CN108251427B - 黄曲霉毒素b2适配体亲和柱及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种黄曲霉毒素B2适配体亲和柱及其制备方法，该亲和柱以溴化氰修饰的琼脂糖为载体，然后将能够高亲和力、高特异性识别黄曲霉毒素B2的核酸适配体与载体进行共价偶联，偶联后的黄曲霉毒素B2适配体复合载体装填亲和柱。该亲和柱主要用于对于食品、饲料、牛奶、血样以及中药等其他多种样本中黄曲霉毒素B2的纯化及净化，以利于后期对样本中黄曲霉毒素B2的高效液相色谱和荧光检测。

Description

黄曲霉毒素B2适配体亲和柱及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域，具体地说，涉及一种黄曲霉毒素B2适配体亲和柱及其制备方法与应用。
背景技术
黄曲霉毒素B2(Aflatoxin B2,AFB2)是由真菌属的黄曲霉和寄生曲霉等产生的一类结构相似的有毒次生代谢物，具有极强的致癌、致畸性和致突变作用，是迄今发现的最稳定的一种真菌毒素，一般食品加工条件下不易破坏，因此给消费者的饮食安全埋下了巨大的隐患。全世界每年约有25％的食物在生产、加工、运输、贮藏等各环节可能受到黄曲霉毒素的污染，由于黄曲霉毒素对人类身体健康危害的严重性，许多国家和国际组织已对黄曲霉毒素在食品或中药中的残留量做出了限量规定。欧盟规定花生及其制品中黄曲霉毒素(B1，B2，G1和 G2)总量水平不得超过4μg/kg，黄曲霉毒素B1不得超过2μg/kg。我国规定大米、食用油中黄曲霉毒素的允许量标准为(B1+B2+G1 +G2)不得超过10ng/g，2015版《中国药典》收载的19味药材及其饮片品种项下增加“黄曲霉毒素”检查项目，限度为黄曲霉毒素(B1，B2，G1和G2)总量不得过10μg/kg”。由于黄曲霉毒素B2危害较大，因而寻找一种简单、快速、准确、经济、特异性的前处理方法，消除基质干扰，对于研究黄曲霉毒素B2的污染状况具有重要意义。
目前黄曲霉毒素B2检测方法有薄层色谱法，高效液相色谱法、酶联免疫吸附法，毛细管电泳法、液质联用法等。其中薄层色谱法是最早使用也是最广泛使用的检测黄曲霉毒素B2的方法，其优点是适合于没有经过专门培训的人员操作，且成本低、无需价格昂贵的仪器。但是，薄层色谱法的样品处理繁琐，实验过程复杂，所需检测周期较长，容易受到杂质的干扰。测定时用目测半定量，存在主观影响较大，灵敏度不高等缺点，已远远不能满足现代检测要求。
酶联免疫吸附法具有检测特异性好、灵敏度高、并且检测成本较低的优点，适用于基层机构大量样品的筛选和普查，可以大大节省时间和费用。酶联免疫吸附法的主要问题是容易造成假阳性。因此，主要用于基层的筛查检测。
高效液相色谱法、毛细管电泳法和液质联用法等仪器分析方法具有准确度高、灵敏性强、可微量测定等优点，是目前常用的食品中毒素检测的方法。但因其对样品纯度要求较高，需要经过一些前处理过程，导致检测成本高、周期长，无法满足大批量样品快速筛选的要求。而传统的前处理技术有免疫亲和柱、多功能净化柱等，这些净化柱价格较贵，且多为一次性的。因此，建立高选择、快速有效的样品前处理技术已成为黄曲霉毒素B2检测分析中亟需解决的重要问题。
适配体本质上是具有特定复杂三维结构并能特异性结合靶标的一段脱氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)序列(10～100个碱基)。单链的核酸序列可以形成二级结构，从而对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。通过构建单链随机寡核苷酸文库，利用指数富集配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponentialenrichment，SELEX)进行多次的富集和筛选，体外优选出能特异性与靶标高度亲和的核酸适配体，从而避免了体内免疫反应带来的困难。适配体作为一种在体外人工合成的、与抗体功能类似的新型分子，与主流的抗体技术相比，其研究还处于起步阶段，但是已经表现出一些有别于抗体的优势，如批间稳定性一致，易修饰，无免疫原性等。
