CN105586409B - 黄曲霉毒素b2的检测方法及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测黄曲霉毒素B2的方法及试剂盒，该方法包括如下步骤：（A）使黄曲霉毒素B2核酸适体Apt与单链信号探针ssDNA杂交，形成杂交链；（B）使该杂交链与待测样品反应，当待测样品中有黄曲霉毒素B2存在时，杂交链与黄曲霉毒素B2反应释放出单链信号探针ssDNA；（C）利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用外切酶，将双链DNA水解成单核苷酸而除去双链DNA，此时体系中留下单链信号探针ssDNA；（D）在ssDNA诱导下，银离子还原生成近红外荧光银纳米簇；检测体系荧光强度，从而测定待测样品中的黄曲霉毒素B2的含量。该方法具有高灵敏度，操作简单，低成本等特点。
Description
技术领域
本发明涉及纳米生物传感以及生物检测领域，具体地说，是提供一种黄曲霉毒素B2的检测方法及检测试剂盒。
背景技术
黄曲霉毒素是黄曲霉、寄生曲霉等产生的代谢产物。黄曲霉毒素广泛存在于土壤、大豆、稻谷、玉米、通心粉、调味品、牛奶及其制品、食用油、肉类（鱼）制品、花生和核桃中等动植物和各种坚果中，特别是花生和核桃中。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为1类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质，对人畜危害极大，尤其是黄曲霉毒素B类，是目前已知毒性最强和最强致癌物之一。当人摄入黄曲霉毒素量大时，可发生急性肝炎、出血性坏死等急性中毒，甚至死亡；当微量持续摄入，可造成慢性中毒，生长障碍，致癌、致畸等。黄曲霉毒素在农产品中几乎无法避免，不想饿死的人类也只好无奈地吃下一些，尚若食品中黄曲霉毒素含量超出一定标准，就会对人的健康造成严重威胁。因此，有必要建立高选择性、高灵敏的黄曲霉毒素检测方法。
目前国内外研究主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、免疫亲和柱法以及酶联免疫法等。TLC 法的特异性较差，灵敏度也相对较差，所需标准品浓度较高，潜在的污染性较高。HPLC 法需要具有专门操作技术的人员才能进行检测，技术要求高；净化柱消耗较多，检测成本较高，免疫亲和柱特异性较好，但仍然需要专门技术人员才能胜任检测工作，检测技术要求高。免疫法具有操作简便、快捷、污染较小、灵敏度也较高等许多优势，但通常需要用到价格昂贵的酶标试剂、酶、抗原、抗体等生物试剂，而且这些生物试剂也很易失活。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种检测黄曲霉毒素B2的方法，该方法包括如下步骤：
（A）使黄曲霉毒素B2核酸适体Apt与单链信号探针DNA（Sp）杂交，形成杂交链；
（B）使该杂交链与待测样品作用，当待测样品中有黄曲霉毒素B2存在时，杂交链选择性地与黄曲霉毒素B2反应释放出单链信号探针Sp；
（C）消除杂交链的干扰，利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用外切酶，将双链DNA水解成单核苷酸而除去双链DNA，留下单链信号探针Sp；
（D）利用黄曲霉毒素B2核酸适体-黄曲霉毒素B2结合体不能诱导银离子还原成近红外荧光银纳米簇，只有单链信号探针Sp能诱导生成具有强荧光的近红外银纳米簇，检测体系中荧光强度，从而测定待测样品中的真菌毒素黄曲霉毒素B2的含量。
所述银离子还原检测体系包括先后添加的银离子和使银离子迅速还原成近红外荧光银纳米簇的硼氢化物还原剂，例如硼氢化钠。步骤（D）的检测例如包括依次先后向体系中加入银离子溶液和硼氢化钠溶液，反应后生成近红外荧光银纳米簇。
所述黄曲霉毒素B2核酸适体为
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGCTGACACCCTGGACCTTGGGATTCCGGAAGTTTTCCGGTACCTATGCGTGCTACCGTGA-3’。
所述单链信号探针DNA为5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCCTCACGGTACCACGC-3’。
