KR101327249B1 - 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 특이적인 ｄｎａ 앱타머 - Google Patents

돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 특이적인 ｄｎａ 앱타머 Download PDF

Info

Publication number
KR101327249B1
KR101327249B1 KR1020110095849A KR20110095849A KR101327249B1 KR 101327249 B1 KR101327249 B1 KR 101327249B1 KR 1020110095849 A KR1020110095849 A KR 1020110095849A KR 20110095849 A KR20110095849 A KR 20110095849A KR 101327249 B1 KR101327249 B1 KR 101327249B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
dna
respiratory syndrome
prrsv
virus
aptamer
Prior art date
Application number
KR1020110095849A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20130032128A (ko
Inventor
구만복
이수진
권영섭
이지은
Original Assignee
고려대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 고려대학교 산학협력단 filed Critical 고려대학교 산학협력단
Priority to KR1020110095849A priority Critical patent/KR101327249B1/ko
Publication of KR20130032128A publication Critical patent/KR20130032128A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101327249B1 publication Critical patent/KR101327249B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2541/00—Reactions characterised by directed evolution
    • C12Q2541/10—Reactions characterised by directed evolution the purpose being the selection or design of target specific nucleic acid binding sequences
    • C12Q2541/101—Selex

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Abstract

본 발명은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머에 관한 것으로, 랜덤 DNA 라이브러리로부터 Flu-Mag-SELEX 방법을 통해 선별된 북미형 또는 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공하는 효과가 있다. 상기 앱타머를 이용하여 돼지 생식기 호흡기 증후군을 효과적으로 진단할 수 있다.