基于适配体的亲和柱是一种新型高效的样品前处理技术。它的原理是利用适配体对靶分子的选择性吸附来实现对复杂样品中靶分子的提取和净化，这种吸附是可逆的。适配体的亲和柱结合常规仪器分析已成为真菌毒素分析的一个重要发展方向。
发明内容
本发明的目的是提供黄曲霉毒素B2适配体亲和柱及其制备方法。
本发明的另一目的是提供所述黄曲霉毒素B2适配体亲和柱在富集和纯化，以及净化样品中黄曲霉毒素B2中的应用。
本发明的构思如下：将高特异性、高亲和力的黄曲霉毒素B2的适配体通过C7或C6间接臂进行氨基化修饰后与溴化氰修饰的载体通过共价键进行偶联。经过洗涤和封闭得到黄曲霉毒素B2的特异性偶联胶。偶联胶装柱后组装成高亲和力的黄曲霉毒素B2适配体亲和柱。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种黄曲霉毒素B2适配体特异性DNA，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供所述黄曲霉毒素B2适配体特异性DNA在制备黄曲霉毒素B2适配体亲和柱中的应用。
本发明还提供一种黄曲霉毒素B2适配体亲和柱，所述亲和柱的填料是以溴化氰修饰的琼脂糖(如Sepharose 4B)为载体，然后将所述黄曲霉毒素B2适配体特异性DNA与载体进行共价偶联得到的。
其中，用于制备黄曲霉毒素B2适配体亲和柱的所述黄曲霉毒素B2适配体特异性DNA是经过化学修饰的适配体序列，修饰方式包括但不限于氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰或生物素修饰。
优选地，所述黄曲霉毒素B2适配体特异性DNA是经过氨基修饰的适配体序列(3’或5’端修饰)，修饰方法如下：在核酸适配体的3’或5’端通过共价键连接C7间接臂(-(CH2)7-)或C6间接臂(-(CH2)6-)，然后在C7间接臂或C6间接臂的末端通过共价键修饰氨基，从而得到氨基修饰的适配体。
本发明的黄曲霉毒素B2适配体亲和柱，可按照如下方法制备：
1)溴化氰修饰的琼脂糖的制备：在通风橱内将琼脂糖与等体积水混合，并加入配备有pH电极和磁力搅拌器的反应器中，按每mL琼脂糖溶液50～300mg溴化氰的量向上述琼脂糖溶液中加入溴化氰，用 NaOH调pH值至11±0.1，整个反应pH值控制在11±0.1，温度控制在 20℃±5℃，反应在3～l2min完成；反应结束后，将等体积冰屑迅速加入到上述反应液中，并迅速倾入布氏漏斗，用琼脂糖溶液体积10～15 倍量的冷缓冲液(200mM Na2HPO4,5mMMgCl2，pH 8.0)抽滤洗涤，其表面的羟基与溴化氰反应，即得到溴化氰修饰的琼脂糖；
2)载体的溶胀和洗涤：以溴化氰修饰的琼脂糖为载体，将30-100 mg载体粉末用1mM盐酸1-5mL浸泡0.5-1小时进行溶胀；溶胀后的载体用1mM盐酸迅速反复洗涤3-6次，每次盐酸用量1-5mL，然后用蒸馏水洗涤2-5次，每次蒸馏水用量1-5mL，最后用Na2HPO4缓冲液洗涤 2-5次，每次缓冲液用量1-5mL；
3)适配体复性：取1-5OD的3’或5’端氨基修饰的黄曲霉毒素B2适配体特异性DNA溶解于Na2HPO4缓冲液200-1000μL中，于75℃复性3-5min，然后室温放置15-60min；
4)偶联：向步骤2)洗涤后的载体中加入步骤3)复性好的适配体溶液200-1000μL，于30℃摇床震荡过夜；
