CN104458684A - 基于非标记荧光染料和核酸适配体的检测生物分子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程领域，旨在提供一种基于非标记荧光染料和核酸适配体的检测生物分子的方法。该方法是将核酸适配体和待检测的生物分子混合后，加入与核酸适配体互补的寡核酸链；核酸适配体与待检测的生物分子发生特异性结合，未结合的多余核酸适配体则与互补的寡核酸链杂交生成双链DNA，而双链DNA与非标记荧光染料PicoGreen结合释放荧光；不同浓度的待检测的生物分子与固定浓度的核酸适配体结合时反应液中的荧光强度不同，通过检测荧光强度就能实现对生物分子快速、定量的检测。本发明在提高检测灵敏度和特异性的同时，缩短了检测的时间，仅需25-40分钟；对待检测物质的检测灵敏度可以达到皮克-纳克水平；本发明中使用的核酸适配体可以方便合成，成本低。

Description

基于非标记荧光染料和核酸适配体的检测生物分子的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种基于非标记荧光染料PicoGreen和核酸适配体检测生物分子的快速检测方法。

背景技术

微生物、蛋白质、多糖、多肽、毒素、化学药物等生物分子的检测依据检测原理不同可以分为：基于抗原-抗反应技术的酶联免疫吸附试验法、基于核酸扩增的聚合酶链式反应技术的PCR和RT-PCR法、基于侧向层析技术的胶体金法、基于仪器分析技术的质谱、色谱法等。除了仪器分析方法之外，其他各种方法虽然检测方法快速，但是灵敏度和特异性低。基于核酸扩增的聚合酶链式反应技术的PCR和RT-PCR法虽然检测灵敏度也高，但是对于非微生物类样品，无法进行PCR或RT-PCR检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种基于非标记荧光染料和核酸适配体检测生物分子的方法。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种基于非标记荧光染料和核酸适配体的检测生物分子的方法，是利用非标记荧光染料PicoGreen能特异性结合双链核苷酸且在结合后释放荧光，而非标记荧光染料PicoGreen与单链核苷酸不结合且游离的PicoGreen无荧光的特性。将核酸适配体和待检测的生物分子混合后，加入与核酸适配体互补的寡核酸链；核酸适配体与待检测的生物分子发生特异性结合，未结合的多余核酸适配体则与互补的寡核酸链杂交生成双链DNA，而双链DNA与非标记荧光染料PicoGreen结合释放荧光；不同浓度的待检测的生物分子与固定浓度的核酸适配体结合时反应液中的荧光强度不同，通过检测荧光强度就能实现对生物分子快速、定量的检测。

本发明具体包括以下步骤：

(1)将核酸适配体分别与不同浓度的待检测生物分子的标准品在微孔板的孔板内混匀；缓冲液为：10mmol/L Tris，120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，20mmol/L CaCl₂，pH8.5；反应5-10分钟；反应体系内核酸适配体的浓度为0.1～10纳摩尔/升；

(2)加入与核酸适配体的序列互补的寡核酸链，反应体系内寡核酸链的浓度为0.1～10纳摩尔/升；反应时间为5-10分钟；

(3)加入非标记荧光染料PicoGreen；其在反应体系内浓度根据生产商的推荐值确定；反应15分钟后，用酶标仪或荧光分光光度计检测非标记荧光染料PicoGreen的荧光强度，激发波长为480nm，发射波长为520nm；

(4)根据待检测生物分子的标准品浓度和非标记荧光染料PicoGreen释放的荧光强度拟合曲线；

(5)以未知浓度的待检样品替换标准品，按照步骤(1)-(3)进行操作，检测非标记荧光染料PicoGreen释放的荧光强度；然后根据步骤(4)拟合的标准品的曲线，计算待检样品的浓度。

本发明中，所述待检测的生物分子是微生物、蛋白质、多糖、多肽、毒素或化学药物中的任意一种。

非标记荧光染料PicoGreen是一种可以特异性与双链DNA结合的荧光染料，可以检测到皮克级的双链DNA。单链的核酸不能结合PicoGreen，不产生荧光。

核酸适配体又称适体(Aptamer)，是一条约20～100个核苷酸组成的单链、寡核苷酸，最早于20世纪90年代由Andrew D.Ellington和Jack W.Szostak通过“指数富集配体系统进化技术”体外筛选获得。由于核酸适配体在范德华力、碱基堆积力等作用下折叠形成特殊的三级结构，因此可以和特定的生物分子结合。与传统的抗体相比，寡核酸链具有制备方便，易修饰，亲和力高，稳定性好等特点，在生物传感器、荧光检测等方面得到广泛应用。

