CN111948386B - 一种利用抗体识别结合抗原的拉曼均相非诊断目的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于生物技术领域,提供了一种利用抗体识别结合抗原的拉曼均相非诊断目的检测方法,是通过柠檬酸钠还原法制备银纳米颗粒,利用EDC/NHS活化剂将抗体、拉曼报告分子偶联到银纳米颗粒以及磁性纳米颗粒表面,制备得到两种靶向目标抗原的拉曼探针;再利用拉曼探针检测特定抗原。本发明检测方法基于一对免疫夹心法的拉曼探针,这两个探针上具有结合目标抗原的抗体。两个探针能与目标抗原结合形成免疫复合物,进而激发表面增强拉曼效应,从而实现检测目标抗原。本发明改进了抗体在纳米颗粒表面的固相连接方式,进而提高探针的检测效率。这项检测方法具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种均相检测方法,尤其涉及一种利用抗体识别结合抗原的拉曼均相非诊断目的检测方法。
背景技术
蛋白、多肽、基因等生物分子检测技术是临床检测中最为关键的技术,快速、简单的检测手段是提高医院检测效率的基础,准确、灵敏的检测结果则是提高医师诊断结果的必要条件。在临床诊断中,医师往往对病人血清等体液中可以用于疾病诊断的分子进行检测分析,如肿瘤标志物、激素等。
血清中与疾病密切相关的生物分子密切反映着疾病的发生、生成和改变,因此得到了众多科研工作者和临床一线检测人员的关注。总而言之,检测血清中生物分子的方法主要分为酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、荧光分析法和光电化学免疫分析法等。
1、酶联免疫吸附剂测定
酶联免疫吸附剂测定诞生于20世纪70年代,它建立在免疫分析原理反应基础上,由酶进行标记替代传统具有危害性的放射性核素标记。值得注意的是,酶标分子体积虽然大但并没有降低降低抗体抗原间的识别能力。
2、荧光免疫分析法
荧光分析法基于荧光化合物设计荧光探针对靶标进行检测,使用安全且相对便宜,通过简单的仪器便能对荧光进行快速的捕获分析。可用做荧光标记的物质多种多样,比如荧光性质优良的稀土金属(Eu和Tb)。
3、光电化学免疫分析法
光电化学分析(photo electrochemistry,PEC)是基于光电材料的光电转换能力而进行痕量检测的新型检测方法,进行免疫测定时,人们多利用抗体抗原或核酸适配体之间的特异性结合。在光照条件下光电材料将免疫反应情况转变为电信号,进而定量样品。
检测血清中生物分子的方法虽种类繁多,从传统的化学发光酶免疫分析到交叉融合的光电化学免疫分析法不胜枚举,但其中也不乏缺点。比如传统ELISA等常规夹心型免疫测定方法中需要多次洗涤多次孵育,耗时耗力,且检测限不足。以核酸适配体作为替代品代替抗原抗体间的特异性识别时,虽然核酸适配体体积小,方便合成与保存等,但其易被核酸酶降解,结构刚性不如抗体等缺点限制了去实际应用。另外,荧光分析法存在猝灭现象;红外分析法对样品的要求较高。因此,需要一种快捷准确的检测方法。
一些分子被吸附到粗糙金属(如银、金等)表面上时,它们的拉曼散射强度会增加4-6个数量级,称为表面增强拉曼光谱技术(Surface-Enhanced Raman Spectroscopy,SERS)。SERS解决了拉曼光谱信号强度低的问题,使超灵敏分析成为可能。拉曼光谱优点突出:不受水溶剂的影响,适合检测生物样品,不受玻璃材质的影响等等。除了粗糙金属表面具有增强拉曼的效果,纳米颗粒表面、纳米颗粒之间的间隙同样可以作为增强基底对目标分子进行拉曼增强。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用抗体识别结合抗原的拉曼均相非诊断目的检测方法,以克服检测技术用于抗原检测时,需多次洗涤多次孵育,耗时耗力,检测限不足的缺点。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
一种利用抗体识别结合抗原的拉曼均相非诊断目的检测方法,包括以下步骤:
A、通过柠檬酸钠还原法制备银纳米颗粒,利用EDC/NHS活化剂将抗体、拉曼报告分子偶联到银纳米颗粒以及磁性纳米颗粒表面,制备得到两种靶向目标抗原的拉曼探针;
B、利用拉曼探针检测特定抗原:
B1、将步骤A所得的两个拉曼探针和不同浓度的特定抗原混匀后反应1h,取样于玻璃毛细管、PCR管或玻片上进行拉曼检测;
B2、利用拉曼光谱仪对检测样品进行拉曼检测,激发波长为531.7nm,积分时间为20s,积分次数为2次。每组随机选点5个测定拉曼信号,对1143cm-1波长处的拉曼强度进行计算平均值。
进一步地,所述拉曼探针的制备,具体包括以下步骤:
A1、以硝酸银、柠檬酸钠为原料,通过柠檬酸钠还原法制备银纳米颗粒;
A2、所制备的银纳米颗粒表面含有羧基,以N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)为交联剂,即通过EDC-NHS两步活化法将抗体(或与拉曼报告分子)偶联至银纳米颗粒表面;