5)封闭：步骤4)所得偶联产物依次用200mM pH 8.0的Na2HPO4水溶液洗涤2-5次，每次1-5mL，然后用0.1M pH 8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤2-5次，每次1-5mL，然后加入0.1M pH8.0的Tris-HCl溶液2-5 mL，于30℃摇床震摇反应1-6h，封闭剩余活性位点，得到载体-适配体偶联胶；
6)洗涤：将上述载体-适配体偶联胶依次用醋酸缓冲液和Tris-HCl 缓冲液先后交替洗涤3-5次，每次洗涤醋酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液的用量为1-5mL，除去未偶联的适配体；洗涤后的偶联胶用1-5mL结合缓冲液重悬，所得偶联胶悬液准备装柱；其中，所述醋酸缓冲液为0.1 M醋酸-醋酸钠水溶液，其中含有0.5M NaCl，pH 4.0；所述Tris-HCl 缓冲液浓度为0.1M，其中含有0.5M NaCl，pH 8.0；所述结合缓冲液中含有10mM Tris，120mM NaCl，5mMKCl和5mM MgCl2，pH 7.5；
7)装柱：取容积1-5mL的固相萃取柱(如SPE柱管)，垫好下筛板，用上述偶联胶悬液装柱，至胶高度为1cm，加入0.05％NaN3溶液 0.5-3mL，于4℃保存。
其中，步骤2)-4)所述Na2HPO4缓冲液为200mM Na2HPO4+5mM MgCl2，pH 8.0。
优选地，前述方法中步骤2)-7)如下：
2)载体的溶胀和洗涤：以溴化氰修饰的琼脂糖为载体，将60mg 载体粉末用1mM盐酸2mL浸泡1小时进行溶胀；溶胀后的载体用1 mM盐酸洗涤6次，每次盐酸用量1mL，然后用蒸馏水洗涤2次，每次蒸馏水用量1mL，最后用Na2HPO4缓冲液洗涤2次，每次缓冲液用量 1mL；
3)适配体复性：取1OD的3’或5’端氨基修饰的黄曲霉毒素B2适配体特异性DNA溶解于Na2HPO4缓冲液200μL中，于75℃复性5min，然后室温放置30min；
4)偶联：向步骤2)洗涤后的载体中加入步骤3)复性好的适配体溶液200μL，于30℃摇床震荡过夜；
5)封闭：步骤4)所得偶联产物依次用200mM pH8.0的Na2HPO4水溶液洗涤3次，每次1mL，然后用0.1M pH 8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤2次，每次1mL，然后加入0.1M pH 8.0的Tris-HCl溶液2mL，于30℃摇床震摇反应2h，封闭剩余活性位点，得到载体-适配体偶联胶；
6)洗涤：将上述载体-适配体偶联胶依次用醋酸缓冲液和Tris-HCl 缓冲液先后交替洗涤5次，每次洗涤醋酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液的用量为2mL，除去未偶联的适配体；洗涤后的偶联胶用5mL结合缓冲液重悬，所得偶联胶悬液准备装柱；其中，所述醋酸缓冲液为0.1M 醋酸-醋酸钠水溶液，其中含有0.5M NaCl，pH 4.0；所述Tris-HCl缓冲液浓度为0.1M，其中含有0.5M NaCl，pH 8.0；所述结合缓冲液中含有10mM Tris，120mM NaCl，5mM KCl和5mM MgCl2，pH 7.5；
7)装柱：取容积1mL的固相萃取柱，垫好下筛板，用上述偶联胶悬液装柱，至胶高度为1cm，加入0.05w/v％NaN3溶液0.5mL，于 4℃保存。
本发明所述固相萃取柱及筛板的材质可以是聚丙烯、聚苯乙烯、多孔聚苯乙烯或交联多孔聚苯乙烯等材料。优选地，筛板的孔径为10 μm。
本发明黄曲霉毒素B2适配体亲和柱的结构示意图如图1所示，其工作原理如图2所示。
本发明还提供所述黄曲霉毒素B2适配体亲和柱在富集和纯化样品中黄曲霉毒素B2中的应用。
本发明还提供所述黄曲霉毒素B2适配体亲和柱在净化样品中黄曲霉毒素B2中的应用。
