CN107290423A - 纳米酶原位定量细胞膜蛋白表达量的方法 - Google Patents

纳米酶原位定量细胞膜蛋白表达量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及使用纳米酶原位定量细胞膜蛋白表达量的方法，所述方法包括使纳米酶与细胞膜蛋白接触和通过与所述细胞膜蛋白结合的纳米酶原位定量所述细胞膜蛋白的表达量，其中，所述纳米酶含有与所述细胞膜蛋白结合的靶向肽。使用本发明的方法，能够快速的、准确的、可视化的原位定量细胞膜蛋白表达量。

Description

纳米酶原位定量细胞膜蛋白表达量的方法
技术领域
本发明涉及一种细胞膜蛋白的定量方法，更具体的，本发明涉及使用纳米酶原位定量细胞膜蛋白的方法。
背景技术
纳米酶是一类既有纳米材料的独特性能，又有催化功能的模拟酶。鉴于纳米酶既有天然酶的高催化活性，又有性质稳定而经济的特点，自2007年以来，纳米酶的研究迅速崛起，研究的涉及面也逐渐广泛，目前已经包括材料科学、物理、化学、生物、医学和环境等不同领域。
传统的膜蛋白定量方法包括将细胞裂解，进行简单分离纯化，然后利用酶联免疫分析方法对所分离的蛋白粗提物进行定量分析。但是，传统方法面临很多问题，例如膜蛋白提取和纯化过程不可避免地存在蛋白损失，直接分析粗提蛋白或者复杂的生物样本将面临背景杂蛋白干扰，过程复杂而繁琐，从而很难实现细胞膜蛋白的快速准确定量。
因此，目前急需建立一种快速的、准确的、可视化的原位定量细胞膜蛋白表达量的分析方法。
发明内容
本申请提供了快速的、准确的、可视化的原位定量细胞膜蛋白表达量的方法。
具体的，本申请涉及一种原位定量细胞膜蛋白表达量的方法，所述方法包括：
1)使纳米酶与细胞膜蛋白接触；和
2)通过与细胞膜蛋白结合的纳米酶原位定量细胞膜蛋白表达的量，
其中，所述纳米酶含有与所述细胞膜蛋白结合的靶向肽。
在一些实施方案中，所述纳米酶由金属纳米颗粒核心和靶向肽外壳组成。
在一些实施方案中，纳米酶可以是由金属纳米颗粒核心和靶向肽外壳组成的纳米酶颗粒或纳米酶团簇。
在一些实施方案中，用于纳米酶的金属为本身在待测细胞中含量低的金属，例如金或银。
在一些实施方案中，纳米酶中的靶向肽是经过模板蛋白修饰的靶向肽，例如连接有牛血清白蛋白(BSA)的靶向肽。在一些实施方案中，模板蛋白(例如BSA)与靶向肽通过酰胺键连接或者通过偶氮键连接。
在一些实施方案中，模板蛋白(例如BSA)与靶向肽偶联是通过碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应形成酰胺键。具体的，模板蛋白(例如BSA)与靶向肽偶联是通过靶向肽的氨基首先与琥珀酸酐反应形成琥珀酸半酯，再经过EDC催化，与蛋白质形成了酰胺键。
在一些实施方案中，模板蛋白(例如BSA)与靶向肽偶联是通过重氮盐修饰的靶向蛋白(例如BSA)与模板肽中的酪氨酸残基上的邻位发生反应形成偶氮键。
在一些实施方案中，所述模板蛋白选自：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、转铁蛋白及其它水溶性蛋白。
在一些实施方案中，所述纳米酶颗粒通过以下步骤获得：
1)将胱胺二盐酸盐在室温下与金属盐溶液混合溶解，搅拌后加入NaBH4水溶液搅拌反应，之后离心获得胶体纳米金属颗粒；
2)将多肽水溶液在室温下与步骤1)获得的纳米金属颗粒混合并反应，离心获得纳米酶颗粒。
在一些实施方案中，所述纳米酶团簇通过以下步骤获得：
1)将靶向肽与EDC和NHS混合溶解搅拌，从而激活靶向肽的羧基，然后将模板蛋白(例如BSA)与上述混合物混合，室温下继续搅拌过夜，透析获得模板蛋白修饰的靶向肽；