A3、磁性纳米颗粒表面含有羧基,以N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)为交联剂,即通过EDC-NHS两步活化法将抗体(或与拉曼报告分子)偶联至磁性纳米颗粒表面;
A4、通过EDC/NHS将连接物修饰至纳米颗粒表面,再加入抗体,使抗体以正确的方向定位于纳米颗粒表面,提高拉曼探针的检测效率。
更进一步地,步骤A1,所述银纳米颗粒的制备,具体包括以下步骤:
A11、将三口烧瓶浸泡于王水中过夜,使用前用大量去离子水冲洗,以去除杂质避免引起银纳米颗粒聚集;
A12、使用电子天平称量0.018g硝酸银,转移到250mL三口烧瓶中,随即加入100mL去离子水。设定加热套的温度为100℃加热至微沸,随即加入2mL 1%的柠檬酸钠溶液。溶液颜色变为灰绿色时,降温至97℃,保持微沸,反应40-50min后冷却至室温,便得到银溶胶;
A13、通过紫外分光光度计检测银溶胶,观察最大吸收波长处的吸光度,根据Lambert-Beer定律计算银溶胶的浓度。
更进一步地,步骤A2,所述银纳米颗粒的制备,具体包括以下步骤:
A21、浓缩银溶胶,加入10μl吐温20,轻轻震摇30min。再加入10μl 2.5mM EDC和10μl 2.5mM NHS,置于水平振荡器上震摇1h,离心去除多余的活化剂,用1mL去离子水重悬;
A22、加入5μl 0.5mg/mL靶向抗原的抗体Ab1(或与20μL 5.0mM 4-ABP),反应2h,离心去除上清后弃上清;
A23、加入5μl乙醇胺封闭未结合的活化位点,反应30min,离心弃上清后重悬,得AgNPs@Ab1探针(或AgNPs@Ab1/4-ABP探针)溶液。
更进一步地,步骤A3,所述银纳米颗粒的制备,具体包括以下步骤:
A31、取400μl 0.5mg/mL羧基磁珠,加入5μl吐温20,反应30min后加入10μl 100mMEDC和10μl 100mM NHS,反应1h,离心去除多余的活化剂,重悬;
A32、加入5μl 0.5mg/mL靶向抗原另一个表位的抗体Ab2(或与20μL 5.0mM 4-ABP),反应2h,离心去除上清后弃上清,得MNs@Ab2探针(或MNs@Ab2/4-ABP探针)溶液。
进一步地,步骤A1,所述银纳米颗粒的粒径为50nm,粒径均一。
进一步地,所述银纳米颗粒或磁性纳米颗粒的表面修饰抗体是采用化学成键方式将抗体修饰到纳米颗粒表面或者通过一种连接物将抗体以正确姿态的方向修饰至纳米颗粒表面。
进一步地,所述拉曼报告分子既可以修饰于磁性纳米颗粒表面,又可以修饰于银纳米颗粒表面。
进一步地,步骤A4,所述连接物为Domain Z。
更进一步地,所述Domain Z的单体的序列为:
VDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKHHHHHHCCC
其二联体序列为:
HHHHHHVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKGGGGSVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
其四联体序列为:
HHHHHHVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKGGGGSVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKGGGGSVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKGGGGSVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK。
更进一步地,步骤A4,以Domain Z作为连接物,应用于纳米颗粒表面抗体的修饰,其具体步骤如下:
A41、使用活化缓冲液将磁性纳米颗粒洗三次,加入EDC和NHS至反应体系中,混匀后,室温反应15min。
A42、加入偶联缓冲液,洗三次。然后加入Domain Z和4-ABP,反应1h。
A43、加入靶向抗原的抗体Ab,反应2h,离心去除上清后弃上清。
A44、加入IgG Fc反应30min,封闭未结合抗体的Domain Z,得MNs@Domain Z@Ab/4-ABP探针溶液。
进一步地,步骤B2,所述检测样品为血清、尿液等体液中蛋白、多肽等生物大分子。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
本发明检测方法基于一对免疫夹心法的拉曼探针,这两个探针上具有结合目标抗原的抗体;两个探针能与目标抗原结合形成免疫复合物,进而激发表面增强拉曼效应,从而实现检测目标抗原;本发明改进了抗体在纳米颗粒表面的固相连接方式,进而提高探针的检测效率;这项检测方法具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例提供的通过柠檬钠还原法制备的AgNPs的表征结果;