本发明所述的样品可选自粮食、饲料、牛奶及乳制品、水产、血液、尿液、水和中药等。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(一)该亲和柱具有操作简便，价格低廉，纯化黄曲霉毒素B2效率高，可重复使用的优点。样品经过简单的提取后，即可上柱进行净化，一次净化能够除去绝大部分干扰物。净化后的提取液可用高效液相色谱等仪器进行分析检测。
(二)本发明充分利用了核酸适配体高特异性、高亲和力的优点，利用黄曲霉毒素B2适配体特异性结合样品中的黄曲霉毒素B2，降低了基于抗体的免疫亲和柱经常遇到的交叉反应，亲和柱的净化效率大幅度提高。核酸适配体受操作环境和有机溶剂的影响较小，尤其适合真菌毒素类脂溶性物质的纯化。相比之下，由于免疫亲和柱中的抗体不耐有机溶剂，有机溶剂的存在常常会造成抗体的失活而使亲和柱效率降低。此外，由于有机溶剂可能导致抗体失活，因此免疫亲和柱通常为一次性使用。而核酸适配体亲和柱可以耐受有机溶剂，可重复使用多次，大幅度降低了使用成本。
(三)本发明使用的核酸适配体通过体外化学合成法获得，能够保证序列的正确性、批间的一致性，大幅度降低了不同批次间的差异。相比之下，不同批次的抗体来自于不同的小鼠或者兔子，导致抗体间质量差异较大，从而使免疫亲和柱的质量存在批间差异。
(四)溴化氰修饰的琼脂糖发生共价偶联，偶联产物稳定，且偶联率高。
(五)本发明制备的适配体亲和柱以核酸适配体代替抗体作为识别元件，与传统的免疫亲和柱相比，具有成本低，易于保存，性质稳定，批间差异小的优点。样品提取液经适配体亲和柱净化后，所得黄曲霉毒素B2纯度高，后续不用再做其他的纯化处理，可以直接用于高效液相色谱等仪器检测，节省了操作者的时间和费用。
附图说明
图1为本发明黄曲霉毒素B2适配体亲和柱的结构示意图；其中， 1-进样口塞；2-柱体；3-上筛板(上方筛板)；4-载体填料；5-下筛板 (下方筛板)；6-出样堵口。
图2为本发明黄曲霉毒素B2适配体亲和柱的净化原理。
图3为本发明实施例2中花生样品的HPLC-FLD色谱图，未净化的提取液(A)和适配体亲和柱净化液(B)及UPLC-MS/MS确证结果(C和 D)。
图4为本发明实施例3中适配体亲和柱(AAC)和免疫亲和柱 (IAC)的柱容量比较；其中，A表示AAC和IAC的上样量与洗脱量之间的线性回归；B表示其回收率。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1利用氨基修饰的黄曲霉毒素B2适配体制备适配体亲和柱
1、溴化氰修饰的琼脂糖的制备。以琼脂糖Sepharose 4B为载体，用溴化氰进行活化。
在通风橱内将琼脂糖与等体积水混合，并加入配备有pH电极和磁力搅拌器的反应器中，按每mL琼脂糖溶液100mg溴化氰的量向上述琼脂糖溶液中加入溴化氰，用NaOH调pH值至11，整个反应pH值控制在11，温度控制在20℃左右，反应在10min完成；反应结束后，将等体积冰屑迅速加入到上述反应液中，并迅速倾入布氏漏斗，用琼脂糖溶液体积10倍量的冷缓冲液(200mM Na2HPO4,5mM MgCl2，pH 8.0) 抽滤洗涤，其表面的羟基与溴化氰反应，即得到溴化氰修饰的琼脂糖。
2、氨基修饰的黄曲霉毒素B2适配体(SEQ ID NO:1)的制备。
在核酸适配体的3’通过共价键连接C7间接臂(-(CH2)7-)，然后在 C7间接臂的末端通过共价键修饰氨基，从而得到氨基修饰的适配体。
3、载体的溶胀和洗涤：取60mg溴化氰修饰的琼脂糖干粉，加入 2mL 1mM的盐酸，溶胀1小时；溶胀后的载体依次用1mL HCl(1 mM，pH 3.0)迅速反复洗涤6次，1mL蒸馏水洗涤2次和1mL Na2HPO4缓冲液(200mM Na2HPO4 5mM MgCl2，pH8.0)洗涤2次。
4、适配体复性：取1OD的3′氨基修饰的适配体溶解于200μL Na2HPO4缓冲液(200mMNa2HPO4 5mM MgCl2，pH8.0)中，75℃复性 5min，室温放置30min。