2)将金属盐溶液与步骤1)获得的修饰的靶向肽溶液混合，之后加入NaOH溶液调节pH值到12，所形成的溶液继续在37℃搅拌，超滤获得纳米酶团簇。
在一些实施方案中，所使用的金属盐溶液可以是，例如HAuCl4、AgNO3溶液。
在一些实施方案中，所述靶向肽是天然来源或者合成的多肽，其可以靶向细胞膜蛋白，例如靶向整合素(例如GPIIb/IIIa、αvβ3)的多肽，如靶向肽为H2N-CKKKKQAGDV-COOH或H2N-GRGDSC-COOH；靶向表皮生长因子受体的多肽，如靶向肽为H2N-CLARLLT-COOH；靶向胰岛素样生长因子受体的多肽，如靶向肽为H2N-CSKAPKLPAAYC-COOH；靶向钙粘连蛋白的多肽，如靶向肽为H2N-CLFSHAVSSNG-COOH等。
在一些实施方案中，靶向整合素GPIIb/IIIa的靶向肽的序列为：H2N-CKKKKQAGDV-COOH(SEQ ID NO.1：)。
在一些实施方案中，靶向整合素αvβ3的靶向肽的序列为：H2N-GRGDSC-COOH(SEQ ID NO.2：)。
在一些实施方案中，所述原位定量通过以下进行：
1)使用酶联免疫的方法而进行；或者
2)使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)定量金属元素的含量而进行。
在一些实施方案中，酶联免疫方法通过化学显色反应(利用吸光度)或者荧光反应(利用荧光强度)而进行，例如使用对过氧化物酶催化敏感的化学试剂作为显色底物或发光底物，例如3',3',5',5',-四甲基联苯胺(TMB)、重氮胺基苯(diazoaminobenzene,DAB)、邻苯二胺(o-phenylenediamine,OPD)、Amplex Red、对苯二甲酸(Terephthalic acid,TA)或二氢乙锭(Hydroethidine,HE)等。
在一些实施方案中，酶联免疫方法通过纳米酶催化H2O2与DAB生成棕黄色产物而利用吸光度进行原位定量。
在一些实施方案中，酶联免疫方法通过纳米酶催化H2O2与OPD生成橘色产物而利用吸光度进行原位定量。
在一些实施方案中，酶联免疫方法通过纳米酶催化H2O2与TA反应生成发蓝色荧光而利用荧光强度进行原位定量。
在一些实施方案中，酶联免疫方法通过纳米酶催化H2O2与HE反应生成发红色荧光产物而利用荧光强度进行原位定量。
在一些实施方案中，所述酶联免疫的方法包括制备标准曲线的过程。
附图说明
图1：针对细胞膜蛋白整合素GPIIb/IIIa的金纳米酶颗粒的高分辨透射电镜图。
图2：(a)利用金纳米酶颗粒进行的微孔板式酶联免疫反应(ELISA)的反应原理。(b)是利用所制备的针对细胞膜蛋白整合素GPIIb/IIIa的金纳米酶颗粒制备的酶联免疫反应的标准曲线。
图3：(a)利用金纳米酶原位定量细胞膜蛋白的反应原理。(b)是利用所制备的针对细胞膜蛋白整合素GPIIb/IIIa的金纳米酶颗粒原位定量膜蛋白表达量。
图4是针对细胞膜蛋白整合素αvβ3的银纳米酶颗粒的高分辨透射电镜图。
图5是利用所制备的针对细胞膜蛋白整合素αvβ3的银纳米酶颗粒制备的酶联免疫反应的标准曲线。
图6是利用所制备的针对细胞膜蛋白整合素αvβ3的银纳米酶颗粒原位定量膜蛋白表达量。
图7是针对细胞膜蛋白整合素GPIIb/IIIa的金纳米酶团簇的高分辨透射电镜图。
图8是利用所制备的针对细胞膜蛋白整合素GPIIb/IIIa的金纳米酶团簇制备的酶联免疫反应的标准曲线。
图9是利用所制备的针对细胞膜蛋白整合素GPIIb/IIIa的金纳米酶团簇原位定量膜蛋白表达量。