Description

돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 특이적인 ＤＮＡ 앱타머{DNA aptamers for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome(PRRS) virus}
본 발명은 랜덤 DNA 라이브러리로부터 선별된 북미형 또는 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머에 관한 것이다.
돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRS Virus 또는 PRRSV)는 외막을 갖고 있으며 직경 50 내지 60nm의 작은 구형 바이러스로 표면에는 작은 돌기들이 나와 있다. 유전자가 들어있는 부위는 직경 25 내지 35nm로 단쇄 RNA유전자가 자리하고 있다. 외부환경에는 그다지 강하지 못해서 산도 5 이하 또는 7 이상에서 바이러스 감염 역가가 90%이상 감소되며, 37 ℃에서 10 내지 24시간, 20 ℃에서는 6일 정도 경과하면 감염 역가가 10배 이상 감소한다. 이 바이러스에 감염되었을 경우 혈청검사에 의해서만 감염을 알 수 있을 정도로 임상증상이나 경제적 손실이 전혀 없는 경우부터 농장생산의 20% 정도 손실을 입힐 정도로 심한 경우까지 정도는 다양하다.
임상 증상은 번식장애와 호흡기 질환으로 분류되며 모돈에서의 번식장애, 자돈 및 육성돈에서의 호흡기 질환으로 구분된다. 보통 임신말기유산이 대부분이며 조산 태아 분만, 사산 및 미이라 자돈의 발생, 자돈의 이유 전 폐사율의 급증, 이유 후 폐사율의 증가, 발정회귀의 지연 등이며 이 증상들은 모돈과 그 모돈에서 태어난 자돈들에 집중적으로 발생한다.
PRRS 바이러스 감염에 의한 호흡기 질환은 전 일령에 나타날 수 있으며 일반적으로 빠른 복식호흡과 안검부종, 결막염, 재채기, 충혈 등이 관찰되며 짧은 기간의 체온상승이 있는 경우도 있고 드물게는 신경증상을 보일 수도 있다. 호흡기 질환의 특징은 PRRS 바이러스 단독 감염의 경우보다는 세균성, 바이러스성 병원체의 2차감염 및 복합감염이 대부분이며 그 경우 병원성이 훨씬 증폭된다. 이 밖에 귀, 복부, 외음부 등에 청색반점이 생기는 경우도 있다. 흔히 청색귀병(blue ear disease)라고 불린 이유도 여기에 있다.
일반적으로 급성으로 심하게 진행되는 경우가 대부분이며 준임상형 감염이나 만성적으로 진행될 경우는 특징적인 임상증상을 거의 관찰할 수 없다. 만성적 감염은 이유자돈과 육성비육단계에서 주로 발생하며 PRRS 바이러스의 공격을 받은 폐에 세균 및 바이러스가 감염되어 폐렴을 일으킨다. 이에 따라 일당 증체량은 떨어지고 사료 요구율은 더 증가하며 일반적으로 간질성 폐렴 소견을 보인다. 그러므로 PRRSV의 발병을 차단하는 것이 매우 중요하며, 농가를 포함한 국가의 경제적, 물질적 손실을 줄이기 위해 조기에 정확하게 진단하는 것이 매우 중요한 일이다.
기존의 PRRS 진단을 위해서는 우선, 농장 과거 병력과 현재 상태의 점검 및 임상 증상이 확인되어야 하고, 이후 주로 검사하는 방법인 ELISA 와 PCR을 통한 실험실적 검사의 확인으로 이어진다. ELISA는 바이러스에 의해 생성된 항체를 통해서 바이러스의 유무와 감염 정도를 간접적으로 확인하는 것이고, PCR은 조직 내 또는 혈액에의 바이러스의 유무를 유전자 증폭을 통해서 직접 확인하는 것이다.
ELISA는 항원이 코팅된 튜브, 플레이트 등에 검사 혈청을 넣어 항원-항체 결합을 유도한 후, 항체와 결합할 수 있는 효소 등의 시약을 넣어 주어 발색/발광 등의 정도를 확인함으로써 항체의 유무를 판별하는 것이다. 그러나 ELISA 검사는 바이러스 자체를 검출하는 것이 아니라 이에 의한 면역 반응의 결과체인 항체를 측정하는 것으로써, 현재 감염 상태의 유무를 판별할 수는 없다. 더욱이 바이러스에 대한 경험이 없는 돼지가 바이러스에 처음 감염되었을 때, 항체를 생성하기까지는 약 2주 이상의 시간이 필요한 것을 감안하면, ELISA 검사의 정확성을 무조건적으로 신뢰할 수 없다는 단점이 있다.
바이러스를 직접적으로 확인할 수 있는 방법이 PCR이다. 이는 유전자 증폭을 통한 검사법으로서 바이러스의 존재를 확인할 수 있는 검사 방법이다. 그러나 유전자 증폭을 위해서는 통상적으로, 고가의 시약과 장비가 필요하며 즉, 현장에서의 신속한 진단이 어렵다는 의미를 내포한다.
이러한 문제점들을 개선하기 위한 새로운 감지물질로서 다양한 타겟물질에 대해 특이적으로 높은 친화도를 보이는 핵산 구조체인 앱타머를 이용하는 연구가 많이 이루어지고 있다.
앱타머(Aptamer)는 특정 타겟에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA 또는 RNA의 구조체를 말한다. 앱타머는 타겟에 대한 친화도가 높고 열 안정성이 우수하며 시험관 내(in vitro)에서 합성이 가능하기 때문에, 비용면에서도 기존의 센서 분야에서 이용되는 감지물질들 보다도 우위에 있다. 또한 타겟물질에 제약이 없어 단백질, 아미노산 같은 생분자나 환경호르몬이나 항생제 같은 작은 유기화학 물질, 박테리아 등의 다양한 타겟에 대한 앱타머를 합성할 수 있다. 이렇게 타겟물질과 특이적으로 결합하는 앱타머의 특성으로 인해 최근 들어 앱타머를 신약개발, 약물전달 시스템, 그리고 바이오센서 등의 연구에 이용하기 위해 많은 연구가 이루어지고 있다.
본 발명은 PRRSV 입자에만 특이적으로 결합하는 핵산 구조체인 DNA 앱타머를 개발해냄으로써, 가축농가에 정신적, 물질적, 경제적 손실을 입히는 PRRSV를 보다 정확하고 신속하게 검출, 진단하는데 기여하기 위해 안출되었다.
1. 국내공개특허 제2011-0027871호 "돼지호흡기복합질병 원인체의 유전자 진단을 위한 프로브, 유전자칩, 유전자 진단키트 및 이를 이용한 진단방법", 주식회사 제노바이오텍
1. R. Stoltenburg et al., Anal Bioanal Chem (2005) 383: pp.83-91
본 발명의 목적은 PRRS 바이러스의 북미형 또는 유럽형 균주에 각각 특이적으로 높은 친화도를 보이는 핵산 구조체인 DNA 앱타머를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 PRRS 바이러스에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머에 의한 돼지 생식기 호흡기 증후군 진단 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열목록 서열번호 1 내지 71에 기재된 염기서열 중 어느 하나를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(Porcine Reproductive & Respiratory Syndrome virus, PRRSV)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNA 앱타머를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNA 앱타머를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNA 앱타머가 고정화된 고상 담체를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNA 앱타머를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNA 앱타머를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 따르면 PRRSV 북미형 또는 유럽형 균주에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 이용함으로써 기존의 항체 기반, 유전자 증폭기법 분석에 비해 보다 민감하고 신속, 정확하게 샘플 중 PRRSV 북미형 또는 유럽형의 농도를 측정할 수 있다.
