CN112114074B - 乳铁蛋白适配体亲和柱及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种乳铁蛋白适配体亲和柱及其制备方法与应用。该亲和柱以N‑羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖为载体，将能够高亲和力、高特异性识别乳铁蛋白的核酸适配体与载体进行共价偶联，偶联后特异性亲和填料装填固相萃取柱。该亲和柱主要应用于样品中乳铁蛋白特异性识别和富集纯化，纯化后仍能保持乳铁蛋白的天然活性，该方法快速、简便、准确，亲和柱可重复使用，既可用于大型仪器检测前的样品前处理，也可用于乳铁蛋白的分离纯化，在化妆品、食品、动物生产、医疗等领域中具有广泛的应用前景。

Description

乳铁蛋白适配体亲和柱及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体地说，涉及一种乳铁蛋白适配体亲和柱及其制备方法与应用。
背景技术
乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)是一种相对分子量约为80KDa的非血红素铁结合性蛋白，主要存在于哺乳动物的乳汁当中，特别是初乳中乳铁蛋白含量较高。乳铁蛋白具有多种生物学功能，它不仅可以调节人体铁质转移，促进骨骼生长，而且具有抗菌、抗病毒、抗氧化、调节免疫等功能。目前，其已被认为是安全的食品添加剂，广泛应用在乳制品及相关的婴幼儿配方食品、特殊医学用途配方食品、保健食品和医药等领域。但迄今为止还没有关于乳铁蛋白的国家检测标准。常用的乳铁蛋白检测技术主要有：酶联免疫吸附法、毛细管电泳法、分光光度法、高效液相色谱法等。其中，高效液相色谱法具有分离效率高，选择性好，灵敏度高等优点，是目前食品检测领域应用最广泛的方法之一。因高效液相色谱对样品纯度要求较高，且乳制品及相关样品的基质成分相当复杂，故无法直接进行液相色谱检测，目前常用肝素亲和柱来分离纯化目标物，但肝素亲和柱价格昂贵，增加了检测成本。
核酸适配体是一小段体外筛选得到的寡核苷酸片段，能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合。适配体本质上是具有特定复杂三维结构并能特异性结合靶标的一段脱氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)序列(10～100个碱基)。单链的核酸序列可以形成二级结构，从而对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。通过构建单链随机寡核苷酸文库，利用指数富集配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands byexponential enrichment，SELEX)进行多次富集和筛选，体外优选出能特异性与靶标高度亲和的核酸适配体，从而避免了体内免疫反应带来的困难。适配体作为一种在体外人工合成的，与抗体功能类似的新型分子，与主流的抗体技术相比，其研究尚处于起步阶段，但已经表现出一些有别于抗体的优势，如批间稳定性一致，易修饰，无免疫原性等。
基于适配体的亲和柱是一种新型高效的样品前处理技术。它的原理是利用适配体对靶分子的选择性吸附来实现对复杂样品中靶分子的提取和净化，这种吸附是可逆的。适配体亲和柱纯化结合常规高效液相色谱检测目标物将成为重要的发展方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种乳铁蛋白适配体亲和柱及其制备方法与应用。
本发明的构思如下：将高特异性、高亲和力的乳铁蛋白的核酸适配体通过C7或C6间接臂进行氨基化修饰后与N-羟基琥珀酰亚胺(-NHS)修饰的载体通过共价键进行偶联。经过洗涤和封闭得到乳铁蛋白的特异性偶联胶。偶联胶装柱后组装成高亲和力的乳铁蛋白适配体亲和柱。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种乳铁蛋白的核酸适配体，核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
第二方面，本发明提供所述适配体在制备乳铁蛋白检测试剂或乳铁蛋白适配体亲和柱中的应用。