图10是针对细胞膜蛋白整合素αvβ3的银纳米酶团簇的高分辨透射电镜图。
图11是利用所制备的针对细胞膜蛋白整合素αvβ3的银纳米酶团簇制备的酶联免疫反应的标准曲线。
图12是利用所制备的针对细胞膜蛋白整合素αvβ3的银纳米酶团簇原位定量膜蛋白表达量。
具体实施方式
下面将结合附图及实施例对本发明进行详细描述，以便于本领域技术人员理解和实施本发明，并进一步认识本发明的优点。
除非在本发明说明书中另有定义，否则在此所有的技术术语都是根据本领域一般技术人员所通常使用和理解的惯用定义来使用。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：针对整合素GPIIb/IIIa通过配体交换法制备纳米酶
在本实施例中，采用金纳米颗粒，靶向肽是靶向细胞膜蛋白整合素GPIIb/IIIa的多肽。
1)制备巯基小分子保护的金纳米颗粒
在室温下将600μL的150mM胱胺二盐酸盐与20mL的3.0mM HAuCl4混合溶解，搅拌30分钟。随后加入25μL浓度为500mM的NaBH4水溶液，室温下继续搅拌反应30分钟后，得到了红色的胶体分散液。之后，用截流分子量为100kDa的超滤管,7500rpm转速下离心5分钟来浓缩胶体金纳米颗粒。
2)制备含金纳米颗粒核心和多肽外壳的纳米酶
1mL包含2.5mg多肽(SEQ ID NO.1：H2N-CKKKKQAGDV-COOH)的水溶液在室温下与1mL浓度为250nM的步骤1)制备的巯基小分子保护的金纳米颗粒混合，室温下反应6h。之后，用截流分子量为100kDa的超滤管,7500rpm转速下离心5分钟来浓缩多肽保护的金纳米颗粒(多肽-金纳米颗粒，也即纳米酶)。由此获得的纳米酶在4℃下至少可以稳定存在一个月。图1显示出纳米酶的平均粒径在3.8nm左右。
实施例2：使用纳米酶原位定量细胞膜蛋白整合素GPIIb/IIIa
利用实施例1制备的纳米酶通过酶联免疫分析来原位定量细胞膜蛋白表达量的方法，包括下述步骤：
1)建立标准曲线
2ug/mL的针对目标整合素GPIIb/IIIa的多克隆抗体(人血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIa ELISA检测试剂盒，北京杰辉博高生物技术有限公司)首先以100uL/孔包被在酶标板的底部，之后将含3％BSA的PBS加入各个孔板中阻断非特异性结合位点1小时，随后将50μL浓度为0、31.25、62.5、125、250和375ng mL-1的整合素GPIIb/IIIa(人血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIa ELISA检测试剂盒，北京杰辉博高生物技术有限公司)标准液加入到孔板中，然后加入浓度为250nM的50μL实施例1制备的纳米酶，室温下孵育30分钟。用PBS清洗各个孔板后，加入100μL含800μM TMB和200mM H2O2的水溶液，在37℃条件下催化反应30分钟后，采用酶标仪记录每个孔在652nm处的吸光度。以整合素GPIIb/IIIa浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标建立标准曲线(图2)。由图2结果获知，梯度的整合素GPIIb/IIIa捕获梯度的纳米酶，对应着梯度的催化显色，且标准曲线的线性关系良好(R2＝0.99)。
2)原位定量膜蛋白表达量