本发明的检测原理如下：先让Apt与Sp杂交（下划线部分）；当有黄曲霉毒素B2存在时，杂交链与黄曲霉毒素B2反应释放出Sp； 体系中存在Apt-Sp(剩余的)，Apt-黄曲霉毒素B2和Sp。Apt-黄曲霉毒素B2不能诱导银离子还原生成近红外荧光的银纳米簇，对测定无干扰；杂交链可能有干扰；为了消除杂交链的干扰：a. 利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，b.用核酸外切酶，将双链DNA水解成单核苷酸而除去双链DNA。此时体系中只留下可诱导生成近红外荧光的银纳米簇的Sp，通过检测体系荧光强度，从而可以测定真菌毒素黄曲霉毒素B2的含量。由于消除体系中背景荧光的干扰，可以提高检测的灵敏度和精度。
本发明另外提供了一种检测黄曲霉毒素B2的试剂盒，其至少包括：黄曲霉毒素B2核酸适体、可与黄曲霉毒素B2核酸适体杂交的单链信号探针DNA、DNA扩增体系、核酸外切酶、银离子还原检测体系。
所述黄曲霉毒素B2核酸适体为5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGCTGACACCCTGGACCTTGGGATTCCGGAAGTTTTCCGGTACCTATGCGTGCTACCGTGA-3’。
所述的单链信号探针DNA为5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCCTCACGGTACCACGC-3’。
所述DNA扩增体系包括缓冲溶液、三磷酸脱氧单核苷酸混合溶液（dNTP）和Phi29DNA 聚合酶；所述缓冲溶液由Tris-HCl、MgCl2、 (NH4)2SO4组成。
所述核酸外切酶为Exo III核酸外切酶。
所述的银离子还原检测体系中的还原剂为硼氢化物。
所述硼氢化物为硼氢化钠。
本发明还提供了一种可用于检测黄曲霉毒素B2的黄曲霉毒素B2核酸适体，其碱基序列为5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGCTGACACCCTGGACCTTGGGATTCCGGAAGTTTTCCGGTACCTATGCGTGCTACCGTGA-3’。
本发明的优点
根据本发明的检测方法和试剂盒，可以消除干扰，提高了黄曲霉毒素B2的检测灵敏度和精度。
附图说明
图1为Sp-Ag 纳米簇荧光与黄曲霉毒素B2的浓度关系图。
具体实施方式
实施例1
一种检测黄曲霉毒素B2的试剂盒至少包括：黄曲霉毒素B2核酸适体、单链信号探针DNA、DNA扩增体系、核酸外切酶、银离子还原检测体系。黄曲霉毒素B2核酸适体为5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGCTGACACCCTGGACCTTGGGATTCCGGAAGTTTTCCGGTACCTATGCGTGCTACCGTGA-3’。单链信号探针DNA为5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCCTCACGGTACCACGC-3’。DNA扩增体系包括缓冲溶液、dNTP 和 Phi29 DNA 聚合酶。所述缓冲溶液由Tris-HCl、MgCl2、 (NH4)2SO4组成。核酸外切酶为Exo III核酸外切酶。所述的银离子还原检测体系中的还原剂为硼氢化物还原剂(如硼氢化钠等)。
实施例2
一种检测黄曲霉毒素B2的方法，具体操作过程如下：
将各DNA储备液在95℃ 下经加热处理5分钟，使用前，并在室温下放置30分钟。然后，分别取含3.0 μmol 黄曲霉毒素B2核酸适体Apt的杂交缓冲溶液40 μL和3.0 μmol信号探针DNA（Sp）的杂交缓冲溶液40 μL 置于2ml 离心管中，在37℃下杂交1小时，生成黄曲霉毒素B2核酸适体-信号探针杂交物（Apt -Sp）。
在37℃下，分别依次将浓度为0~0.50 ng/mL的黄曲霉毒素B2添加到Apt-Sp溶液中，黄曲霉毒素B2与黄曲霉毒素B2核酸适体反应，生成核酸适体-黄曲霉毒素B2，释放出Sp。这时，体系中有Sp、剩余（未反应的）AP-Sp和核酸适体-黄曲霉毒素B2等物质。
加入10 μL 缓冲溶液（缓冲溶液组成为50mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2，10 mM(NH4)2SO4, pH 7.5 ），然后加入dNTP (10 mM) 18 µL。再向体系中加入2µL Phi29 DNA 聚合酶 (10 u/µl), 在37℃下反应15分钟，使得以黄曲霉毒素B2核酸适体-信号探针杂交序列（Ap-Sp） 为摸板扩增成双链DNA。在65℃下保持10分钟使Phi29 DNA去活。
再向该反应体系中加入2μL Exo III核酸外切酶（20 u/μL），在37℃下反应30分钟，使选择性地将双链DNA水解成单核苷酸而除去双链DNA，单链探针Sp不水解而保留下来。