第三方面，本发明提供一种乳铁蛋白适配体亲和柱，所述亲和柱的填料是以N-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖为载体，然后将SEQ ID NO:1的适配体与载体进行共价偶联得到的。
优选地，所述适配体是经过氨基修饰的适配体序列，修饰方法如下：在核酸适配体的3’或5’端通过共价键连接C7间接臂-(CH2)7-或C6间接臂-(CH2)6-，然后在C7间接臂或C6间接臂的末端通过共价键修饰氨基，从而得到氨基修饰的适配体。
第四方面，本发明提供所述乳铁蛋白适配体亲和柱的制备方法，包括以下步骤：
1)载体的洗涤：取300μL N-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖置于离心管中，用1mM盐酸洗涤1-2次，每次1-2mL；
2)适配体复性：取1OD的5’端氨基修饰的乳铁蛋白适配体溶解于500μL MES缓冲液中，于92-96℃复性5-10min，然后室温放置30-60min；
3)偶联：向洗涤后的载体中加入复性好的适配体溶液，于20-30℃(优选25℃)摇床震荡反应0.5h；
4)封闭：偶联产物离心去除上清后，加入1mL封闭缓冲液，于20-30℃(优选25℃)摇床震摇反应1h，得到载体-适配体填料；
5)洗涤：将上述载体-适配体填料用清洗缓冲液洗涤(优选洗涤2次)，除去未偶联的适配体。洗涤后的偶联胶用1mL结合缓冲液重悬，所得偶联胶悬液准备装柱；
6)装柱：取容积1mL的固相萃取柱，垫好下筛板，用上述偶联胶悬液装柱，至胶高度为1-1.5cm，加入结合缓冲液0.5-3mL，于4℃保存。
所述MES缓冲液：0.1M MES,0.15M NaCl,pH 6.0；
所述封闭缓冲液：0.2％BSA,0.1M MES,0.15M NaCl,pH 6.0；
所述清洗缓冲液：50mM Tris-HCl,0.15M NaCl,pH 7.2；
所述结合缓冲液：137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4·12H2O,2mM NaH2PO4,1mMMgCl2,2mM CaCl2,pH 7.5。
前述的方法，步骤7)所述固相萃取柱及下筛板的材质可选自聚丙烯、聚苯乙烯、多孔聚苯乙烯或交联多孔聚苯乙烯。
优选地，下筛板的孔径为10μm。
第五方面，本发明提供所述乳铁蛋白适配体亲和柱或按照上述方法制备的亲和柱在富集和/或纯化样品中乳铁蛋白中的应用。
所述样品可选自乳制品(牛奶)、化妆品、食品、动物饲料、医药。
本发明乳铁蛋白适配体亲和柱的结构示意图见图1，工作原理见图2。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)该亲和柱具有操作简便，价格低廉，纯化乳铁蛋白效率高，可重复使用的优点。样品经过简单的提取后，即可上柱进行净化，一次净化能够除去绝大部分干扰物。净化后的提取液可用高效液相色谱等仪器进行分析检测，且保持乳铁蛋白的天然活性。
(二)本发明充分利用了核酸适配体高特异性、高亲和力的优点，利用乳铁蛋白适配体特异性结合样品中的乳铁蛋白，降低了基于抗体的免疫亲和柱经常遇到的交叉反应，亲和柱的净化效率大幅度提高。核酸适配体受操作环境和有机溶剂的影响较小，尤其适合各行业生产线现场的纯化。相比之下，由于免疫亲和柱中的抗体不耐有机溶剂，有机溶剂的存在常常会造成抗体的失活而使亲和柱效率降低。此外，由于有机溶剂可能导致抗体失活，因此免疫亲和柱通常为一次性使用。而核酸适配体亲和柱可以耐受多种缓冲液，可重复使用多次，大幅度降低了使用成本。
(三)本发明使用的核酸适配体通过体外化学合成法获得，能够保证序列的正确性、批间的一致性，大幅度降低了不同批次间的差异。相比之下，不同批次的抗体来自于不同的小鼠或者兔子，导致抗体间质量差异较大，从而使免疫亲和柱的质量存在批间差异。
(四)N-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖与氨基修饰的适配体发生共价偶联，偶联产物稳定，且偶联率高。
(五)本发明制备的适配体亲和柱以核酸适配体代替抗体作为识别元件，与传统的免疫亲和柱相比，具有成本低，易于保存，性质稳定，批间差异小的优点。样品提取液经适配体亲和柱净化后，所得乳铁蛋白纯度高，无需后续纯化处理，即可直接用于高效液相色谱等仪器检测，节约了时间成本和费用。