图2、3是本发明实施例中采用的拉曼报告分子4-ABP的分子结构和拉曼图谱;
图4是本发明实施例中采用的连接物Domain Z的三维结构图;
图5是本发明实施例的Domain Z不同纯化阶段的电泳图;
图6是本发明实施例的计算Domain Z浓度的BSA浓度标准曲线;
图7是本发明实施例的拉曼均相检测方法对不同PSA的拉曼检测结果;
图8是本发明实施例的拉曼均相检测方法对PSA和非PSA的拉曼检测结果;
图9是本发明实施例的拉曼均相检测方法对TSH的拉曼检测结果(以毛细管为检测容器);
图10是本发明实施例的拉曼均相检测方法对TSH的拉曼检测结果(以PCR管为检测容器);
图11是本发明实施例的计算Domain Z偶联率的BSA浓度标准曲线;
图12是本发明实施例的有无Domain Z修饰的SERS探针检测PSA的拉曼图谱;
图13是利用抗体识别结合抗原的拉曼均相检测方法的流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
在本发明实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的,而非旨在限制本发明。在本发明实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式,除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解,本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
本发明实施了一种利用抗体识别结合抗原的拉曼均相非诊断目的检测方法,通过柠檬酸钠还原法制备银纳米颗粒,利用EDC/NHS活化剂将抗体、拉曼报告分子偶联到纳米颗粒表面,制备得到两种靶向目标抗原的拉曼探针,进而对抗原进行超灵敏检测。
本发明是这样实现的,设计一对基于免疫夹心法的拉曼探针,这两个探针上具有结合目标抗原的抗体。第一个探针是修饰了抗体的银纳米颗粒(AgNPs),即AgNPs@Ab1;第二个探针则以磁性纳米颗粒(Magnetic Nano-particles,MNs)为核心,修饰了另一种抗体和拉曼报告分子4-ABP,即MNs@Ab2/4-ABP。两个探针能与目标抗原结合形成免疫复合物,此时AgNPs能够大幅增强相邻MNs上4-ABP的拉曼信号,从而实现检测目标抗原。
本发明还提供了上述拉曼均相检测方法在检测前列腺特异性抗原(ProstateSpecific Antigen,PSA)中的应用。
本发明还提供了上述拉曼均相非诊断目的检测方法在检测促甲状腺激素(TSH)中的应用。
本发明还提供了上述拉曼均相非诊断目的检测方法在检测特定抗原中的应用方法,包括步骤如下:
以硝酸银、柠檬酸钠为原料,通过柠檬酸钠还原法制备银纳米颗粒,利用紫外分光光度计和透射电子显微镜观察银纳米颗粒的状态,通过Lambert-Beer定律计算银纳米颗粒的浓度,通过电镜图测量银纳米颗粒的粒径分布。
银纳米颗粒和磁性纳米颗粒表面均含有羧基,以N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)为交联剂,即通过EDC-NHS两步活化法将蛋白偶联至纳米颗粒表面。
两个探针能与目标抗原结合形成免疫复合物,此时AgNPs能够大幅增强相邻MNs上4-ABP的拉曼信号,从而实现检测目标抗原。将不同浓度抗原与两种拉曼探针进行混合孵育,利用拉曼光谱仪检测拉曼信号,对特征峰1143cm-1波长处的拉曼强度进行分析,解析拉曼强度与目标抗原浓度之间的关系。
本发明提供的利用抗体识别结合抗原的拉曼均相检测方法,通过柠檬酸钠还原法制备银纳米颗粒,利用EDC/NHS活化剂将抗体、拉曼报告分子偶联到纳米颗粒表面,制备得到两种靶向目标抗原的拉曼探针,进而对抗原进行超灵敏检测。
本发明还提供了Domain Z表达载体的构建、表达和纯化;
本发明还提供了Domain Z作为连接物在纳米颗粒表面修饰抗体中的应用,包括步骤如下:
磁性纳米颗粒表面含有羧基,采用以N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)为交联剂,活化磁性纳米颗粒表面的羧基,使其易与蛋白表面的氨基成键,实现将蛋白Domain Z偶联至磁性纳米颗粒表面。
向上述修饰了Domain Z的磁性纳米颗粒溶液汇总加入抗体,利用Domain Z对IgG抗体Fc的特异性结合,使抗体以统一的正确方向结合于纳米颗粒表面,为后续抗原的超灵敏检测提供基础。
实施例
本发明实施例实施了一种利用抗体识别结合抗原的拉曼均相非诊断目的检测方法,包括:
步骤101,以硝酸银、柠檬酸钠为原料,通过柠檬酸钠还原法制备银纳米颗粒。