向反应液中加入25 μL 1 mmol 硝酸银和180μL柠檬酸钠缓冲液（10 mM，pH7.0）。然后，混合物在室温下避光或暗室中放置10分钟后，在快速搅拌下，加入100μL浓度为500μM的新制备的硼氢化钠溶液。然后在45℃下反应5min。将溶液转移至微量比色皿，测定体系荧光强度，进行黄曲霉毒素B2的定量测定，结果如图1所示。
线性范围0.008–0.20 ng/mL，检测限5pg/mL，回收率在96.5~106.2%。其它真菌毒素、维生素C、葡萄糖等生物小分子对黄曲霉毒素B2的检测无干扰。
<110> 湖南科技大学
<120>黄曲霉毒素B2的检测方法及检测试剂盒
<160> 2
<210> 1
<211> 79
<212> DNA
<213>黄曲霉毒素B2核酸适体
<400> 1
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGCTGACACCCTGGACCTTGGGATTCCGGAAGTTTTCCGGTACCTATGCGTGCTACCGTGA-3’
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 单链信号探针
<400> 2
5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCCTCACGGTACCACGC-3’
Claims (6)
1.一种黄曲霉毒素B2的检测方法，其特征是，该方法包括如下步骤：
(A)黄曲霉毒素B2核酸适体Apt与单链信号探针DNA Sp杂交，形成杂交链；
(B)使该杂交链与待测样品作用，当待测样品中有黄曲霉毒素B2存在时，杂交链选择性地与黄曲霉毒素B2反应释放出单链信号探针DNA Sp；
(C)消除杂交链的干扰，利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用外切酶，将双链DNA水解成单核苷酸而除去双链DNA，留下单链信号探针DNA Sp；
(D)利用黄曲霉毒素B2核酸适体-黄曲霉毒素B2结合体不能诱导银离子还原成近红外荧光银纳米簇，只有单链信号探针DNA Sp能够诱导银离子还原生成强荧光的近红外银纳米簇的原理，检测体系荧光强度，从而测定待测样品中的真菌毒素黄曲霉毒素B2的含量；
所述黄曲霉毒素B2核酸适体为5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGCTGACACCCTGGACCTTGGGATTCCGGAAGTTTTCCGGTACCTATGCGTGCTACCGTGA-3’；
所述的单链信号探针DNA Sp为5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCTCACGGTACCACGC-3’。
2.一种检测黄曲霉毒素B2的试剂盒，其特征是，其至少包括：黄曲霉毒素B2核酸适体、单链信号探针DNA Sp、DNA扩增体系、外切酶、银离子还原检测体系；所述黄曲霉毒素B2核酸适体为5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGCTGACACCCTGGACCTTGGGATTCCGGAAGTTTTCCGGTACCTATGCGTGCTACCGTGA-3’；所述的单链信号探针DNASp为5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCTCACGGTACCACGC-3’。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征是，所述DNA扩增体系包括缓冲溶液、dNTP和Phi29 DNA聚合酶；所述缓冲溶液由Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4组成。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征是，所述核酸外切酶为Exo III核酸外切酶。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征是，所述的银离子还原检测体系中的还原剂为硼氢化物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征是，所述硼氢化物为硼氢化钠。
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