附图说明
图1为本发明乳铁蛋白适配体亲和柱的结构示意图。其中，1～6分别表示：1-进样口塞；2-柱体；3-上筛板(上方筛板)；4-载体填料；5-下筛板(下方筛板)；6-接样管。
图2为本发明乳铁蛋白适配体亲和柱的工作原理图。其中，a：适配体与琼脂糖的偶联示意图，b：适配体亲和柱的使用流程图。
图3为本发明较佳实施例中三条候选适配体的亲合力测定结果。
图4为本发明较佳实施例中适配体LAC1的亲合力测定结果。
图5为本发明较佳实施例中淋洗缓冲液种类的选择(n＝3)。
图6为本发明较佳实施例中0.01mol/L磷酸盐淋洗液体积的优化(n＝3)。
图7为本发明较佳实施例中乳铁蛋白标准品HPLC色谱图。
图8为本发明较佳实施例中牛奶样品经适配体亲和柱纯化后HPLC色谱图。
图9为本发明较佳实施例中适配体亲和柱对乳铁蛋白承载量的测定(n＝3)。
图10为本发明较佳实施例中适配体亲和柱(AAC)与肝素亲和柱(HAC)重复使用次数的比较。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的试剂：
N-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖购自GE Healthcare Life Sciences公司。
MES缓冲液：0.1M MES,0.15M NaCl,pH 6.0；
封闭缓冲液：0.2％BSA,0.1M MES,0.15M NaCl,pH 6.0；
清洗缓冲液：50mM Tris-HCl,0.15M NaCl,pH 7.2；
结合缓冲液：137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4·12H2O,2mM NaH2PO4,1mMMgCl2,2mM CaCl2,pH 7.5；
磷酸盐提取液：0.2M Na2HPO4·12H2O,pH 7.5；
淋洗缓冲液(磷酸盐淋洗液)：0.01M Na2HPO4·12H2O,pH 7.5；
磷酸盐洗脱液：0.05M Na2HPO4·12H2O,1M NaCl,pH 8.01。
实施例1乳铁蛋白核酸适配体的筛选及亲合力测定
利用SELEX技术体外优选出能特异性与靶标乳铁蛋白(LF)高度亲和的核酸适配体，三条候选LF适配体的序列如下(5′-3′)：
LAC1：TCAAGCAGTGCAATTGCAGTATGTTGTTGTGGTGTT
LAC6：TCAATGTCCCGATGCAGTCTAACTGTGTTGAGATGT
LAC9：TCAATATGCCCCCCCAATGCAGTTGGTCCGGTATGT
SPR测定三条候选LF适配体的亲合力(具体方法参见贺小琴.适配体的Post-SELEX筛选评价、表征及传感新方法研究.中国人民解放军军事医学科学院,2017)。测定结果见图3。
可见，三条适配体与乳铁蛋白的亲和力不同。进一步对LAC1的亲和力进行精确测定，亲和力达372pM(图4)。
实施例2适配体亲和柱的制备及条件优化
1、载体的洗涤：取300μL N-羟基琥珀酰亚胺(-NHS)修饰的琼脂糖置于2mL离心管中，用1mM盐酸洗涤2次，每次1mL；
2、适配体复性：取1OD的5’端氨基修饰的乳铁蛋白适配体特异性DNA溶解于500μLMES缓冲液中，于95℃复性5min，然后室温放置30min；
3、偶联：向洗涤后的载体中加入复性好的适配体溶液，于25℃摇床震荡反应0.5h；
4、封闭：偶联产物离心去除上清后，加入1mL封闭缓冲液，于25℃摇床震摇反应1h，得到载体-适配体填料；
5、洗涤：将上述载体-适配体填料用清洗缓冲液洗涤2次，除去未偶联的适配体。洗涤后的偶联胶用1mL结合缓冲液，重悬，所得偶联胶悬液准备装柱；
6、装柱：取容积1mL的固相萃取柱(固相萃取柱为天津博纳艾杰尔科技有限公司生产的1mL套装柱)，垫好下筛板，用上述偶联胶悬液装柱，至胶高度为1cm，加入结合缓冲液0.5-3mL，于4℃保存。所制备的亲和柱结构示意图如图1所示。7、适配体亲和柱性能的验证及净化条件的优化
1)磷酸盐浓度的优化