本发明正是利用PicoGreen可以特异性结合皮克浓度的双链DNA，而核酸适配体是单链这一特性，设计了一种基于核酸适配体的、非荧光标记的检测生物分子的方法，检测下限可以达到皮克和纳克水平。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明利用非标记荧光染料PicoGreen和核酸适配体技术，开发了快速检测技术，在提高检测灵敏度和特异性的同时，缩短了检测的时间，仅需25-40分钟。

本发明对待检测物质的检测灵敏度可以达到皮克-纳克水平；本发明中使用的核酸适配体可以方便合成，成本低。

相对于背景技术，本发明具有高效、简捷、快速、方便、适用广等优点。

具体实施方式

发明原理介绍：

本发明通过在反应体系中加入核酸适配体和待检测的生物分子，然后再加入与核酸适配体互补的寡核酸链。核酸适配体与待检测的生物分子将发生特异性结合，而溶液中多余的、未结合生物分子的核酸适配体可以与反应体系中互补的寡核酸链杂交生成双链DNA。而双链DNA又与PicoGreen结合，释放荧光。不同浓度的待检测的生物分子与固定浓度的核酸适配体结合时，反应液中的荧光强度不同，从而可以实现快速、定量检测目的。

本发明中，非标记荧光染料PicoGreen通常使用商品化的产品，具体的反应浓度则依据生产商推荐使用浓度来确定，不同生产商推荐数据略有变化。

以下的实施例可以使本专业技术领域的技术人员更全面的了解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：毒素类的快速检测

以下程序以锗曲毒素OTA和OTA适配体(序列5'-GCATCTGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGG-3')为例，阐述基于PicoGreen技术的快速检测方法：

标准曲线的绘制：

取10微升10nmol/L OTA核酸适配体分别与10微升终浓度为0、0.1、1、2、4、8、10ng/mL的OTA溶液在96孔板内混匀反应。反应缓冲液为：(10mmol/L Tris，120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，20mmol/L CaCl₂，pH8.5)，反应体积50微升，反应时间5-10分钟。加入10微升10nmol/L与OTA适配体互补的单链寡核苷酸(序列为：5'-CCTTTACGCCACCCACACCCGATCAGATGC-3')，反应5-10分钟，再加入10微升PicoGreen(终浓度为1pmol/L)，混匀。反应15分钟后，利用酶标仪或荧光分光光度计，连续检测荧光5分钟，记录荧光的变化(Δ)。利用Excel或者统计学分析软件SPSS、Sigma Plot或GraphPad等作图，横坐标为OTA浓度(对数Log)，纵坐标为PicoGreen荧光的增加值(Δ)。

未知样品的检测：

取10微升10nmol/L OTA核酸适配体与10微升未知OTA浓度的待检样品在96孔板内混匀反应。反应缓冲液为：(10mmol/L Tris，120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，20mmol/L CaCl₂，pH8.5)，反应体积50微升，反应时间5-10分钟。加入10微升10nmol/L与OTA适配体互补的单链寡核苷酸(序列为：5'-CCTTTACGCCACCCACACCCGATCAGATGC-3')，反应5-10分钟，再加入10微升PicoGreen(终浓度为1pmol/L)，混匀。反应15分钟后，利用酶标仪或荧光分光光度计，连续检测荧光5分钟，记录荧光的变化(Δ)。根据PicoGreen荧光的变化值，利用标准曲线定量OTA的浓度。

根据此实施例，待检测的OTA的检测下限线浓度为0.1ppb(高于此浓度均可检出。不同的毒素适配体不同，因此针对不同的毒素，应选择特异性的适配体。常见的毒素适配体核苷酸序列如下：

锗曲毒素OTA适配体:

5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’

或者：5’-GCATCTGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGG-3’

伏马毒素FB1适配体：

5’-AATCGCATTACCTTATACCAGCTTATTCAATTACGTCTGCACATACCAGCTTATTCAATT-3’

黄曲霉毒素AFB1适配体：

5'-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-3’

黄曲霉毒素AFM1适配体：

5’-ACT GCT AGA GAT TTT CCA CAT-3’

玉米赤霉烯醇适配体:

5’-TCATCTATCTATGGTACATTACTATCTGTAATGTGATATG–3’

桔青毒素适配体：

5’-GGCCAGGCGGGGCCTGTTCGCTGGGGCCGTGTCTTCGCGCTCGCTCGGTGTTGTTTGGCG-3’