5、偶联：将复性后的适配体溶液200μL加入到洗涤后的载体中， 30℃摇床震荡过夜。
6、封闭：将偶联产物依次用1mL Na2HPO4(200mM，pH8.0)洗涤3次，1mL Tris-HCl缓冲液(0.1M，pH 8.0)洗涤2次，然后加入1mL Tris-HCl缓冲液(0.1M，pH 8.0)，30℃摇床震摇反应2h封闭剩余活性位点，得到载体-适配体偶联胶。
7、洗涤：将封闭好的载体-适配体偶联胶用2mL醋酸缓冲液(0.1 M醋酸-醋酸钠，pH4.0，含0.5M NaCl)和2mL Tris-HCl缓冲液 (0.1M，pH 8.0，含0.5M NaCl)先后交替洗涤5次，除去未偶联的适配体。
8、装柱：将偶联产物用5mL结合缓冲液(10mM Tris，120mM NaCl，5mM KCl，5mMMgCl2，pH7.5)重悬，然后装入空的SPE柱管中。
1)取空的1mL SPE柱管，垫好下方筛板(孔径10μm)，然后加入1mL结合缓冲液，使其自然流干。
2)加下方出样口堵头，在SPE柱管中加入上述处理后的偶联产物，静止5min，使载体自然沉降。
3)加入上方筛板(孔径10μm)，并按压筛板，使其到达载体上方。
4)拔掉出样口堵头，用注射器取5mL结合缓冲液，将注射器接在进样口上，缓慢的将结合缓冲液注入亲和柱中，使出液速度保持在 1-2滴/秒，直至全部液体注入亲和柱。
5)加入0.05％NaN3(w/v)缓冲液0.5mL，并加上方进样口堵头后，于4℃冰箱保存。
实施例1制备的亲和柱结构示意图如图1所示。
实施例2利用黄曲霉毒素B2适配体亲和柱纯化花生样品中的黄曲霉毒素B2及其检测
本实施例通过向正常的花生样品定量加入黄曲霉毒素B2标准品，然后用实施例1制备的黄曲霉毒素B2适配体亲和柱进行净化，净化后用高效液相色谱-荧光检测器检测，测定回收率。具体如下：
1、花生样品处理
1)将花生样品粉碎。
2)分别按照每克样品0.5，5，50μg的标准，向粉碎后的花生样品中添加黄曲霉毒素B2标准品。
3)称取5g样品，加入25mL甲醇-水(70：30，v/v)，置于均质匀浆机上11000rpm高速匀浆3min。
4)用0.45μm针筒式滤膜过滤。
5)取5mL滤液，40℃氮气吹至近干，加入0.5mL甲醇-水(70:30， v/v)复溶，并用结合缓冲液定容至5mL。
6)取上述复溶液用于上样净化，检测。
2、取出黄曲霉毒素B2适配体亲和柱，打开进样口塞，进样口与注射器针筒连接，注射器接入到气控操作架上。
3、打开出样口塞，用5mL结合缓冲液平衡亲和柱，调节气孔操作架气泵压力，使液体以3滴/秒的流速流出。
4、将上述复溶液加入亲和柱中调节流量1-2滴/秒，直至样品全部流出亲和柱。
5、用1mL结合缓冲液洗涤亲和柱。
6、加入1mL甲醇，收集洗脱产物。
7、洗脱产物用高效液相色谱-荧光检测器检测。
8、高效液相色谱检测结果见表1，色谱图及UPLC-MS/MS检测结果见图3。
表1花生中黄曲霉毒素B2含量HPLC-FLD检测结果
Figure BDA0001495333510000101
可见，花生样品经黄曲霉毒素B2适配体亲和柱纯化后，用高效液相色谱-荧光检测器(HPLC-FLD)可以检测到黄曲霉素B2。从检测结果可以看出，在1g的粉碎后花生样品中加入0.5，5和50μg的黄曲霉毒素B2，用本发明的适配体亲和柱回收率在75.88-89.58％之间。
实施例3黄曲霉毒素B2适配体亲和柱重复使用性和柱容量的考察
本实施例利用黄曲霉毒素B2的标准品，并用实施例1制备的黄曲霉毒素B2适配体亲和柱进行纯化。亲和柱上保留的黄曲霉毒素B2用甲醇洗脱后，用高效液相色谱-荧光检测器检测其浓度。亲和柱重新平衡后重复上样和洗脱，测定洗脱的黄曲霉素B2的浓度。主要目的是测试黄曲霉毒素B2适配体亲和柱的重复使用性和柱容量。