在本发明实施例中,将三口烧瓶浸泡于王水中过夜,使用前用大量去离子水冲洗,以去除杂质避免引起银纳米颗粒聚集。使用电子天平称量0.018g硝酸银,转移到250mL三口烧瓶中,随即加入100mL去离子水。设定加热套的温度为100℃加热至微沸,随即加入2mL1%的柠檬酸钠溶液。溶液颜色变为灰绿色时,降温至97℃,保持微沸,反应40-50min后冷却至室温,便得到银溶胶。通过紫外分光光度计检测银溶胶,得知最大吸收波长是442nm,吸光度A是6.54,根据Lambert-Beer定律:A=kbc(A为吸光度,K为摩尔吸光系数,此处值为3×1011M-1cm-1,b为吸收层厚度,此处值为1cm),根据此公式易得银溶胶的浓度为1.87×10- 11M。
为检测AgNPs是否符合SERS实验要求,我们通过紫外吸收实验和电镜图来观察银纳米颗粒的状态。图1(a)是通过柠檬酸钠还原法制备所得的银纳米颗粒,从图中我们可以看出银纳米颗粒的紫外最大吸收波长为442nm,峰宽较窄,说明所制备的银纳米颗粒粒径比较均一,粒径多分布在50nm左右。通过电镜图我们更加直观的了解银纳米颗粒大小形态等信息,图1(b)可以得知银纳米颗粒多成球形、少量为棒状,且粒径多为50nm与紫外吸收实验结果基本一致。
步骤102,银纳米颗粒和磁性纳米颗粒表面均含有羧基,以N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)为交联剂,即通过EDC-NHS两步活化法将抗体、拉曼报告分子偶联至纳米颗粒表面。
在本发明实施例中,上述步骤102包括:
步骤201,取10mL上述银溶胶离心浓缩,加入10μl吐温20,放置水平振荡器上轻轻震摇30min。再加入10μl 2.5mM EDC和10μl 2.5mM NHS,置于水平振荡器上震摇1h,离心去除多余的活化剂,用1mL去离子水重悬。加入5μl 0.5mg/mL靶向抗原的抗体Ab1,反应2h,离心去除上清后弃上清。加入5μl乙醇胺封闭未结合的活化位点,反应30min,离心弃上清后重悬,得AgNPs@Ab1探针溶液。
步骤202,取400μl 0.5mg/mL羧基磁珠,加入5μl吐温20,反应30min后加入10μl100mM EDC和10μl 100mM NHS,反应1h,离心去除多余的活化剂,重悬。加入5μl 0.5mg/mL靶向抗原另一个表位的抗体Ab2和20μL5.0mM 4-ABP,反应2h,离心去除上清后弃上清,得MNs@Ab2/4-ABP探针溶液。
直接拉曼检测目标抗原得到的拉曼谱图不清晰,难以分析。本文引入拉曼报告分子,借助其高效稳定的SERS信号对PSA进行检测。4-氨基联苯(4-Aminodiphenyl,4-ABP)又称对氨基联苯,分子式为C12H11N,分子量为169.22,分子结构如图2。2015年,Chong等人则利用表面增强拉曼光谱技术对三种氨基联苯包括4-ABP进行了检测,得到了清晰确切的拉曼谱图。结果发现,与苯胺相比氨基联苯能够产生更大的SERS信号,且三种氨基联苯的增强顺序为4-ABP>2-ABP>3-ABP,4-ABP具有最高效的增强效果。4-ABP拉曼谱图如图3。
步骤103,将不同浓度抗原与两种拉曼探针进行混合孵育,利用拉曼光谱仪检测拉曼信号,对特征峰1143cm-1波长处的拉曼强度进行分析,解析拉曼强度与目标抗原浓度之间的关系。
在本发明实施例中,上述步骤103包括:
步骤301,取150μl AgNPs@Ab1探针溶液、50μl MNs@Ab2/4-ABP探针溶液和2μl不同浓度(0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL和1μg/mL)的抗原混匀后反应1h,进行拉曼检测。
步骤302,利用拉曼光谱仪对样品进行SERS检测,激发波长为531.7nm,积分时间为20s,积分次数为2次。每组随机选点5个测定拉曼信号,对1143cm-1波长处的拉曼强度进行计算平均值。
在本发明实施例中,在纳米粒子表面修饰抗体时,比如EDC/NHS偶联法,由于活化不具有特异性,粒子可以和抗体表面任何活化的位点结合,当通过抗原的结合位点偶联抗体时,则阻碍抗体与抗原的结合。因此,可以设想一种定向的接头,能够有效的连接抗体和纳米粒子。金黄色葡萄球菌Protein A(Staphylococcus aureus Protein A,SPA)则是一种宝贵的选择,一方面它可以特异性识别抗体的Fc端不影响抗体与抗原的结合,另一方面能够通过合适的基团与纳米粒子相连。同时考虑到纳米粒子尺寸比较小,因此考虑只采用SPA其中单独的结构域作为接头,并有望降低整个探针的免疫原性。
SPA包含五个串联的高度同源的IgG结合域组成,分别为E,D,A,B和C。其中,B结构域体积小,折叠速度快,在热力学上比E结构域更稳定,是过去十年研究最为广泛的蛋白之一。Domain Z则是Domain B的突变体,同样包含58个氨基酸,由3个α-螺旋和2个环组成,如图4。与Domain B相比,和IgG Fc的亲和力更高,同时具有高蛋白水解性、构象稳定性和高溶解度,值得注意的是,Domain Z是自然界中已知的最小的α螺旋折叠基序之一。因此,选用Domain Z作为连接物使抗体以正确的方向定位于纳米颗粒表面。