또한, 상기 DNA 앱타머는 항체에 비해 생산비용이 적고 표면에 고정화하기가 쉬우므로 바이오센서 칩 제작에 유리하다. 따라서 이러한 PRRSV 북미형 또는 유럽형에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 이용하여 샘플 중 PRRSV 북미형 또는 유럽형 농도를 민감하고 정확하게 측정할 수 있는 바이오센서를 개발하여 돼지 생식기 호흡기 증후군 진단의 정확성을 증가시킬 수 있다.
도 1 및 2는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 북미형/유럽형에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 특이성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 서열목록 서열번호 1 내지 71에 기재된 염기서열 중 어느 하나를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(Porcine Reproductive & Respiratory Syndrome virus, PRRSV)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머에 관한 것이다.
본 발명은 Flu-Mag SELEX 프로세스를 이용하여 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)의 북미형 또는 유럽형에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 선별하는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서 언급된 "Flu-Mag SELEX 프로세스"란 임의적으로 합성된 DNA 또는 RNA의 집합에서 특정 분자에 대해 높은 결합력을 지니는 DNA 또는 RNA를 선별하여 증폭시킴으로써 해당 분자의 DNA 결합 서열을 알아내는 방법을 말한다.
상기 Flu-Mag SELEX 프로세스에 의한 북미형 또는 유럽형 PRRSV에 특이적으로 결합하는 앱타머의 선별과정을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
1) 자성 비드(magnetic bead)에 PRRSV 고정
PRRSV의 아미노기(amino group)와 자성비드 표면의 토실기(tosyl group)는 공유결합을 형성하게 되는데, 이것을 위해 PRRSV와 자성비드를 완충용액에 넣고 반응시킨다. 반응 후 PRRSV가 결합된 자성비드는 자석을 이용해서 분리가 가능하며 같은 완충용액으로 비드를 세척하여 결합하지 않았거나 표면에 약하게 붙어있는 PRRSV를 제거한다.
2) PRRSV에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 개발
표적물질 특이적인 앱타머를 개발하기 위한 방법으로는 일반적으로 SELEX(Systematic Evolution of Ligand by Exponential Enrichment) 방법이 널리 사용되고 있다. 본 발명에서는 일반적인 SELEX를 변형한 Flu-Mag-SELEX 프로세스를 이용하여 PRRSV 결합 특이적인 DNA 앱타머를 개발하였다. 본 발명에 이용된 FluMag-SELEX 프로세스는 DNA 증폭단계에서 형광 표지된 프라이머(fluorescence labelled primer)를 사용함으로써 이어지는 PAGE를 이용한 PCR 산물 분리(dsDNA->ssDNA)과정에서 형광을 띠는 밴드만 취하면 되는 이점을 이용하기 위한 변형이며, 타겟과 결합하는/결합하지 않는 DNA를 구별해내는 방법으로 자석(magnet)을 이용한 SELEX 방법이다. 기존의 다른 SELEX의 경우, 방사선 표지(radioactive label), 모세관 전기영동(capillary electrophoresis), 멤브레인 필터(membrane filter) 등을 이용했는데, 경비가 많이 들고 핸들링 하기가 어려운 단점이 있다. PCR 산물을 분리하기 위해서는 크로마토그래피, 어피니티 컬럼 등이 이용되었지만 가격이 비싸고, 효율이 떨어지는 문제가 있다(R. Stoltenburg, C. Reinemann, B. Strehlitz (2005) Anal Bioanal Chem 383: 83-91).
이를 해소하기 위하여, 본 발명은 먼저 76개의 임의의 염기를 가진 DNA 풀을 합성하며, 이 DNA 풀을 PRRSV가 고정되어 있는 자성비드와 함께 완충용액에 넣고 혼합하여 결합 반응을 시킨 후 자석을 이용해 PRRSV와 결합하지 않은 DNA를 제거한다. 고온 처리를 하여 PRRSV와 결합한 DNA를 자성비드에서 분리시킨 다음 에탄올 침전법으로 용리된 DNA를 확보한다.
상기 단일가닥 DNA 풀은 5' 말단 부분에는 서열번호 72에 기재된 프라이머 영역을, 3' 말단 부분에 서열번호 73에 기재된 프라이머 영역을 포함할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
타겟물질은 북미형 또는 유럽형 PRRSV를 사용할 수 있다. 후술하는 카운터 선별 시 타겟물질이 북미형 PRRSV인 경우, 카운터 타겟물질은 유럽형 PRRSV을 사용하고, 타겟물질이 유럽형 PRRSV인 경우에는 카운터 타겟물질로 북미형 PRRSV를 사용할 수 있다.
PRRSV 결합 특이적인 DNA의 양을 증폭하기 위해 PCR을 수행하고 PRRSV 결합 특이적인 DNA의 양을 증폭하기 위해 PCR을 수행하고 PCR 반응물을 정제한 후, 고농도의 우레아가 들어있는 폴리아크릴아마이드 젤로 전기영동을 하여 이중 가닥 DNA인 PCR 결과물을 두 개의 단일가닥 DNA로 분리한다. 이 경우, PCR 생산물은 두 가닥의 DNA 이므로 이를 단일가닥으로 분리하기 위한 변성과정을 위해서 하나의 프라이머에는 형광 물질을 고정한다. 전기영동 과정에서 두 가닥의 DNA가 변성되어 형광 물질이 붙어있는 DNA 가닥은 위에, 붙어있지 않은 DNA 가닥은 아래에 각각 위치하게 된다. 형광 물질이 붙어 있는 DNA 밴드를 폴리아크릴아마이드 젤로부터 잘라내어 추출한 후 다시 에탄올 침전법으로 분리된 DNA를 확보한다.
상기 PCR을 위한 프라이머 쌍은 서열번호 72 및 74에 기재된 것을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 형광 물질은 Cy5, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 658, 시아닌(Cyanine)-3, 시아닌-5, 플루오레세인(fluorescein), 보디피(bodipy), 텍사스 레드(Texas red), FITC(Fluorescein Isothiocyanate), 또는 로다민(rhodamine) 등을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
원래의 단일가닥 DNA 밴드를 젤 추출(gel extraction)한 후 다시 에탄올 침전법으로 분리된 DNA를 확보한다.
이때 확보된 DNA 풀은 다시 처음의 PRRSV가 고정되어 있는 자성비드 용액과 혼합하여 PRRSV와 반응시킨다. 이러한 일련의 과정을 반복하여 90% 이상이 PRRSV에 결합하는 DNA 풀을 얻은 후 DNA 풀을 TOPO 클로닝키트를 이용하여 클로닝(cloning)하고 얻어진 콜로니에서 DNA를 추출하여 염기분석을 시행한다.
3) PRRSV 결합 특이적 DNA 앱타머 분석