实施例2：抗生素类的检测

以下程序以氨苄青霉素Amp和Amp适配体(序列5’-GCGGGCGGTTGTATAGCGG-3’)为例，，阐述基于PicoGreen技术的快速检测方法：

标准曲线的绘制：

取10微升10nmol/L Amp核酸适配体分别与10微升终浓度为0、0.1、1、2、4、8、10ng/mL的Amp溶液在96孔板内混匀反应。反应缓冲液为：(10mmol/L Tris，120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，20mmol/L CaCl₂，pH8.5)，反应体积50微升，反应时间5-10分钟。加入10微升10nmol/L与Amp适配体互补的单链寡核苷酸(序列为：5’-CCGCTATACAACCGCCCGC-3’)，反应5-10分钟，再加入10微升PicoGreen(终浓度为1pmol/L)，混匀。反应15分钟后，利用酶标仪或荧光分光光度计，连续检测荧光5分钟，记录荧光的变化(Δ)。利用Excel或者统计学分析软件SPSS、Sigma Plot或GraphPad等作图，横坐标为Amp浓度(对数Log)，纵坐标为PicoGreen荧光的增加值(Δ)。

未知样品的检测：

取10微升10nmol/L Amp核酸适配体与10微升未知Amp浓度的待检样品在96孔板内混匀反应。反应缓冲液为：(10mmol/L Tris，120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，20mmol/L CaCl₂，pH8.5)，反应体积50微升，反应时间5-10分钟。加入10微升10nmol/L与Amp适配体互补的单链寡核苷酸(序列为：5’-CCGCTATACAACCGCCCGC-3’)，反应5-10分钟，再加入10微升PicoGreen(终浓度为1pmol/L)，混匀。反应15分钟后，利用酶标仪或荧光分光光度计，连续检测荧光5分钟，记录荧光的变化(Δ)。根据PicoGreen荧光的变化值，利用标准曲线定量Amp的浓度。

根据此实施例，待检测的Amp的检测下限线浓度为0.1ppb(高于此浓度均可检出。不同的抗生素适配体不同，因此针对不同的抗生素，应选择特异性的适配体。常见的抗生素适配体核苷酸序列如下：

氨苄青霉素Amp适配体：

5’-GCGGGCGGTTGTATAGCGG-3’。

四环素Tet适配体：

5’-GGGCCTAAAACATACCAGATCGCCACCCGCGCTTTAATCTGGAGAGGTGAAGAATACGACCACCTAGGCTC-3’

卡那霉素Kan适配体：

5’-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA–3’

特别说明：

虽然本发明的实施例中只列举了两类生物分子，以及对应的特异性结合的核酸适配体、适配体互补序列，并没有列举全部生物分子的核酸适配体以及与其各自互补的寡核酸链。但是，不同生物分子对应的核酸适配体可以通过查阅相关文献获得，属于本领域技术人员公知常识。核酸适配体的互补链序列就是根据碱基互补原则形成的反向互补序列，属于本领域技术人员公知常识。在本发明提供所述基于非标记荧光染料和核酸适配体的检测生物分子的方法之后，本领域技术人员能够根据其掌握的技能举一反三，实现其他生物材料的检测目的。本发明只是提供一种新思路去利用这些核酸适配体，对于相应的核酸适配体的序列并不要求保护。

以上是结合具体实施例子对本发明所做的进一步描述。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的前提下，本发明及其应用还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (3)

1.基于非标记荧光染料和核酸适配体的检测生物分子的方法，其特征在于，是将核酸适配体和待检测的生物分子混合后，加入与核酸适配体互补的寡核酸链；核酸适配体与待检测的生物分子发生特异性结合，未结合的多余核酸适配体则与互补的寡核酸链杂交生成双链DNA，而双链DNA与非标记荧光染料PicoGreen结合释放荧光；不同浓度的待检测的生物分子与固定浓度的核酸适配体结合时反应液中的荧光强度不同，通过检测荧光强度就能实现对生物分子快速、定量的检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)将核酸适配体分别与不同浓度的待检测生物分子的标准品在微孔板的孔板内混匀，缓冲液为：10mmol/L Tris，120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，20mmol/L CaCl₂，pH 8.5；反应体系内核酸适配体的浓度为0.1～10纳摩尔/升；反应时间为5-10分钟；

(2)加入与核酸适配体的序列互补的寡核酸链，反应体系内寡核酸链的浓度为0.1～10纳摩尔/升；反应时间为5-10分钟；

(3)加入非标记荧光染料PicoGreen，其在反应体系内浓度根据生产商的推荐值确定；反应15分钟后，用酶标仪或荧光分光光度计检测非标记荧光染料PicoGreen的荧光强度，激发波长为480nm，发射波长为520nm；

(4)根据待检测生物分子的标准品浓度和非标记荧光染料PicoGreen释放的荧光强度拟合曲线；

(5)以未知浓度的待检样品替换标准品，按照步骤(1)-(3)进行操作，检测非标记荧光染料PicoGreen释放的荧光强度；然后根据步骤(4)拟合的标准品的曲线，计算待检样品的浓度。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述待检测的生物分子是微生物、蛋白质、多糖、多肽、毒素或化学药物中的任意一种。