实施例1
在本发明实施例中,Domain Z表达载体的构建、表达和纯化如下:
实验仪器:PCR仪(美国Thermo Electron公司);高速离心机(美国Thermo公司);超净工作台(中国苏州净化设备厂);恒温震荡培养箱(中国智诚有限公司);恒温摇床(美国FORMA公司);生化培养箱(上海一恒科技公司);超纯水设备(美国PORMA公司);电泳仪(美国Bio-Rad公司);电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司);凝胶成像仪(中国天能公司)。
样品和试剂:2×Taq PCR Master Mix(美国Thermo Electron公司);Axygen小量质粒提取kit(美国Axygen公司);DNA快速纯化/回收试剂盒(美国Axygen公司);PCR DNA聚合酶(日本TaKaRa公司)琼脂糖(美国Sigma公司);T4 DNA连接酶(美国Thermo公司);蛋白质电泳Marker Thermo(美国)。
1、转化大肠杆菌及蛋白表达
将pET43.1a-Domain Z转化大肠杆菌BL21,该步骤与上述转化大肠杆菌DH5α一致。将菌液涂布与含有Amp抗性的LB固体培养基上,37℃过夜培养。次日早晨挑取单克隆菌株接种于10mL LB培养基中,37℃250rpm振摇培养至OD约0.4。在培养物中加入终浓度1mM的IPTG,37℃,200rpm震荡培养3h。3400rpm,4℃,20min,离心收集菌体,并对菌体进行超声破碎。
2、纯化融合蛋白
将Ni-NTAResin填充层析柱后,用10倍柱体积平衡缓冲液(300mM NaCl,50mMNaH2PO4,20mM咪唑pH8.0)平衡层析柱。将菌体破碎液离心(12000rpm,20min)后取上清,上样层析。用10倍柱体积平衡液洗涤层析柱,至洗出液达到OD280基线值。采用1倍柱体积不同浓度的咪唑进行洗脱,从洗脱峰出现前的0.5倍柱体积开始收集洗脱液。用0.1M磷酸缓冲液(pH=7.8)对收集的洗脱液进行透析。取过夜透析后的融合蛋白进行SDS-PAGE电泳。
3、融合蛋白标签切除及目的蛋白纯化
(1)首先,用凝血酶酶切缓冲液(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,PH=8.0)透析纯化后的融合蛋白。每100μg融合蛋白加入1u凝血酶,进行NusA标签切除,37℃,16h。
(2)将上述酶切后的产物进行Ni-NTAResin纯化,纯化的蛋白经超滤浓缩后继续用Ni-NTAResin纯化。上样后用10倍柱体积平衡液(300mM NaCl,50mM NaH2PO4)洗涤层析柱,至洗出液达到OD280基线值。然后先用2倍柱体积100mM咪唑洗涤层析柱,再用500mM咪唑洗涤层析柱,收集洗出液。超滤浓缩后取样进行SDS-PAGE电泳检测,并计算蛋白浓度。
3.1、Domain Z不同纯化阶段的电泳结果
对菌体破碎液上清、纯化后的融合蛋白和切除标签蛋白后的Domain Z进行SDS-PAGE凝胶电泳检测如图8。其中,Domain Z蛋白分子量为10kDa左右,符号预期计算值,但25kDa处也出现了条带,说明Domain Z蛋白之间出现了轻微聚集。如图5。
3.2、Domain Z蛋白的浓度
依次采用30KD、3KD超滤膜对融合蛋白酶切后样品进行纯化浓缩,收集3KD超滤膜截留蛋白,获得Domain Z。通过BCA蛋白定量法测得蛋白浓度约为0.27mg/ml,BSA标准曲线见图6。
经过一系列的表达纯化过程,我们得到了纯度浓度均较高的Domain Z蛋白,为进一步的检测打下基础。
下面通过具体的实验例对本发明的技术效果进行进一步阐述。
实施例2
利用拉曼均相检测方法检测PSA
前列腺特异性抗原(PSA)是前列腺癌的肿瘤标志物,与前列腺的发生息息相关,且具有明显的器官特异性。临床诊断中,一般以4.0ng/mL血清PSA含量为上限,大于该上限尤其当含量高于10ng/mL时,则预示着存在患癌风险,需要联合其他检查手段如前列腺穿刺等进一步确诊。
1、检测不同浓度的PSA
取150μl AgNPs@Ab1探针溶液、50μl MNs@Ab2/4-ABP探针溶液和2μl不同浓度(0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL和1μg/mL)的PSA混匀后反应1h,进行拉曼检测。
2、检测PSA和非PSA
取150μl AgNPs@Ab1探针溶液、50μl MNs@Ab2/4-ABP探针溶液分别和2μl 1ng/mL的PSA、血管表皮生长因子(VEFG)、白介素-8(IF-8)和嗜铬粒蛋白A(CGA)混匀后反应1h,进行拉曼检测。
3、检测结果