1、配制不同溶度的黄曲霉毒素B2标准品。
2、取出黄曲霉毒素B2适配体亲和柱，打开进样口塞，进样口与注射器针孔连接，注射器介入到气控操作架上。
3、打开出样口塞，用5mL结合缓冲液平衡亲和柱，调节气孔操作架气泵压力，使液体以3滴/秒的速度流出。
4、取5mL上述配制的黄曲霉毒素B2标准品，总量0.5-125ng，加入亲和柱中，调节流量至1-2滴/秒。直至样品全部流出亲和柱。
5、用1mL结合缓冲液洗涤亲和柱。
6、加入1mL甲醇，收集洗脱产物。
7、洗脱产物用高效液相色谱HPLC-FLD检测。
8、亲和柱用5mL结合缓冲液洗涤。
9、再次上样5mL上述配制的黄曲霉毒素B2标准品，总量5ng。
10、按照上述操作洗涤及洗脱，洗脱产物用高效液相色谱 HPLC-FLD检测其浓度。
11、重复上述步骤8-10三次，检测洗脱液中黄曲霉毒素B2的量。
12、计算黄曲霉B2适配体亲和柱的柱容量及总共5次的黄曲霉毒素B2适配体亲和柱纯化的回收率。
13、同时考察市售商品化的免疫亲和柱(北京康源泰博生物科技有限公司，IAC001A)的重复使用性和柱容量，并与该适配体亲和柱对比。
HPLC-FLD法如下：
Agilent 1260 HPLC高效液相色谱仪，色谱柱为Venusil MP C18 column(250×4.6mm i.d.,particle size 5μm)；柱温40℃；进样体40 μL；流速为0.8mL/min；.流动相为甲醇：水(55:45；v/v)等度洗脱。荧光检测器的激发波长为360nm，发射波长为440nm。
HPLC-FLD检测结果见表2。适配体亲和柱和免疫亲和柱的柱容量比较见图4。
表2适配体亲和柱和免疫亲和柱的重复使用性对比
Figure BDA0001495333510000121
可见，黄曲霉毒素B2适配体亲和柱重复使用5次后，其结合能力没有明显的降低。从上述结果可以看出，黄曲霉毒素B2适配体亲和柱的柱容量为84.60ng，能够满足实际样品检测的需要。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京农业质量标准与检测技术研究中心
<120> 黄曲霉毒素B2适配体亲和柱及其制备方法与应用
<130> KHP171117109.8F
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cactacagtc attacgcatc gggtaagcgg aactgaggag tgggagg 47

Claims (12)

1.黄曲霉毒素B2适配体特异性DNA，其特征在于，核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述黄曲霉毒素B2适配体特异性DNA在制备黄曲霉毒素B2适配体亲和柱中的应用。
3.黄曲霉毒素B2适配体亲和柱，其特征在于，所述亲和柱的填料是以溴化氰修饰的琼脂糖为载体，然后将权利要求1所述黄曲霉毒素B2适配体特异性DNA与载体进行共价偶联得到的。
4.根据权利要求3所述的亲和柱，其特征在于，所述黄曲霉毒素B2适配体特异性DNA是经过化学修饰的适配体序列，修饰方式包括氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰或生物素修饰。
5.根据权利要求4所述的亲和柱，其特征在于，所述黄曲霉毒素B2适配体特异性DNA是经过氨基修饰的适配体序列，修饰方法如下：在核酸适配体的3’或5’端通过共价键连接C7间接臂-(CH2)7-或C6间接臂-(CH2)6-，然后在C7间接臂或C6间接臂的末端通过共价键修饰氨基，从而得到氨基修饰的适配体。