将人红白血病(HEL)细胞接种到96孔板中并使孔板中细胞增殖到0、0.5×104、1.0×104、1.5×104、2.0×104和2.5×104个/孔的细胞梯度。接下来，将含3％BSA的PBS溶液加入各个孔板中阻断非特异性结合位点1小时。随后用125nM的100μL实施例1制备的纳米酶标记细胞30分钟，然后用PBS冲洗细胞。之后，加入100μL含800μM TMB和200mM的H2O2水溶液，在37℃条件下催化反应30分钟后，采用酶标仪记录每个孔在652nm处的吸光度。将每个孔中的吸光度代入标准曲线中定量计算整合素GPIIb/IIIa在单细胞上的表达量(图3)。
由图3显示的结果可见，在肿瘤细胞的原位免疫分析中，梯度数目的细胞含有梯度的蛋白会识别梯度的纳米酶，在同样的分析条件下，对应着梯度的催化显色，且线性关系良好(R2＝0.99)。
将这部分显色结果代入到标准曲线中，可计算单细胞中的整合素GPIIb/IIIa的表达量。如研究0.5×104个HEL细胞上的整合素GPIIb/IIIa的表达量，由图3中获知0.5×104个HEL细胞对应着体系的吸光度为0.16,将该吸光度数值带入到标准曲线(图2)中，对应整合素GPIIb/IIIa的浓度为200ngmL-1。再根据标准品整合素GPIIb/IIIa的体积，分子量，可定量计算单细胞中的整合素GPIIb/IIIa的表达量为6.4×106。
同时，由于纳米酶含有金元素的质量信息，也可以通过ICP-MS定量金元素含量反推蛋白表达量。采用ICP-MS分析方法测得的单个HEL细胞表面的GPIIb/IIIa表达量为5.9×106，二者结果非常接近，从而验证了原位类酶免疫分析方法的准确性。另外，由以上实验可以看出，本实施例的方法可灵敏地对5000个细胞进行分析。
实施例3：针对整合素αvβ3通过配体交换法制备纳米酶
在本实施例中，采用银纳米颗粒，靶向肽是靶向人细胞膜蛋白整合素αvβ3的多肽。
1)制备巯基小分子保护的银纳米颗粒
在室温下将500μL的150mM胱胺二盐酸盐与15mL的2.0mM AgNO3混合，搅拌30分钟。随后加入20μL浓度为400mM的NaBH4水溶液，室温下继续搅拌反应30分钟后，得到了黄色的胶体分散液。之后，用截流分子量为100kDa的超滤管,7500rpm转速下离心5分钟浓缩胶体银纳米颗粒。
2)制备含银纳米颗粒核心和多肽外壳的纳米酶
1mL包含2.5mg的多肽(SEQ ID NO.2：H2N-GRGDSC-COOH)水溶液在室温下与1mL浓度为200nM的步骤1)制备的巯基小分子保护的银纳米颗粒混合，室温下反应6小时。之后，用截流分子量为100kDa的超滤管,7500rpm转速下离心5分钟浓缩多肽保护的银纳米颗粒(多肽-银纳米颗粒，也即纳米酶)。由此获得的纳米酶在4℃下至少可以稳定存在一个月。图4显示出纳米酶的平均粒径在4.5nm左右。
实施例4：使用纳米酶原位定量细胞膜蛋白整合素αvβ3
利用实施例3制备的纳米酶通过酶联免疫分析来原位定量膜蛋白表达量方法，包括下述步骤：
1)建立标准曲线
2ug/mL针对目标整合素αvβ3的多克隆抗体(人整合素αvβ3酶联免疫吸附分析试剂盒，上海联硕生物科技有限公司)首先以100uL/孔包被在酶标板的底部，之后用含3％BSA的PBS加入各个孔板中阻断非特异性结合位点1小时。随后将50μL的浓度为0、31.25、62.5、125、250和375ng mL-1的整合素αvβ3(人整合素αvβ3酶联免疫吸附分析试剂盒，上海联硕生物科技有限公司)标准液加入到孔板中，然后加入50μL的200nM实施例3制备的纳米酶，室温下孵育30分钟。用PBS清洗各个孔板后，加入100μL含600μM TMB和100mM H2O2的水溶液，在37℃条件下催化反应30分钟后，采用酶标仪记录每个孔在652nm处的吸光度。以整合素αvβ3浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标建立标准曲线(图5)。由图5结果获知，梯度的整合素αvβ3捕获梯度的纳米酶，对应着梯度的催化显色，且线性关系良好(R2＝0.98)。
