓度的黄曲霉素B1标准品溶液各2μL，黄曲霉素B1标准品溶液的浓度分别为0ng/mL、10ng/mL、40ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL；
(2)向六只试管中分别加入16μL实施例2制备的探针-核酸适配体杂交反应液并混合均匀，然后在室温下静置40min；
(3)向六只试管中分别加入1μL核酸外切酶Exonuclease I并混合均匀，然后在37℃下静置60min；
(4)向六只试管中分别加入1μL浓度为100μM的染料DSAI并混合均匀，然后用荧光分光光度计分别对六只试管中的液态物质进行荧光检测，荧光检测的激发波长为405nm，发射波长为425～700nm，根据荧光检测结果建立以黄曲霉毒素B1浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标的标准曲线，如图2所示，所述标准曲线的方程为y＝-2.97x+3354.563，R2＝0.99001，式中，x为黄曲霉毒素B1浓度，y为荧光强度。
实施例4：豆瓣酱中所含黄曲霉素B1的检测
本实施例的步骤依次如下：
(1)取四只离心管，分别加入5g不含黄曲霉毒素B1的豆瓣酱、14mL甲醇、6mL超纯水和不同量的黄曲霉毒素B1并混合均匀，然后震荡60min，震荡完成后在6000rpm转速下离心10min，然后分别取四只离心管中的上清液作为四个测试样品，四只离心管中黄曲霉毒素B1的加入量以四个测试样品中黄曲霉毒素B1的浓度分别为50ng/ml、100ng/ml、200 ng/ml、300ng/ml计量，将黄曲霉毒素B1的浓度为50ng/ml测试样品命名为l号测试样品，将黄曲霉毒素B1的浓度为100ng/ml测试样品命名为2号测试样品，将黄曲霉毒素B1的浓度为200ng/ml测试样品命名为3号测试样品，将黄曲霉毒素B1的浓度为300ng/ml测试样品命名为4号测试样品；
(2)取四只试管，向四只试管中分别加入2μl黄曲霉毒素B1浓度为50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml的测试样品和16μl实施例2制备的探针-核酸适配体杂交反应液并混合均匀，然后在室温下静置50min；
(3)向四只试管中分别加入1μL核酸外切酶Exonuclease I并混合均匀，然后在37℃下静置60min；
(4)向四只试管中分别加入1μL浓度为100μM的染料DSAI并混合均匀，然后用荧光分光光度计分别对四只试管中的液态物质进行荧光检测，荧光检测的激发波长为405nm，发射波长为425～700nm，将测得的荧光强度值分别代入实施例3所建立标准曲线的方程，计算各测试样品中黄曲霉毒素B1的浓度及回收率，结果见表1。
表1
从表1可以看出，本发明所述方法可对豆瓣酱中黄曲霉毒素B1进行有效检测。
实施例5：花生油中所含黄曲霉素B1的检测
本实施例的步骤依次如下：
(1)取四只离心管，分别加入5g不含黄曲霉毒素B1的花生油、14mL甲醇、6mL超纯水和不同量的黄曲霉毒素B1并混合均匀，然后震荡40min，震荡完成后在6000rpm转速下离心10min，然后分别取四只离心管中的上清液作为四个测试样品，四只离心管中黄曲霉毒素B1的加入量以四个测试样品中黄曲霉毒素B1的浓度分别为50ng/ml、100ng/ml、200 ng/ml、300ng/ml计量，将黄曲霉毒素B1的浓度为50ng/ml测试样品命名为l号测试样品，将黄曲霉毒素B1的浓度为100ng/ml测试样品命名为2号测试样品，将黄曲霉毒素B1的浓度为200ng/ml测试样品命名为3号测试样品，将黄曲霉毒素B1的浓度为300ng/ml测试样品命名为4号测试样品；
(2)取四只试管，向四只试管中分别加入2μl黄曲霉毒素B1的浓度为50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml的测试样品和16μl实施例2制备的探针-核酸适配体杂交反应液并混合均匀，然后在室温下静置50min；
(3)向四只试管中分别加入1μL核酸外切酶Exonuclease I并混合均匀，然后在37℃下静置60min；
(4)向四只试管中分别加入1μL浓度为100μM的染料DSAI并混合均匀，然后用荧光分光光度计分别对四只试管中的液态物质进行荧光检测，荧光检测的激发波长为405nm，发射波长为425～700nm，将测得的荧光强度值分别代入实施例3所建立标准曲线的方程，计算各测试样品中黄曲霉毒素B1的浓度及回收率，结果见表2。
表2
从表2可以看出，本发明所述方法可对花生油中黄曲霉毒素B1进行有效检测。
序列表
<110> 四川大学