6.权利要求5所述亲和柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)溴化氰修饰的琼脂糖的制备：将琼脂糖与等体积水混合，并加入配备有pH电极和磁力搅拌器的反应器中，按每mL琼脂糖溶液50～300mg溴化氰的量向上述琼脂糖溶液中加入溴化氰，用NaOH调pH值至11±0.1，整个反应pH值控制在11±0.1，温度控制在20℃±5℃，反应在3～l2min完成；反应结束后，将等体积冰屑迅速加入到上述反应液中，并迅速倾入布氏漏斗，用琼脂糖溶液体积10～15倍量的冷缓冲液抽滤洗涤，其表面的羟基与溴化氰反应，即得到溴化氰修饰的琼脂糖；
2)载体的溶胀和洗涤：以溴化氰修饰的琼脂糖为载体，将30-100mg载体粉末用1mM盐酸1-5mL浸泡0.5-1小时进行溶胀；溶胀后的载体用1mM盐酸洗涤3-6次，每次盐酸用量1-5mL，然后用蒸馏水洗涤2-5次，每次蒸馏水用量1-5mL，最后用Na2HPO4缓冲液洗涤2-5次，每次缓冲液用量1-5mL；
3)适配体复性：取1-5OD的3’或5’端氨基修饰的黄曲霉毒素B2适配体特异性DNA溶解于Na2HPO4缓冲液200-1000μL中，于75-95℃复性3-5min，然后室温放置15-60min；
4)偶联：向步骤2)洗涤后的载体中加入步骤3)复性好的适配体溶液200-1000μL，于30℃摇床震荡过夜；
5)封闭：步骤4)所得偶联产物依次用200mM pH 8.0的Na2HPO4水溶液洗涤2-5次，每次1-5mL，然后用0.1M pH 8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤2-5次，每次1-5mL，然后加入0.1M pH 8.0的Tris-HCl溶液2-5mL，于30℃摇床震摇反应1-6h，封闭剩余活性位点，得到载体-适配体偶联胶；
6)洗涤：将上述载体-适配体偶联胶依次用醋酸缓冲液和Tris-HCl缓冲液先后交替洗涤3-5次，每次洗涤醋酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液的用量为1-5mL，除去未偶联的适配体；洗涤后的偶联胶用1-5mL结合缓冲液重悬，所得偶联胶悬液准备装柱；其中，所述醋酸缓冲液为0.1M醋酸-醋酸钠水溶液，其中含有0.5M NaCl，pH 4.0；所述Tris-HCl缓冲液浓度为0.1M，其中含有0.5M NaCl，pH 8.0；所述结合缓冲液中含有10mM Tris，120mM NaCl，5mMKCl和5mM MgCl2，pH 7.5；
7)装柱：取容积1-5mL的固相萃取柱，垫好下筛板，用上述偶联胶悬液装柱，至胶高度为1cm，加入0.05w/v％NaN3溶液0.5-3mL，于4℃保存；
其中，步骤1)所述缓冲液以及步骤2)-3)所述Na2HPO4缓冲液为200mM Na2HPO4+5mMMgCl2，pH 8.0。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤7)所述固相萃取柱及下筛板的材质为聚丙烯或聚苯乙烯。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤7)所述固相萃取柱及下筛板的材质为多孔聚苯乙烯或交联多孔聚苯乙烯。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述下筛板的孔径为10μm。
10.权利要求3或4所述亲和柱在非诊断和治疗目的的富集和纯化样品中黄曲霉毒素B2中的应用。
11.权利要求3或4所述亲和柱在非诊断和治疗目的的净化样品中黄曲霉毒素B2中的应用。
12.根据权利要求10或11所述的应用，其特征在于，所述样品选自粮食、饲料、乳制品、水产、血液、尿液、水和中药。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109307667B (zh) * 2018-11-22 2020-02-07 山东农业大学 一种黄曲霉毒素b1的快速检测方法