2)原位定量膜蛋白表达量
将肺癌细胞A 549接种到96孔板中并使孔板中细胞增殖到0、0.5×104、1.0×104、1.5×104、2.0×104和2.5×104个/孔的细胞梯度。接下来，将含3％BSA的PBS溶液加入各个孔板中阻断非特异性结合位点1小时。随后用100nM的100μL实施例3制备的纳米酶标记细胞30分钟，然后用PBS冲洗细胞。之后，加入100μL含600μM TMB和100mM的H2O2水溶液，在37℃条件下催化反应30分钟后，采用酶标仪记录每个孔在652nm处的吸光度。将每个孔中的吸光度代入标准曲线中定量计算整合素αvβ3在单细胞上的表达量(图6)。
由图6的结果可以看出，在肿瘤细胞的原位免疫分析中，梯度数目的细胞含有梯度的蛋白会识别梯度的纳米酶，在同样的分析条件下，对应着梯度的催化显色，且线性关系良好(R2＝0.98)。
将这部分显色结果代入到标准曲线中，可计算单细胞中的整合素αvβ3的表达量。如研究0.5×104个A549细胞上的整合素αvβ3的表达量，由图6中获知0.5×104个A549细胞对应着体系的吸光度为0.040,将该吸光度数值带入到标准曲线(图5)中，对应整合素αvβ3的浓度为30ng mL-1。再根据标准品整合素αvβ3的体积、分子量，可定量计算单细胞中的整合素αvβ3的表达量为9.0×105。
同时，由于纳米酶含有银元素的质量信息，也可以通过ICP-MS定量银元素含量反推蛋白表达量。采用ICP-MS分析方法测得的单个A549细胞表面的αvβ3表达量为7.9×105，二者结果非常接近，从而验证了原位类酶免疫分析方法的准确性。
另外，由以上实验可以看出，本实施例的方法可灵敏地对5000个细胞进行分析。
实施例5：针对整合素GPIIb/IIIa通过生物分子模板制备纳米酶
在本实施例中，采用具有更小尺寸的、光吸收截面积更小的金团簇，靶向肽是靶向HEL细胞膜蛋白整合素GPIIb/IIIa的多肽。
1)制备BSA修饰的靶向肽
将带有羧基的靶向肽(SEQ ID NO.1：H2N-CKKKKQAGDV-COOH)在室温下与EDC和NHS按照摩尔比1.0:1.0:0.5混合溶解，搅拌(500rpm)30分钟，激活多肽的羧基。然后将250mg BSA与上述混合物混合，室温下继续搅拌(500rpm)过夜。多肽与BSA之间通过形成酰胺键而连接。产物用截留量8000-12000的透析袋透析12小时，冻干备用。
2)制备纳米酶
利用步骤1)制备的BSA修饰的靶向肽作为矿化模板用于生物矿化金团簇。具体的，将5mL浓度为10mM的HAuCl4溶液与5mL浓度为50mg mL-1的步骤1)制备的BSA修饰的多肽蛋白溶液混合，室温搅拌30分钟，之后加入0.5mL浓度为1M的NaOH溶液调节pH值到12，所形成的溶液继续在37℃搅拌12小时，所合成的多肽修饰的金团簇用截留量3000的超滤管超滤除掉游离的金属离子。图7显示出多肽修饰的金团簇(即纳米酶)的平均粒径在2.0nm左右。
该实施例制备的多肽修饰的金团簇的光吸收截面积小，可用于催化以荧光信号为酶联免疫反应读出信号的分析方法。
实施例6：使用纳米酶原位定量细胞膜蛋白整合素GPIIb/IIIa