PRRSV에 특이적으로 결합하는 앱타머의 다른 단백질에 대한 친화성과 PRRSV의 농도에 따른 결합력의 크기를 비교하기 위한 방법으로 표면자기공명장치(SPR)를 이용하였다. 이것을 위하여 금칩(bare gold chip)의 표면을 화학 처리하여 각각의 DNA 앱타머를 칩 위에 고정시킨 후 그 위에 PRRSV를 농도 별로 반응시키고, 특이성 분석을 위해 다른 PRRSV와 BSA에 대한 분석도 테스트한다.
상기 DNA 앱타머는 Flu-Mag SELEX 프로세스에 의해 선별된 북미형 PRRSV 또는 유럽형 PRRSV 에 특이적으로 결합하는 어떠한 염기서열의 DNA 앱타머일 수 있으나, 바람직하게는, 서열번호 1 내지 서열번호 71에 기재된 염기서열 중 어느 하나를 가질 수 있다. 보다 바람직하게는, 유럽형 PRRSV 에 특이적으로 결합하는 앱타머는 서열번호 1 내지 38에 기재된 염기서열 중 어느 하나를 가지며, 북미형 PRRSV 에 특이적으로 결합하는 앱타머는 서열번호 39 내지 71에 기재된 염기서열 중 어느 하나를 가질 수 있다.
본 발명의 앱타머는 또한 이 기술분야에서의 자체 공지의 방법에 의해 화학 합성할 수 있다.
본 발명의 앱타머는, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 대한 결합성, 안정성 등을 높이기 위해, 각 뉴클레오티드의 당 잔기(예, 리보오스나 디옥시리보스)가 수식된 것이어도 좋다. 당잔기에서 수식되는 부위로서는, 예컨대 당잔기의 2'부위, 3'부위 및/또는 4'부위의 산소원자를 다른 원자로 치환한 것 등을 들 수 있다. 수식의 종류로서는, 예컨대 플루오로화, O-알킬화(예, O-메틸화, O-에틸화), O-알릴화, S-알킬화(예, S-메틸화, S-에틸화), S-알릴화, 아미노화(예, -NH)를 들 수 있다. 이러한 당잔기의 변형은, 자체 공지의 방법에 의해 행할 수 있다(예컨대 Sproat et al .,(1991) Nucle . Acid . Res. 19, 733-738; Cotton et al ., (1991) Nucl. Acid . Res. 19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973) Biochemistry 12, 5138-5145 참조).
본 발명의 앱타머는 또한 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 대한 결합성 등을 높이기 위해, 핵산염기(예, 푸린, 피리미딘)가 변형(예, 화학적 치환)된 것이어도 좋다. 이러한 변형으로서는, 예컨대 5부위 피리미딘 변형, 6 및/또는 8부위 푸린 변형, 환외(環外) 아민에서의 변형, 4-티오우리딘으로의 치환, 5-브로모 또는 5-요오드-우리실으로의 치환을 들 수 있다.
또한 뉴클레아제 및 가수분해에 대하여 내성을 갖도록, 본 발명의 앱타머에 포함되는 인산기가 변형되어 있어도 좋다. 예컨대 P(0)0기가, P(0)S(티오에이트), P(S)S(디티오에이트), P(O)NR2(아미데이트), P(O)R, R(O)OR', CO 또는 CH2(포름아세탈) 또는 3'-아민(-NH-CH2-CH2-)으로 치환되어 있어도 좋다〔여기서 각각의 R 또는 R'은 독립적으로, H이거나, 또는 치환되어 있거나, 또는 치환되어 있지 않은 알킬(예, 메틸, 에틸)이다〕. 연결기로서는, -O-, -N- 또는 -S-가 예시되고, 이들의 연결기를 통하여 인접하는 뉴클레오티드에 결합할 수 있다.
본 발명에서의 변형은 또한, 캡핑과 같은 3' 및 5'의 변형을 포함하여도 좋다.
변형은 또한, 폴리에틸렌글리콜, 아미노산, 펩티드, inverted dT, 핵산, 뉴클레오시드, 미리스토일(Myristoyl), 리쏘콜릭-올레일(Lithocolic-oleyl), 도코사닐(Docosanyl), 라우로일(Lauroyl), 스테아로일(Stearoyl), 팔미토일(Palmitoyl), 올레오일(Oleoyl), 리놀레오일(Linoleoyl), 그 외 지질, 스테로이드, 콜레스테롤, 카페인, 비타민, 색소, 형광물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등을 말단에 부가함으로써 행해질 수 있다. 이러한 변형에 대해서는, 예컨대 미국특허 제5,660,985호, 미국특허 제5,756,703호를 참조한다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNA 앱타머를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 앱타머와 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 공유결합 또는 비공유결합을 통한 복합체 형성을 이용하여 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 검출할 수 있다. 상기 검출은 항체 대신에 본 발명의 앱타머를 이용하는 것 이외는, 면역학적 방법과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 항체 대신에 본 발명의 앱타머를 이용함으로써, 효소 면역 측정법(EIA)(예, 직접 경합 ELISA, 간접 경합 ELISA, 샌드위치 ELISA), 방사 면역 측정법(RIA), 형광 면역 측정법(FIA), 웨스턴 블롯(blot)법(예, 웨스턴 블롯법에서의 2차 항체 대신에 사용), 면역조직 화학적 염색법, 셀 소팅(cell sorting)법 등의 방법과 같은 방법에 의해, 검출 및 정량을 행할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNA 앱타머를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 진단용 조성물에 관한 것이다.
상기 돼지 생식기 호흡기 증후군의 진단은 상기 앱타머와 가축의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담 및 뇨 중에서 선택되는 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 시료는 가축, 바람직하게는 돼지에서 분리된 것으로, 최소 침습으로 확보가능한 시료 또는 분비체액, in vitro 세포배양액 성분 시료 등 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 포함하고 있을 수 있는 시료이면, 상기에 한정되지 않음은 자명하다. 보다 바람직하게는 혈액일 수 있다. 상기 돼지 생식기 호흡기 증후군의 중요한 바이오마커인 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 혈중농도를 정확하게 측정하는 것은 상기 질환을 진단하는데 매우 중요하다. 따라서 혈액 샘플 안의 여러 생체 물질 중에서 비특이적이며 적은 양의 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에도 특이적으로 결합할 수 있는 본 발명의 DNA 앱타머를 포함하는 조성물을 이용하여 보다 신속하고 정확하게 돼지 생식기 호흡기 증후군을 진단하는 데에 사용할 수 있다.
상기 앱타머를 시료와 접촉시키는 경우, 시료 중 존재하는 바이오마커인 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스와 상기 앱타머간 특이적인 결합이 일어나게 된다. 따라서, 형광 등으로 앱타머를 표지하여 결합시킨 다음 시그널의 존재 여부를 확인함으로써, 돼지 생식기 호흡기 증후군을 검출할 수 있게 된다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNA 앱타머가 고정화된 고상 담체에 관한 것이다.
상기 고상 담체로는 기판, 수지, 플레이트(예, 멀티웰 플레이트), 필터, 카트리지, 컬럼 또는 다공질재 등을 들 수 있다.