我们利用靶向PSA的两个探针:AgNPs@Ab1和MNs@Ab2/4-ABP对不同浓度的PSA进行检测。如图7(a)所示,随着PSA浓度的增加,4-ABP的SERS信号逐渐增强。图7(b)显示PSA浓度在0.1ng/mL~1μg/mL的范围内与4-ABP 1143cm-1处峰强度变化呈现良好的线性关系。线性方程为y=74.3x+78.9,相关系数为0.9728,实现最低的检测浓度为0.1ng/mL。
图8显示了两种针对PSA的SERS探针表现的选择性。我们使用其他分子量相似的与肿瘤相关的生物分子,如血管表皮生长因子(VEFG)、白介素-8(IF-8)和嗜铬粒蛋白A(CGA)。对1ng/mL非PSA和PSA进行SERS检测,结果表明,三种非PSA生物分子均表现出低的拉曼信号值。因此,我们所设计的SERS探针对PSA具有高选择性。
实施例3
利用拉曼均相检测方法检测TSH
促甲状腺激素(TSH)是垂体前叶产生的一种肽激素,由2条链组成:1条α链和1条β链,分子量约为28000Da。相较于垂体前叶产生的其他糖蛋白激素,TSH具有相同的α链和不同的β链。TSH对于调节甲状腺激素的释放和甲状腺的生长至关重要。TSH测试是甲状腺功能的临床一线筛查测试,其参考值范围为0.4到4.5uIU/ml。
1、检测不同浓度的TSH
准确吸取AgNPs@Ab1/4-ABP 150μL和MNs@Ab2 50μL,并添加不同浓度的人类促甲状腺激素共同孵育0.5-1小时后分别于毛细玻璃管中和标准PCR管中利用拉曼光谱仪对样品进行SERS检测,激发波长为531.7nm,设定曝光时间为5s,曝光次数为10次取平均值。每组随机选点5个测定拉曼信号对拉曼强度进行计算平均值。
2、拉曼光谱检测结果:
图9展示了毛细玻璃管中在0、0.1、2、10、20mIU/L(0、0.05、1、5、10ng/mL)hTSH浓度下的检测信号,由图中可以看到我们的SERS检测方法不仅具有较宽的检测范围,而且较低的检测限附近也同样有良好的灵敏度以及良好的梯度曲线。
图10展示了标准PCR管中在0、0.01、0.1、0.4、1、4.5、10mIU/L(0、0.005、0.05、0.2、0.5、2.25、5ng/mL)hTSH浓度下的检测信号,图中可以看到随着hTSH浓度的增加,信号峰值逐级递增,尤其以1600处与空白对照组差距明显。
实验例4
Domain Z的性质以及增强效果
金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)由常见的细菌病原体金黄色球菌产生,分子量为42kDa,包含五个串联的高度同源的IgG结合域组成,分别为E,D,A,B和C。经研究发现SPADomain B的突变体Domain Z能够只结合IgG Fc,几乎不结合IgG Fab。故Domain Z单个结构域是用于固定抗体和介导磁珠等材料修饰抗体的好选择。
实验仪器:紫外分光光度计(美国Beckman公司);超纯水设备(美国PORMA公司);电泳仪(美国Bio-Rad公司);电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司);凝胶成像仪(中国天能公司);恒温金属浴(中国蓝焰科技有限公司)。
样品和试剂:蛋白质电泳Marker Thermo(美国);Domain Z(常州基宇生物科技有限公司);兔抗鼠二抗(碧云天);EDC(阿拉丁工业公司);NHS(阿拉丁工业公司);4-ABP(阿拉丁工业公司);PSA抗体(美国Fitzgerald公司);PSA蛋白(美国Fitzgerald公司);磁性纳米颗粒(阿拉丁工业公司);其他普通化学试剂均为国产分析纯。
Domain Z对不同抗体亲和力的确定
1、包被:用包被液配制1μg/mL Domain Z,加入100μL/孔,设置复孔。用密封纸封闭酶标板,放在装有湿棉花的饭盒中,4℃过夜。
2、洗涤:加入洗涤液300μL/孔,洗3次。
3、封闭:洗涤后加入1%BSA溶液300μL/孔,37℃孵育2h。
4、一抗孵育:分别用PBS将靶向PSA的一对抗体Ab1和Ab2稀释至1μg/mL,加入100μL/孔,同时设置空白组(不加Ab1或Ab2,其他实验条件与样品组一致),37℃孵育1h。
5、IgG Fc封闭:用PBS稀释IgG Fc至3μg/mL,加入IgG Fc 100μL/孔,37℃孵育45min。
6、洗涤:300μL/孔,3min,洗3次。
7、二抗孵育:用PBS按1:3000稀释二抗,100μL/孔,37℃孵育45min。
8、底物显色:洗涤后每孔加入100μL TMB底物,37℃,20min。
9、洗涤:洗涤液300μL/孔,3min,洗3次。
10、终止反应及检测:加入终止液稀硫酸,100μL/孔。30min内利用酶标仪检测A450nm。
在磁性纳米颗粒表面偶联Domain Z
通过EDC/NHS活化法将Domain Z偶联到磁性纳米颗粒表面,并利用BCA蛋白定量法对上清中未连接到磁珠表面的Domain Z进行测定,间接计算偶联率。
一、在磁性纳米颗粒表面偶联Domain Z