利用实施例5制备的纳米酶通过酶联免疫分析来原位定量细胞膜蛋白整合素GPIIb/IIIa表达量的方法，包括下述步骤：
1)建立标准曲线
2ug/mL针对目标整合素GPIIb/IIIa的多克隆抗体(人血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIa ELISA检测试剂盒，北京杰辉博高生物技术有限公司)首先以100uL/孔包被在酶标板的底部，之后用含3％BSA的PBS加入各个孔板中阻断非特异性结合位点1小时，随后将50μL浓度为0、31.25、62.5、125、250和375ng mL-1的整合素GPIIb/IIIa(北京杰辉博高生物技术有限公司)标准液加入到孔板中，然后加入50μL的20μM实施例5制备的纳米酶，室温下孵育30分钟。用PBS清洗各个孔板后，加入100μL含20μM Amplex Red和1.0mM H2O2水溶液。在37℃条件下催化反应30分钟后，采用酶标仪记录每个孔在波长为585nm处的荧光强度，此荧光发射波长对应于氧化的Amplex Red的中心荧光发射波长。以整合素GPIIb/IIIa浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标建立标准曲线(图8)。由图8结果获知，梯度的整合素GPIIb/IIIa捕获梯度的纳米酶，对应着梯度的催化显色，且线性关系良好(R2＝0.99)。
2)原位定量膜蛋白整合素GPIIb/IIIa表达量
将HEL细胞接种到96孔板中并使孔板中细胞增殖到0、0.1×104、0.5×104、1.0×104、1.5×104、2.0×104个/孔的细胞梯度。接下来，将含3％BSA的PBS溶液加入各个孔板中阻断非特异性结合位点1小时。随后用10μM的100μL实施例5制备的纳米酶标记细胞30分钟，然后用PBS冲洗细胞。之后，加入100μL含20μM Amplex Red和1.0mM的H2O2水溶液，在37℃条件下催化反应30分钟后，采用酶标仪记录每个孔在585nm处的荧光强度。将每个孔中的荧光强度代入标准曲线中定量计算整合素GPIIb/IIIa在单细胞上的表达量(图9)。
由图9的结果可以看出，在肿瘤细胞的原位免疫分析中，梯度数目的细胞含有梯度的蛋白会识别梯度的纳米酶，在同样的分析条件下，对应着梯度的催化显色，且线性关系良好(R2＝0.99)。
将这部分显色结果代入到标准曲线中，可计算单细胞中的整合素GPIIb/IIIa的表达量。如研究0.5×104个HEL细胞上的整合素GPIIb/IIIa的表达量，由图9中获知0.5×104个HEL对应着体系的荧光发射强度为310,将该荧光发射强度数值带入到标准曲线(图8)中，对应整合素GPIIb/IIIa的浓度为211ng mL-1。
再根据标准品整合素GPIIb/IIIa的体积、分子量，可定量计算单细胞中的整合素GPIIb/IIIa的表达量为6.7×106。
同时，由于纳米酶含有金元素的质量信息，也可以通过ICP-MS定量金元素反推蛋白含量。采用ICP-MS分析方法测得的单个HEL细胞表面的GPIIb/IIIa表达量为5.2×106，二者结果非常接近，从而验证了原位类酶免疫分析方法的准确性。
另外，由以上实验可以看出，本实施例的方法可灵敏地对1000个细胞进行分析。
实施例7：针对整合素αvβ3通过生物分子模板法制备纳米酶
在本实施例中，采用银团簇，靶向肽是靶向A549细胞膜蛋白整合素αvβ3。
1)制备BSA修饰的多肽蛋白