상기 기판은 DNA 칩이나 단백질 칩 등에 사용되고 있는 것 등일 수 있고, 예컨대 니켈-PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌) 기판이나 유리 기판, 아파타이트(apatite) 기판, 실리콘 기판, 금, 은 또는 알루미나 기판 등으로, 이들의 기판에 폴리머 등의 코팅한 것을 들 수 있다.
상기 수지는 아가로스(agarose) 입자, 실리카입자, 아크릴아미드와 N, N'-메틸렌비스아크릴아미드의 공중합체, 폴리스티렌 가교 디비닐벤젠입자, 덱스트란을 에피클로로히드린으로 가교한 입자, 셀룰로오스파이버, 알릴덱스트란과 N, N'-메틸렌비스아크릴아미드의 가교폴리머, 단분산계 합성폴리머, 단분산계 친수성폴리머, 세파로오스(Sepharose) 또는 토요펄(Toyopearl) 등을 들 수 있고, 또한 이들의 수지에 각종 관능기를 결합시킨 수지를 사용할 수 있다.
본 발명의 앱타머는 공지의 방법에 의해 고상 담체에 고정할 수 있다. 예컨대, 친화성 물질이 나 소정의 관능기를 본 발명의 앱타머에 도입하고, 계속해서 이 친화성 물질이나 소정의 관능기를 이용하여 고상 담체에 고정화하는 방법을 들 수 있다. 소정의 관능기는 커플링 반응에 제공하는 것이 가능한 관능기일 수 있고, 예컨대 아미노기, 티올기, 히드록실기, 카르복실기를 들 수 있다. 예를 들어, 상기 앱타머의 말단에 바이오틴을 결합시켜 복합체를 형성하고, 상기 칩 등의 기판 표면에 스트렙타비딘을 고정화시켜, 상기 바이오틴과 기판 표면에 고정화된 스트렙타비딘의 상호작용에 의하여 상기 앱타머를 기판 표면에 고정화시킬 수 있다.
상기 앱타머가 고정화된 고상 담체를 이용하여 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 검출하는 방법은, 예를 들어, 본 발명의 DNA 앱타머를 칩(chip)상에 형광물질, 발색물질 또는 항체 등과 함께 스팟팅 시킨 후 혈액샘플을 반응시킴으로써 검출 시료, 예를 들어, 혈액 중에 포함된 미량의 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 수준을 신속하게 측정할 수 있다. 또 다른 방법으로는 자성 비드에 상기 DNA 앱타머를 고정화시켜 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 결합시키게 되면 결합된 DNA 앱타머-돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 복합체를 자석을 이용하여 분리할 수 있게 되고, 이 복합체로부터 다시 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 분리함으로써 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스만을 선택적으로 검출할 수 있게 된다. 본 발명의 실시예에 기술된 방법 이외에도 본 발명의 DNA 앱타머와 연결자로 연결된 센서를 이용하여 혈액 중의 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 검출하는 방법 등을 사용할 수 있다.
상기 고상 담체를 이용한 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 검출은 돼지 생식기 호흡기 증후군을 진단하는데 유용하다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNA 앱타머를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 검출용 또는 돼지 생식기 호흡기 증후군 진단용 키트의 형태로 제공될 수 있다.
상기 키트는 필요에 따라 완충용액 및 검출의 수행과 분석을 위한 용기들을 포함할 수 있는데, 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리할 수 있는 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사 바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> PRRSV 북미형/유럽형에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머의 개발
PRRSV의 두 가지 균주(북미형/유럽형)에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 Flu-Mag SELEX 프로세스를 이용하여 선별하였다. 앱타머의 선별과정은 R. Stoltenburg 등의 Anal Bioanal Chem (2005, 383: pp.83-91)에 기재된 방법을 변형하여 실시하였다.
또한, 북미형 PRRSV에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 선별할 경우, 타겟물질로 북미형 PRRSV를, 카운터 타겟물질로 유럽형 PRRSV를 사용하였고, 유럽형 PRRSV에 특이적인 앱타머 선별 시, 타겟물질은 유럽형 PRRSV을, 카운터 타겟물질은 북미형 PRRSV를 사용하였다.
보다 구체적인 북미형 또는 유럽형 PRRSV에 특이적인 앱타머 선별과정은 다음과 같다.
(자성 비드에 북미형 또는 유럽형 PRRSV의 고정)
북미형 또는 유럽형 PRRSV(MA 104 세포(African rhesus monkey kidney cell line)에 북미형 또는 유럽형 PRRSV를 각각 감염시킨 후 배양하여, 초고속 원심분리를 통해 바이러스 fraction 만을 수집한 바이러스 파티클 샘플을 국립수의과학검역원으로부터 제공받음)의 아미노기(amino group)와 자성비드(M-280 Tosylactivated magnetic beads, invitrogen, US)의 토실기(tosyl group)는 공유결합을 형성하게 되는데, 이것을 위해 PRRSV와 자성비드를 완충용액(0.1 M borate buffer, pH 9.5)에 넣고 상온에서 16시간 반응시켰다. 각각의 북미형 또는 유럽형 PRRSV가 결합된 자성비드는 자석을 이용해서 분리가 가능하며, 동일한 완충용액으로 비드를 세척하여 결합하지 않은 북미형 PRRSV를 제거하였다. 북미형 또는 유럽형 PRRSV가 결합된 자성비드(PRRSV-자성비드)는 세척 후 0.1%의 BSA(Bovine Serum Albumin, Sigma Co.) 용액(pH 8.5)으로 37℃에서 1시간 반응시켜 PRRSV와 결합하지 않은 토실기(tosyl group)를 불활성화하였다. 활성을 가지고 있는 토실기가 남아있으면 분자간의 여러 가지 상호작용, 예컨대, 반데르발스 결합, 소수성 반응(hydrophobic interaction) 등으로 인해 비특이적 결합(nonspecific binding)이 일어날 수 있기 때문에 활성이 거의 없다고 알려진 BSA로 활성기를 차단(blocking)시켰다. 수 차례 세척 후 완충용액(0.1 M PBS, pH 7.4)에 자성비드를 혼합하여 4 ℃에서 보관하였다.
(임의의 염기서열을 가지는 DNA 풀 합성)
76mer DNA 풀로서 양 끝에 PCR을 위한 프라이머 영역(primer region)이 있고 중앙에 40개의 임의의 염기를 가진 DNA 풀을 아래와 같은 방법으로 합성하였다. 본 발명에 사용된 DNA 풀은 Genotech Inc. Korea에 화학적으로 합성을 의뢰하였다.
CGTACGGAATTCGCTAGC-N40-GGATCCGAGCTCCACGTG
(서열번호 72: CGTACGGAATTCGCTAGC; 서열번호 73: GGATCCGAGCTCCACGTG)
(PRRSV와 결합한 DNA 앱타머의 선별)