CN109482153A (zh) * 2018-11-30 2019-03-19 广西科技大学 一种基于紫外共价交联的丝素固定化dna吸附剂制备方法及其在黄曲霉毒素消除中的应用
CN109781871B (zh) * 2018-12-05 2021-11-19 北京农业质量标准与检测技术研究中心 黄曲霉毒素b1和b2磁固相萃取材料及制备方法与应用
CN109833648B (zh) * 2019-01-15 2021-02-26 北京农业质量标准与检测技术研究中心 呕吐毒素及其衍生物适配体亲和柱及其制备方法与应用
CN110872588A (zh) * 2019-03-04 2020-03-10 江南大学 一种同时识别黄曲霉毒素b1、b2、g1、m1的适配体及其应用
CN110426515B (zh) * 2019-06-05 2022-09-16 江苏苏博生物医学科技南京有限公司 一种时间分辨荧光免疫层析技术检测污水中痕量毒品的试剂盒及其应用
CN115430464A (zh) * 2022-08-15 2022-12-06 河南工业大学 一种选择性降解真菌毒素的光催化剂、制备方法及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102517289A (zh) * 2011-11-25 2012-06-27 国家纳米技术与工程研究院 黄曲霉毒素b1核酸适体及其应用
CN104399283A (zh) * 2014-12-04 2015-03-11 江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所 黄曲霉毒素b1适配体亲和柱的制备方法
CN105586409A (zh) * 2016-01-21 2016-05-18 湖南科技大学 黄曲霉毒素b2的检测方法及检测试剂盒
CN106970172A (zh) * 2017-01-19 2017-07-21 北京美正生物科技有限公司 一种黄曲霉毒素适配体亲和柱及其制备方法和用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102517289A (zh) * 2011-11-25 2012-06-27 国家纳米技术与工程研究院 黄曲霉毒素b1核酸适体及其应用
CN104399283A (zh) * 2014-12-04 2015-03-11 江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所 黄曲霉毒素b1适配体亲和柱的制备方法
CN105586409A (zh) * 2016-01-21 2016-05-18 湖南科技大学 黄曲霉毒素b2的检测方法及检测试剂盒
CN106970172A (zh) * 2017-01-19 2017-07-21 北京美正生物科技有限公司 一种黄曲霉毒素适配体亲和柱及其制备方法和用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Selection, characterization and application of aptamers targeted to Aflatoxin B2;Xiaoyuan Ma等;《Food Control》;20140812;第47卷;第2节，第549页表1 *
Xiaoyuan Ma等.Selection, characterization and application of aptamers targeted to Aflatoxin B2.《Food Control》.2014,第47卷 *

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