将带有羧基的多肽(SEQ ID NO.2：H2N-GRGDSC-COOH)在室温下与EDC和NHS按照摩尔比1.0:1.2:0.6混合溶解，搅拌30分钟，激活多肽的羧基。然后将300mg BSA与上述混合物混合，室温下继续以500rpm转速搅拌过夜，产物用截留量8000-12000的透析袋透析12小时，冻干备用。
2)制备纳米酶
将5mL浓度为20mM的AgNO3溶液与5mL浓度为60mg mL-1的步骤1)制备的BSA修饰的多肽蛋白溶液混合，室温搅拌30分钟，之后加入0.5mL浓度为1M的NaOH溶液调节pH值到12，所形成的溶液继续在37℃搅拌12小时。所合成的多肽修饰的银团簇用截留分子量为3000的超滤管超滤除掉游离的金属离子。图10显示出多肽修饰的银团簇(即纳米酶)的平均粒径在1.5nm左右。
实施例8：使用纳米酶原位定量细胞膜蛋白整合素αvβ3
利用实施例7制备的纳米酶通过酶联免疫分析来原位定量细胞膜蛋白整合素αvβ3表达量的方法，包括下述步骤：
1)建立标准曲线
2ug/mL针对目标整合素αvβ3的多克隆抗体(人整合素αvβ3酶联免疫吸附分析试剂盒，上海联硕生物科技有限公司)首先以100uL/孔包被在酶标板的底部，之后用含3％BSA的PBS加入各个孔板中阻断非特异性结合位点1小时。随后将50μL浓度为0、7.81、31.25、62.5、125、250ng mL-1的整合素αvβ3(人整合素αvβ3酶联免疫吸附分析试剂盒，上海联硕生物科技有限公司)标准液加入到孔板中，然后加入50μL的40μM实施例7制备的纳米酶，室温下孵育30分钟。用PBS清洗各个孔板后，加入100μL含20μM AmplexRed和1.0mM H2O2水溶液。在37℃条件下催化反应30分钟后，采用酶标仪记录每个孔在585nm处的荧光强度，此荧光发射波长对应于氧化的Amplex Red的中心荧光发射波长。以目标蛋白浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标建立标准曲线(图11)。由图11结果获知，梯度的目标蛋白捕获梯度的纳米酶，对应着梯度的催化显色，且线性关系良好(R2＝0.99)。
2)原位定量膜蛋白表达量
将A549细胞接种到96孔板中并使孔板中细胞增殖到0、0.1×104、0.5×104、1.0×104、1.5×104、2.0×104个/孔的细胞梯度。接下来，将含3％BSA的PBS溶液加入各个孔板中阻断非特异性结合位点1小时。随后用20μM的100μL实施例7制备的纳米酶标记细胞30分钟，然后用PBS冲洗细胞。之后，加入100μL含20μM的Amplex Red和1.0mM的H2O2水溶液。在37℃条件下催化反应30分钟后，采用酶标仪记录每个孔在585nm处的荧光强度。将每个孔中的荧光强度代入标准曲线中定量计算整合素αvβ3在单细胞上的表达量(图12)。
由图12的结果可以看出，在肿瘤细胞的原位免疫分析中，梯度数目的细胞含有梯度的蛋白会识别梯度的探针，在同样的分析条件下，对应着梯度的催化显色，且线性关系良好(R2＝0.99)。
将这部分显色结果代入到标准曲线中，可计算单细胞中的整合素αvβ3的表达量。如研究0.5×104个A549细胞上的整合素αvβ3的表达量，由图12中获知0.5×104个HEL对应着体系的荧光发射强度为103,将该荧光发射强度数值带入到标准曲线(图11)中，对应整合素αvβ3的浓度为31ng mL-1。
再根据标准品整合素αvβ3的体积，分子量，可定量计算单细胞中的整合素αvβ3的表达量为9.3×105。
同时，由于纳米酶含有银元素的质量信息，也可以通过ICP-MS定量银元素含量反推蛋白表达量。采用ICP-MS分析方法测得的单个A549细胞表面的αvβ3表达量为8.3×105，二者结果非常接近，从而验证了原位类酶免疫分析方法的准确性。