本方法中选择磷酸盐缓冲液作为提取剂，并进行磷酸盐浓度的优化，通过牛奶加标回收率的测定，在磷酸盐pH7.5的条件下，依次选择浓度为0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4mol/L进行比较(表1)。
表1磷酸盐提取液浓度优化表(n＝3)
Figure BDA0002634478570000051
当磷酸缓冲液浓度达到0.2mol/L时，回收率为最高，故选定乳铁蛋白检测时磷酸盐提取缓冲液浓度为0.2mol/L。
2)淋洗液的选择及淋洗体积的优化
比较3种淋洗液清洗适配体亲和柱结果见图5。当磷酸盐淋洗液浓度为0.01mol/L时，进一步优化淋洗液体积，结果如图6所示，当淋洗液体积为10mL时可以清洗掉几乎所有杂质且不影响加标回收结果。因此选择10mL为淋洗缓冲液体积。
3)洗脱液(磷酸盐洗脱液)盐浓度的优化
洗脱步骤是适配体亲和柱使用过程中的关键步骤，在此步骤中乳铁蛋白目标化合物将从适配体亲和柱中洗脱下来，故洗脱液的浓度对整个试验比较关键。选定Na2HPO4的浓度为0.05mol/L，pH＝8.0，设定6个不同浓度的NaCl浓度(0.1、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0mol/L)，通过牛奶样品加标回收测定，结果如表2所示，选定1.0mol/L的NaCl作为理想的洗脱液盐浓度。
表2磷酸盐提取液浓度优化表(n＝3)
Figure BDA0002634478570000061
4)适配体亲和柱洗脱体积的测定
1mL规格的适配体亲和柱，乳铁蛋白的上柱量为500μg时，收集到的第1mL和第2mL的洗脱液中乳铁蛋白总的洗脱率达到96％以上，第3mL-5mL的洗脱液中未检测到乳铁蛋白，故本发明中选定收集洗脱液的体积为2mL(表3)。
表3适配体亲和柱洗脱体积的测定(n＝3)
Figure BDA0002634478570000062
Figure BDA0002634478570000071
实施例3利用乳铁蛋白适配体亲和柱纯化牛奶样品中的乳铁蛋白及其检测
本实施例通过向市售的牛奶样品定量加入乳铁蛋白标准品，然后用实施例1制备的乳铁蛋白适配体亲和柱进行净化，净化后用高效液相色谱检测，测定回收率。具体如下：
1、称取液态奶10g(精确到0.01g),加入磷酸盐提取液定容至50mL,混匀，10000rpm，4℃离心15min，吸取上清液待净化。乳铁蛋白适配体亲和柱先用5mL结合缓冲液活化，再准确移取10mL上清液过柱，用10mL淋洗缓冲液淋洗，用2mL磷酸盐洗脱液洗脱，收集洗脱液，用磷酸盐洗脱液定容至2mL，涡旋混匀，过微孔滤膜后待测。
2、色谱柱为Xbridge Protein BEH C4
Figure BDA0002634478570000073
3.5um,250mm×4.6mm。以0.1％三氟乙酸的水溶液为流动相A,乙腈为流动相B，在流速为0.5mL/min，检测波长为280nm，柱温为40℃，进样量为30μL的色谱条件下进行梯度洗脱(表4)。将乳铁蛋白标准工作液按不同质量浓度，在上述液相色谱条件下进行测定。以乳铁蛋白标准溶液的质量浓度为横坐标(x),峰面积为纵坐标(y),绘制标准曲线，线性回归方程为y＝4.2572x-2.8113，R2＝0.9997，具有良好的线性关系。以3倍信噪比计算得出该方法的检出限为3mg/L。
表4流动相梯度洗脱程序
Figure BDA0002634478570000072
乳铁蛋白标准品HPLC色谱图见图7，牛奶样品经适配体亲和柱纯化后HPLC色谱图见图8。
3、回收率和精密度
向空白液态奶样品中分别添加不同质量浓度的乳铁蛋白，进行加标回收实验，分别平行测定3次。结果见表5。
表5液态牛奶添加回收率的结果
Figure BDA0002634478570000081
实施例4乳铁蛋白适配体亲和柱柱容量的考察
1、适配体亲和柱承载量的测定
利用适配体亲和柱对乳铁蛋白纯化和浓缩的前处理方法至今未有报道，适配体亲和柱的承载量对方法的准确度方面有很大的影响，故在本方法中进行了承载量的考察。采用10μg-5000μg不同的上柱量测定回收率的方式，选定承载量范围值。1mL适配体亲和柱对乳铁蛋白承载量的测定结果见图9。
2、适配体亲和柱与肝素亲和柱性能的比较