<120> 基于聚集发光的双端互补核酸适配体探针及黄曲霉毒素B1均相免标记检测方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggcccaca 50
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
tgtgggccta tattttattt atttattttt tatttttaca cgtgcccaac 50

Claims (6)

1.一种基于聚集发光的双端互补核酸适配体探针，其特征在于所述核酸适配体可特异性识别黄曲霉毒素B1，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所示，所述探针与上述核酸适配体双端互补，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所示。
2.一种黄曲霉毒素B1均相免标记检测方法，其特征在于步骤如下：
(1)制备探针-核酸适配体杂交反应液
将权利要求1所述探针、权利要求1所述核酸适配体溶解在核酸外切酶缓冲溶液1×Exonuclease I buffer中并混合均匀形成反应体系，然后在80～90℃保温3～5min退火，再置于室温杂交反应30～40min即形成探针-核酸适配体杂交反应液；反应体系中，权利要求1所述探针与权利要求1所述核酸适配体的摩尔比为1:1，核酸外切酶缓冲溶液1×Exonuclease I buffer的量以能完全溶解所加入的权利要求1所述探针和权利要求1所述核酸适配体计量；
(2)建立黄曲霉毒素B1浓度与荧光强度的标准曲线
配制一系列不同浓度黄曲霉毒素B1标准品水溶液，然后将一定量不同浓度黄曲霉毒素B1标准品水溶液分别与一定量步骤(1)制备的探针-核酸适配体杂交反应液混合均匀，于室温静置30～60min，进行黄曲霉毒素B1识别，使杂交反应后的所述探针和核酸适配体离解，再分别加入核酸外切酶Exonuclease I并混合均匀在37℃静置30～60min对离解的探针进行切割，使其碎片化，再分别加入具有聚合诱导发光特性的染料DSAI并混合均匀，继后进行荧光检测，并根据荧光检测结果建立以黄曲霉毒素B1浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标的标准曲线；
(3)实际物质所含黄曲霉毒素B1的检测
将待测实际物质进行处理得到测试样品，将一定量测试样品与一定量步骤(1)制备的探针-核酸适配体杂交反应液混合均匀，于室温静置30～60min，进行黄曲霉毒素B1识别，使杂交反应后的所述探针和核酸适配体离解，再分别加入核酸外切酶Exonuclease I并混合均匀在37℃静置30～60min对离解的探针进行切割，使其碎片化，再分别加入具有聚合诱导发光特性的染料DSAI并混合均匀，继后进行荧光检测得到荧光强度，将所得荧光强度带入步骤(2)所建立标准曲线的方程，即可计算出实际物质所含黄曲霉毒素B1的浓度。
3.根据权利要求2所述黄曲霉毒素B1均相免标记检测方法，，其特征在于步骤(3)中，将待测实际物质进行处理得到测试样品的操作如下：
在室温下将待测实际物质加入提取液中震荡40～60min，震荡完成后离心8～10min，转速为5000～6000rpm，然后取上清液作为测试样品；所述提取液由甲醇和超纯水组成，甲醇与超纯水的体积比为7:3，待测实际物质与提取液的体积比为1:(3～5)，或待测实际物质与提取液的质量与体积之比为1:(3～5)，所述质量的单位为g，所述体积的单位为mL。
4.根据权利要求2或3所述黄曲霉毒素B1均相免标记检测方法，其特征在于步骤(2)中，黄曲霉毒素B1标准品水溶液与探针-核酸适配体杂交反应液的体积比为1:8，核酸外切酶Exonuclease I与黄曲霉毒素B1标准品水溶液的体积比为1:2，染料DSAI的浓度为100μM，浓度100μM的染料DSAI与黄曲霉毒素B1标准品水溶液的体积比为1:2；
步骤(3)中，测试样品与探针-核酸适配体杂交反应液的体积比为1:8，核酸外切酶Exonuclease I与测试样品的体积比为1:2，染料DSAI的浓度为100μM，浓度100μM的染料DSAI与测试样品的体积比为1:2。
5.根据权利要求2或3所述黄曲霉毒素B1均相免标记检测方法，，其特征在于步骤(2)和步骤(3)中，荧光检测的激发波长均为405nm，发射波长均为425～700nm。
6.根据权利要4所述黄曲霉毒素B1均相免标记检测方法，，其特征在于步骤(2)和步骤(3)中，荧光检测的激发波长均为405nm，发射波长均为425～700nm。
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