상기 단계에서 합성된 랜덤 DNA 풀을 북미형 또는 유럽형 PRRSV가 고정되어 있는 자성비드(PRRSV-자성비드)와 함께 완충용액(100mM NaCl, 2mM MgCl2, 5mM KCl, 1mM CaCl2, 및 0.02% Tween20이 포함된 20mM Tris-Cl 완충용액, pH 7.6)이 담긴 튜브에 넣고 혼합하여 30분간 상온에서 반응시킨 후 PRRSV와 결합하지 않은 DNA를 제거하기 위해 상기 혼합액이 들어있는 튜브를 자석에 고정시켜서 PRRSV와 결합하지 않은 DNA를 제거하고, 결합력이 약한 DNA를 제거하기 위하여 완충용액으로 5회 세척하였다. PRRSV와 결합한 DNA를 용리하기 위하여 튜브를 80℃에서 5분간 두어 DNA를 자성비드에서 부터 분리시킨 다음 에탄올 침전법으로 용리된 DNA를 확보하였다. 이렇게 얻어진 북미형 또는 유럽형 PRRSV에 결합하는 DNA의 양을 측정하였다.
(북미형 또는 유럽형 PRRSV와 결합 가능한 DNA 앱타머 풀의 제조)
PRRSV 결합 특이적인 DNA의 양을 늘리기 위해 이미 알고 있는 프라이머 영역을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 생산물은 두 가닥의 DNA이므로 이를 단일가닥으로 분리하기 위한 과정을 위하여, 아래와 같이 하나의 프라이머에는 플루오레세인(fluorescein)을 고정하였다.
정방향 프라이머: 5'-fluorescein-CGTACGGAATTCGCTAGC-3': 서열번호 72)
역방향 프라이머: 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAAXCACGTGGAGCTCGGATCC-3': 서열번호 74: 여기서, X=C18 링커)
PCR 반응물을 정제키트(purification kit)를 이용하여 정제한 후 이중가닥의 DNA를 단일가닥으로 만들기 위해 폴리아크릴아마이드젤 전기영동을 실시하였다. 10%의 폴리아크릴아마이드젤에는 6M 우레아, 20% 포름아마이드가 포함되어 있어 전기영동 후에는 두 개의 밴드가 생기는데, 이는 전기영동 과정에서 두 가닥의 DNA가 변성되어 플루오레세인이 붙어있는 DNA 가닥은 위에, 붙어있지 않은 DNA 가닥은 아래에 각각 위치하게 된다. 플루오레세인이 붙어있는 DNA 밴드를 잘라내어 젤 추출(gel extraction)을 실시한 후 다시 에탄올 침전법으로 분리된 DNA를 확보하였다. 이때 확보된 DNA 풀은 다시 처음의 북미형 또는 유럽형 PRRSV가 고정되어 있는 자성비드 용액과 혼합하여 북미형 또는 유럽형 PRRSV와 반응시켰다. 일련의 과정(Flu-Mag-SELEX process)을 한 번의 선별(selection)이라 하면 총 9번의 선별과정을 거쳐 최종적으로 97% 이상이 북미형 또는 유럽형 PRRSV에 결합하는 DNA 풀을 얻었다. 2번째와 9번째 선별 후에는 각각 BSA(Bovine Serum Albumin, Sigma Co.)와 북미형 또는 유럽형 PRRSV으로 카운터 선별(count selection)을 실시하는데 있어 북미형 PRRSV 에 대한 앱타머의 개발에는 유럽형 PRRSV 를, 반대의 경우에는 북미형 PRRSV 를 사용함으로써 비특이적으로 결합하는 DNA를 차단하고 북미형 또는 유럽형 PRRSV에만 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합하는 DNA 풀을 확보하였다. 최종적으로 얻어진 DNA 풀을 TOPO 클로닝 키트(Invitrogen)를 이용하여 클로닝(cloning)하고 얻어진 콜로니에서 DNA를 추출하여 염기분석을 시행한 결과, 북미형 PRRSV에 특이적으로 결합하는 서로 다른 33종, 유럽형 PRRSV 에 특이적으로 결합하는 서로 다른 38 종의 핵산 구조체(DNA 앱타머)를 확보하였다.
북미형과 유럽형 PRRSV에 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합하는 서로 다른 71종의 DNA의 염기서열을 분석한 결과를 하기 표 1 및 2에 제시하였다.
Figure 112011073996000-pat00001
Figure 112011073996000-pat00002
프라이머 영역
서열번호 프라이머 서열
72 정방향 5'-fluorescein-CGTACGGAATTCGCTAGC-3'
74 역방향 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAAXCACGTGGAGCTCGGATCC-3'
(X=C18 링커)
<실험예 1> PRRSV 북미형/유럽형에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머의 특이성 분석
상기 실시예 1에서 얻은 앱타머들이 유럽형과 북미형 PRRSV에만 특이적으로 결합하고 서로 다른 타입 또는 바이러스가 없는 세포에는 결합하지 않는지를 확인하였다. 이를 위하여 자기공명장치인 SPR(Surface Plasmon Resonance) 장치를 이용하였다.
먼저, 50 mM의 3,3'-디티오디프로피온산(3,3'-dithiodipropionic acid)로 금칩(bare gold chip)의 표면에 COOH 기를 만든 다음 EDC/NHS(N-ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)carbodiimide(EDC/Sigma Co.), N-hydroxysuccinimid(NHS/Fluka))를 이용하여 자기조립 단분자막(Self Assenmbly Monolayer)을 형성시켰다. 그 위에 스트렙타비딘을 고정시키고 바이오틴이 붙어있는 EB13, LB32 앱타머를 0.5 μM로 각각의 금칩에 코팅시켰다. 여기에 1×105 바이러스 파티클/mL의 유럽형, 북미형 바이러스 파티클 용액, 바이러스에 감염되지 않은 세포 용액을 완충용액(100mM NaCl, 2mM MgCl2, 5mM KCl, 1mM CaCl2, 및 0.02% Tween20이 포함된 20mM Tris-Cl 완충용액, pH 7.6,)안에서 각각 30분간 반응시킨 후 같은 완충용액으로 결합하지 않은 파티클을 씻어내었다. 같은 방법으로 3회 실시한 최종 SPR 결과를 분석하여 상기 앱타머들이 각각의 타겟물질에 월등하게 잘 결합하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과를 도 1에 제시하였다.
<실험예 2> PRRSV 북미형/유럽형에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머의 특이성 및 결합력 분석
PRRSV의 북미형과 유럽형의 균주에 각각 특이적으로 결합하는 서로 다른 71종의 앱타머 중에서 특이성 및 결합력이 가장 높은 EB13, LB32 앱타머에 대한 유럽형 북미형 균주와의 결합 분석(binding assay)을 실시하였다.
실시예 2에서와 같이 금칩(bare gold chip)에 0.5 μM로 앱타머를 고정시킨 후 1×102 바이러스 파티클/mL로부터 1×104 바이러스 파티클/mL의 서로 다른 농도의 북미형과 유럽형 바이러스 파티클 용액을 완충용액(100mM NaCl, 2mM MgCl2, 5mM KCl, 1mM CaCl2, 및 0.02% Tween20이 포함된 20mM Tris-Cl 완충용액, pH 7.6)에서 30분간 반응시켰다. 해리상수를 구하기 위해서 각각의 반응 정도는 비선형 회귀법과 단일 부위 포화형 리간드 결합법으로 Sigmaplot 8.0을 이용하여 플롯팅 되었고, 여기에 y=Bmax* X/Kd + X 식이 이용되었다(y는 포화도, Bmax는 최대 결합 위치, Kd는 해리상수, X 는 결합하지 않은 바이러스 파티클).
도 2에 나타난 바와 같이, LB32 앱타머의 Kd 값이 3.33×103 바이러스 파티클/mL, EB13 앱타머의 Kd 값이 2.43×103 바이러스 파티클/mL로서 각각의 타겟과 매우 강력하게 결합하는 것이 확인되었다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (10)