目前市售用来富集纯化乳铁蛋白使用最多的是肝素亲和柱，为了验证适配体亲和柱的性能，将实施例2制备的适配体亲和柱与Hi-TrapTM Heparin肝素亲和柱(购自美国GEHealthcare公司)在相同的试验条件下进行牛奶样品加标回收率和重复使用性能的测定比较。结果见图10和表6。
表6适配体亲和柱与肝素亲和柱实际样品回收率的比较
Figure BDA0002634478570000082
可见，本方法与市售的的肝素亲和柱相比，具有检测成本低、操作方便简单、重复性好、灵敏度高等优势，可以满足目前乳铁蛋白的日常检测。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京农业质量标准与检测技术研究中心 北京市农林科学院
<120> 乳铁蛋白适配体亲和柱及其制备方法与应用
<130> KHP201114751.2
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
tcaagcagtg caattgcagt atgttgttgt ggtgtt 36

Claims (9)

1.乳铁蛋白的核酸适配体，其特征在于，核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述适配体在制备乳铁蛋白检测试剂或乳铁蛋白适配体亲和柱中的应用。
3.乳铁蛋白适配体亲和柱，其特征在于，所述亲和柱的填料是以N-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖为载体，然后将权利要求1所述适配体与载体进行共价偶联得到的。
4.根据权利要求3所述的亲和柱，其特征在于，所述适配体是经过氨基修饰的适配体序列，修饰方法如下：在核酸适配体的3’或5’端通过共价键连接C7间接臂-(CH2)7-或C6间接臂-(CH2)6-，然后在C7间接臂或C6间接臂的末端通过共价键修饰氨基，从而得到氨基修饰的适配体。
5.权利要求4所述亲和柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)载体的洗涤：取300μL N-羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖置于离心管中，用1mM盐酸洗涤1-2次，每次1-2mL；
2)适配体复性：取1OD的5’端氨基修饰的乳铁蛋白适配体溶解于500μL MES缓冲液中，于92-96℃复性5-10min，然后室温放置30-60min；
3)偶联：向洗涤后的载体中加入复性好的适配体溶液，于20-30℃摇床震荡反应0.5h；
4)封闭：偶联产物离心去除上清后，加入1mL封闭缓冲液，于20-30℃摇床震摇反应1h，得到载体-适配体填料；
5)洗涤：将上述载体-适配体填料用清洗缓冲液洗涤，除去未偶联的适配体；洗涤后的偶联胶用1mL结合缓冲液重悬，所得偶联胶悬液准备装柱；
6)装柱：取容积1mL的固相萃取柱，垫好下筛板，用上述偶联胶悬液装柱，至胶高度为1-1.5cm，加入结合缓冲液0.5-3mL，于4℃保存；
其中，所述MES缓冲液：0.1M MES,0.15M NaCl,pH 6.0；
所述封闭缓冲液：0.2％BSA,0.1M MES,0.15M NaCl,pH 6.0；
所述清洗缓冲液：50mM Tris-HCl,0.15M NaCl,pH 7.2；
所述结合缓冲液：137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4·12H2O,2mM NaH2PO4,1mMMgCl2,2mM CaCl2,pH 7.5。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤7)所述固相萃取柱及下筛板的材质为聚丙烯、聚苯乙烯。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，下筛板的孔径为10μm。
8.权利要求3或4所述亲和柱或按照权利要求5-7任一项所述方法制备的亲和柱在富集和/或纯化样品中乳铁蛋白中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述样品选自化妆品、食品、动物饲料、医药。
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