活化缓冲液:0.1M MES(2-吗啉乙磺酸),0.5M NaCl,pH=6.0
偶联缓冲液:0.1M磷酸钠,0.15M NaCl,pH=7.2
(1)取0.5mg磁性纳米颗粒,先用500μL活化缓冲液洗三次,磁力分离架。
(2)加入0.4mg EDC和0.6mg NHS至反应体系中。
(3)利用移液枪吹打混匀后,置于振荡仪上室温反应15min。
(4)加入500μL偶联缓冲液,洗三次。然后加入20μL的0.5mg/mL Domain Z,反应1h。
(5)磁珠用PBS储存。留上清,通过BCA测定偶联率。
二、利用BCA蛋白定量法计算Domain Z在磁性纳米颗粒的偶联率
制备SERS探针MNs@Domain Z@Ab2/4-ABP并进行SERS检测
1、制备MNs@Domain Z@Ab2/4-ABP探针
(1)取0.5mg磁性纳米颗粒,先用500μL活化缓冲液洗三次,磁力分离架。加入0.4mgEDC和0.6mg NHS至反应体系中,混匀后,室温反应15min。
(2)加入500μL偶联缓冲液,洗三次。然后加入20μL的0.5mg/mL Domain Z和20μL5.0mM 4-ABP,反应1h。
(3)加入5μl 0.5mg/mL靶向抗原抗体Ab2,反应2h,离心去除上清后弃上清。
(4)加入5μl 0.5mg/mL IgG Fc反应30min,封闭未结合抗体的Domain Z,得MNs@Domain Z@Ab2/4-ABP探针溶液。
2、利用拉曼均相检测方法检测PSA
对偶联了Domain Z的磁性纳米颗粒继续修饰抗体和拉曼报告分子4-ABP,得SERS探针MNs@Domain Z@Ab2/4-ABP。同时以没有Domain Z修饰的SERS探针MNs@Ab2/4-ABP作为对照组,对1ng/mL PSA进行SERS检测。每组随机选点5个测定拉曼信号,对1143cm-1波长处的拉曼强度进行计算平均值。激发波长为531.7nm,积分时间为20s,积分次数为2次。
Domain Z对不同抗体亲和力的确定
利用ELISA实验检测Domain Z对靶向PSA抗体Ab1和Ab2的识别情况。在酶标板上包被1μg/mL Domain Z,分别加入Ab1和Ab2,同时设置空白组即不加入Ab1或Ab2,其他条件与样品组保持一致。用IgG Fc封闭后加入二抗。其中,空白组无颜色变化,表明IgG Fc能够有效封闭Domain Z。Ab2组有强吸光度值,Ab1组无吸光度值,表明Ab2能够与Domain Z良好结合,Ab1则与Domain Z几乎没有亲和力。
表1 Domain Z对不同抗体亲和力的确定
BCA蛋白定量结果及Domain Z的偶联率
Domain Z在磁珠上的偶联量直接关系着后续抗体的修饰量,磁珠上存在足够的Domain Z才能保证有效连接抗体。因此通过BCA定量法对在磁性纳米颗粒表面偶联DomainZ实验中上清残余的Domain Z即未与磁珠结合的Domain Z,根据加入量间接计算偶联量。标准曲线如图12,线性相关系数为0.9956,将Domain Z的吸光度值带入线性方程y=0.3321x+0.7254计算上清中Domain Z的含量为10.84μg/mL,即上清中残余Domain Z的含量为5.42μg,故磁珠上Domain Z的偶联率为45.8%。
应用SERS探针MNs@Domain Z@Ab2/4-ABP检测PSA的结果
Domain Z能够结合抗体的Fc段,作为连接物,能够使磁性纳米颗粒表面定向修饰有效抗体,进而提高其作为SERS探针的灵敏度。由Domain Z对不同抗体亲和力的确定实验可知,Domain Z对Ab2具有高亲和力,因此将Domain Z加入MNs@Ab2/4-ABP探针中,制备MNs@Domain Z@Ab2/4-ABP。将修饰了Domain Z的探针应用到拉曼检测中,与未修饰Domain Z的探针作为比较,检测1ng/mL PSA的拉曼结果如图12。经过Domain Z修饰后的探针所得检测结果,其拉曼信号值更高,说明Domain Z能够通过定向修饰抗体,使得探针MNs@Domain Z@Ab2/4-ABP比MNs@Ab2/4-ABP具有更高的SERS灵敏度。
Claims (7)
1.一种利用抗体识别结合抗原的拉曼均相非诊断目的检测方法,其特征在于 ,包括以下步骤:
A、通过柠檬酸钠还原法制备银纳米颗粒,利用EDC/NHS活化剂将连接物或抗体、拉曼报告分子偶联到银纳米颗粒以及磁性纳米颗粒表面,再通过连接物将抗体进行定向修饰,制备得到两种靶向目标抗原的拉曼探针;
B、利用拉曼探针检测特定抗原:
B1、将步骤A所得的两个拉曼探针和不同浓度的特定抗原混匀后反应1h,取样于玻璃毛细管、PCR管或玻片上进行拉曼检测;
B2、利用拉曼光谱仪对检测样品进行拉曼检测,激发波长为531.7 nm,积分时间为20s,积分次数为2次;每组随机选点5个测定拉曼信号,对1143cm-1波长处的拉曼强度进行计算平均值;
所述拉曼探针的制备,具体包括以下步骤:
A1、以硝酸银、柠檬酸钠为原料,通过柠檬酸钠还原法制备银纳米颗粒;
A2、所制备的银纳米颗粒表面含有羧基,以N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺为交联剂,即通过EDC-NHS两步活化法将抗体偶联至银纳米颗粒表面;
A3、磁性纳米颗粒表面含有羧基,以N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺为交联剂,即通过EDC-NHS两步活化法将连接物偶联至磁性纳米颗粒表面;
A4、通过EDC/NHS将连接物修饰至纳米颗粒表面,再加入抗体,使抗体以正确的方向定位于纳米颗粒表面,提高拉曼探针的检测效率;所述连接物为Domain Z;
所述Domain Z的单体的序列为:
VDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKHHHHHHCCC
其二联体序列为:
HHHHHHVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKGGGGSVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
其四联体序列为:
HHHHHHVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKGGGGSVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKGGGGSVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKGGGGSVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK。
2.根据权利要求1所述的一种利用抗体识别结合抗原的拉曼均相非诊断目的检测方法,其特征在于,步骤A1,所述银纳米颗粒的制备,具体包括以下步骤:
A11、将三口烧瓶浸泡于王水中过夜,使用前用大量去离子水冲洗,以去除杂质避免引起银纳米颗粒聚集;
A12、使用电子天平称量0.018 g硝酸银,转移到250 mL三口烧瓶中,随即加入100 mL去离子水;设定加热套的温度为100℃加热至微沸,随即加入2 mL 1%的柠檬酸钠溶液;溶液颜色变为灰绿色时,降温至97℃,保持微沸,反应40-50 min后冷却至室温,便得到银溶胶;
A13、通过紫外分光光度计检测银溶胶,观察最大吸收波长处的吸光度,根据Lambert-Beer定律计算银溶胶的浓度。
3.根据权利要求1所述的一种利用抗体识别结合抗原的拉曼均相非诊断目的检测方法,其特征在于,步骤A2,所述银纳米颗粒的制备,具体包括以下步骤:
A21、浓缩银溶胶,加入10 μl吐温20,轻轻震摇30 min;再加入10 μl 2.5 mM EDC和10μl 2.5 mM NHS,置于水平振荡器上震摇1h,离心去除多余的活化剂,用1 mL去离子水重悬;
A22、加入5 μl 0.5 mg/mL靶向抗原的抗体Ab1,反应2 h,离心去除上清后弃上清;
A23、加入5 μl 乙醇胺封闭未结合的活化位点,反应30 min,离心弃上清后重悬,得AgNPs@Ab1探针溶液。
4.根据权利要求1所述的一种利用抗体识别结合抗原的拉曼均相非诊断目的检测方法,其特征在于,步骤A3,所述银纳米颗粒的制备,具体包括以下步骤:
A31、取400 μl 0.5 mg/mL羧基磁珠,加入5 μl 吐温20,反应30min后加入10 μl 100mM EDC和10 μl 100 mM NHS,反应1 h,离心去除多余的活化剂,重悬;
A32、加入5 μl 0.5 mg/mL 靶向抗原另一个表位的抗体Ab2,反应2 h,离心去除上清后弃上清,得MNs@Ab2探针溶液。
5.根据权利要求1所述的一种利用抗体识别结合抗原的拉曼均相非诊断目的检测方法,其特征在于,步骤A1,所述银纳米颗粒的粒径为50nm,粒径均一。
6.根据权利要求1所述的一种利用抗体识别结合抗原的拉曼均相非诊断目的检测方法,其特征在于,步骤A4,以Domain Z作为连接物,应用于纳米颗粒表面抗体的修饰,其具体步骤如下:
A41、使用活化缓冲液将磁性纳米颗粒洗三次,加入EDC和NHS至反应体系中,混匀后,室温反应15min;
A42、加入偶联缓冲液,洗三次;然后加入Domain Z和4-ABP,反应1h;
A43、加入靶向抗原的抗体Ab,反应2 h,离心去除上清后弃上清;
A44、加入IgG Fc反应30min,封闭未结合抗体的Domain Z,得MNs@Domain Z@Ab/4-ABP探针溶液。
7.根据权利要求1所述的一种利用抗体识别结合抗原的拉曼均相非诊断目的检测方法,其特征在于:步骤B2,所述检测样品为血清、尿液等体液中蛋白、多肽等生物大分子。
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