  1. 서열번호 1 내지 38에 기재된 염기서열 중 어느 하나로 표시되고 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(Porcine Reproductive & Respiratory Syndrome virus, PRRSV)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머와,
    서열번호 39 내지 71에 기재된 염기서열 중 어느 하나로 표시되고 북미형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머로 구성된 DNA 앱타머.
  2. 제1항의 DNA 앱타머를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 검출용 조성물.
  3. 제1항의 DNA 앱타머를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 진단용 조성물.
  4. 제1항의 DNA 앱타머가 고정화된 고상 담체.
  5. 제4항에 있어서,
    고상 담체는 기판, 수지, 플레이트, 필터, 카트리지, 컬럼 또는 다공질재인 고상 담체.
  6. 제4항에 있어서,
    기판은 니켈-PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌) 기판, 유리 기판, 아파타이트(apatite) 기판, 실리콘 기판, 금 기판, 은 기판 또는 알루미나 기판인 고상 담체.
  7. 제4항에 있어서,
    고상 담체는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 검출용 담체인 고상 담체.
  8. 제4항에 있어서,
    고상 담체는 돼지 생식기 호흡기 증후군 진단용 담체인 고상 담체.
  9. 제1항의 DNA 앱타머를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 검출용 키트.
  10. 제1항의 DNA 앱타머를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 진단용 키트.
KR1020110095849A 2011-09-22 2011-09-22 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 특이적인 ｄｎａ 앱타머 KR101327249B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110095849A KR101327249B1 (ko) 2011-09-22 2011-09-22 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 특이적인 ｄｎａ 앱타머