另外，由以上实验可以看出，本实施例的方法可灵敏地对1000个细胞进行分析。
结论
我们分别以配体交换法与生物分子模板法制备了小粒径的金属纳米颗粒和金属纳米团簇作为纳米酶。多肽外壳可以特异性识别细胞表面的标记物分子。利用纳米酶对底物的吸光度或荧光强度的催化放大实现原位酶联免疫分析检测。该方法利用纳米酶选择性识别与催化性质，在细胞水平上实现了目标蛋白的原位标记与准确定量。该定量方法简单、直接，无需经过纯化和分离。同时，由于纳米酶携带金属元素的质量信息，也可利用电感耦合等离子体质谱对元素定量，反推蛋白表达量，检验纳米酶催化定量结果。根据金属元素种类不同，可采用细胞本底元素极低的Au或者Ag元素进行单标记或者多标记。
尽管本发明已经参照附图和优选实施例进行了说明，但是，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本发明的各种更改、变化和等同物由所附的权利要求书的内容涵盖。

Claims (10)

1.一种原位定量细胞膜蛋白表达量的方法，所述方法包括：
1)使纳米酶与所述细胞膜蛋白接触；和
2)通过与所述细胞膜蛋白结合的纳米酶原位定量所述细胞膜蛋白表达的量；
其中，所述纳米酶含有与所述细胞膜蛋白结合的靶向肽。
2.根据权利要求1所述的方法，所述纳米酶由金属纳米颗粒核心和靶向肽外壳组成。
3.根据权利要求1所述的方法，其中用于所述纳米酶的金属为本身在待测细胞中含量低的金属，例如金或银。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，所述靶向肽连接有作为模板的蛋白，例如牛血清白蛋白、人血清白蛋白或转铁蛋白。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述纳米酶颗粒通过以下步骤获得：
1)将胱胺二盐酸盐在室温下与金属盐溶液混合溶解，搅拌后加入NaBH4水溶液搅拌反应，之后离心获得胶体纳米金属颗粒；
2)将多肽水溶液在室温下与步骤1)获得的纳米金属颗粒混合并反应，离心获得纳米酶颗粒。
6.根据权要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述纳米酶团簇通过以下步骤获得：
1)将所述靶向肽与EDC和NHS混合溶解搅拌，从而激活靶向肽的羧基，然后将模板蛋白与上述混合物混合，室温下继续搅拌过夜，透析获得经过修饰的靶向肽；
2)将金属盐溶液与步骤1)获得的修饰的靶向肽溶液混合，之后加入NaOH溶液调节pH值到12，所形成的溶液继续在37℃搅拌，超滤获得纳米酶团簇。
7.根据前述任一项权利要求所述的方法，所述原位定量通过以下进行：
1)使用酶联免疫的方法而进行；或者
2)使用电感耦合等离子体质谱定量金属元素的含量而进行。
8.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述的细胞膜蛋白是整合素例如GPIIb/IIIa或αvβ3，表皮生长因子受体，胰岛素样生长因子受体或钙粘连蛋白。
9.根据权利要求9所述的方法，其中所述靶向整合素GPIIb/IIIa的靶向肽是H2N-CKKKKQAGDV-COOH，靶向整合素αvβ3的靶向肽为H2N-GRGDSC-COOH。
10.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述酶联免疫的方法包括制备标准曲线。
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