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110095849A KR101327249B1 (ko) 2011-09-22 2011-09-22 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 특이적인 ｄｎａ 앱타머

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130032128A KR20130032128A (ko) 2013-04-01
KR101327249B1 true KR101327249B1 (ko) 2013-11-13

Family

ID=48435100

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110095849A KR101327249B1 (ko) 2011-09-22 2011-09-22 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 특이적인 ｄｎａ 앱타머

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101327249B1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6399611B2 (ja) * 2014-04-30 2018-10-03 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 エビアレルゲンに結合する核酸分子およびその用途
CA2914337A1 (en) 2015-12-10 2017-06-10 Aerovirus Technologies Inc. Aptamers, nucleic acid molecules, polynucleotides, synthetic antibodies compositions for detecting prrs viruses and treating prrs virus infection
WO2021029777A1 (en) * 2019-08-15 2021-02-18 Auramer Bio Limited Novel assays

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Vet. Diagn. Invest. Vol. 17(2), pp. 165-170 (2005) *
Lett. Appl. Microbiol. Vol. 46(1), pp. 55-60 (2008) *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20130032128A (ko) 2013-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9562907B2 (en) Aptamers screening method based on graphene without target immobilization and the aptamers obtained from the method
US9404919B2 (en) Multiplexed analyses of test samples
ES2617226T3 (es) Ensayos multiplexados basados en aptámeros
EP2290100B1 (en) Kits for displacement Sandwich Immuno-PCR
US20090042206A1 (en) Multiplexed Analyses of Test Samples
KR101841046B1 (ko) 환원 그래핀 산화물을 이용한 카나마이신 검출용 앱타 센서 및 이의 응용
CN113195722B (zh) 与基孔肯雅热病毒e2特异性结合的dna适体及其用途
KR101327249B1 (ko) 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 특이적인 ｄｎａ 앱타머
KR101913163B1 (ko) 이중가닥 핵산 신호 프로브 및 이를 이용한 표적분자의 검출방법
KR101297417B1 (ko) 타겟 비고정화 방식의 그래핀을 이용한 앱타머 선별방법 및 이로부터 선별된 Ｎａｍｐｔ 특이 앱타머
KR102009016B1 (ko) 오담(ODAM, Odontogenic Ameloblast-Associated protein)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 그의 용도
KR101841262B1 (ko) 조류독감바이러스에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머 및 그 용도
KR100930974B1 (ko) 레티놀 결합 단백질(ｒｂｐ4)에 특이적으로 결합하는ｄｎａ 앱타머 및 그 제조방법
KR101402316B1 (ko) 핵산 앱타머 및 항체를 이용한 에디포카인의 ＥＬＡＡＳ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｐｔａｍｅｒ Ｓａｎｄｗｉｃｈ） 검출방법
KR102196281B1 (ko) 에디펜포스(edifenphos)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 그의 용도
KR101911859B1 (ko) 이중가닥 핵산 신호 프로브 및 이를 이용한 표적분자의 검출방법
KR101322882B1 (ko) 소바이러스성 설사 바이러스에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머 및 그 용도
KR101086026B1 (ko) 비스파틴에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 및 그 제조방법
KR101678946B1 (ko) 25-하이드록시 비타민 디3에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머 및 그 용도
KR101816104B1 (ko) 프로게스테론(progesterone)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 그의 용도
KR101990103B1 (ko) 프로게스테론(progesterone)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 그의 용도
JP2547149B2 (ja) 免疫測定法及び免疫測定用試薬キット
KR101616524B1 (ko) 베스핀에 특이적으로 결합가능한 앱타머 및 이를 이용한 바이오 센서
KR101480495B1 (ko) C형 간염바이러스의 표면 단백질 e2에 대한 압타머 및 이의 용도
JPH06186232A (ja) 免疫測定法及び免疫測定用試薬キット

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160928

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200303

Year of fee payment: 7