CN112415071A - 基于多肽-金团簇原位定量细胞膜蛋白表达量的电化学传感器 - Google Patents
基于多肽-金团簇原位定量细胞膜蛋白表达量的电化学传感器 Download PDFInfo
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Abstract
基于多肽‑金团簇原位定量细胞膜蛋白表达量的电化学传感器,涉及电化学传感领域。所述电化学传感器以玻碳电极为基底,在其表面修饰有多功能的多肽‑金团簇。所述金团簇含有与所述细胞膜蛋白特异性结合的靶向肽。所述金团簇具有电催化作用,能够有效加速电极表面的电子传递速率。制备的电化学传感器,可用于原位定量检测细胞膜蛋白表达量,具有特异性强、灵敏度高、操作简便和成本低的特点。
Description
技术领域
本发明涉及电化学传感领域,具体涉及一种基于多肽-金团簇原位定量细胞膜蛋白表达量的电化学传感器及其制备方法和应用。
背景技术
金团簇是指由几个到几百个金原子组成的原子聚集体。由于连续的电子能级状态变为离散的能级,并且大小与费米电子波长相当,金团簇表现出优异的光电化学性质以及良好的生物相容性。并且因其具有较高的表面体积比,提供了大量的结合位点用于催化或化学传感。近年来,金团簇以其独特的电化学和电催化性质已经应用到电分析化学的各个领域中。
目前,已有多种分析方法可以检测细胞膜蛋白表达。例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质免疫印迹法(Western Blot)、串联质谱法等。尽管这些分析方法发展较为成熟且具有较高的分析灵敏度,但以上分析方法都需要裂解细胞获得蛋白裂解液进行分析。蛋白裂解往往导致待分析物的损失,在同一裂解液中分析多种蛋白成分也有互相干扰的情况,同时细胞裂解中所使用的表面活性剂往往干扰质谱定量分析的准确性。另外,常规分析方法需要昂贵的仪器和专业的操作人员,操作程序复杂,耗时长,不方便广泛应用于常规诊断。
因此,目前迫切需要建立一种精准、快速、灵敏、简便、成本低廉的方法用于定量分析细胞膜蛋白表达量。
发明内容
本申请提供了一种基于多肽-金团簇原位定量细胞膜蛋白表达量的电化学传感器及其制备方法和应用,能够对细胞膜蛋白进行快速灵敏检测,且成本低廉、操作简便。
本发明所采用的技术方案如下:
一种基于多肽-金团簇用于原位定量检测细胞膜蛋白的电化学传感器的制备方法和应用,包括如下步骤:
(1)制备特异性识别细胞膜蛋白的多肽-金团簇;
(2)电化学传感器的组装;
(3)电化学原位定量分析目标细胞膜蛋白表达量。
其中,所述多肽-金团簇含有与所述细胞膜蛋白结合的靶向肽。
在一些实施方案中,所述多肽-金团簇的制备步骤如下:
(a)将靶向性多肽溶于超纯水中配制成1mM~2mM多肽溶液并置于干净干燥的材料反应瓶中,加入磁子,放在37℃水浴锅中搅拌均匀,如以600rpm/min搅拌3min;
(b)取HAuCl4标准品配制成25mM HAuCl4溶液,滴入(a)所述多肽溶液中,在37℃水浴锅中搅拌均匀如以600rpm/min继续搅拌3min,得到多肽-HAuCl4混合液;
其中,多肽与HAuCl4的物质的量之比为1:1~1:1.5;
(c)将NaOH溶液滴入步骤(b)所述混合液中,调节pH值到12,所形成的溶液继续在37℃下搅拌如以600rpm/min继续搅拌,超滤得到多肽-金团簇。
在一些实施方案中,所述电化学传感器的组装过程为:
(a)将直径为5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨,仔细打磨至表面光亮,然后用无水乙醇和去离子水超声清洗,晾干待用;
(b)配制含2mg/mL多巴胺盐酸盐,2~5mM硫酸铜,20mM的H2O2混合水溶液,将玻碳电极在所述混合水溶液中浸泡20~50min后,用纯水轻轻冲洗,得到PDA/GCE;
(c)用微量进样器取10μL含一系列不同金浓度的多肽-金团簇均匀滴加到电极表面,使材料均匀的附着在电极上,实现金团簇在电极表面上的共价修饰,得到一系列AuCs/PDA/GCE,即为原位定量分析细胞膜蛋白表达水平的电化学传感器。
在一些实施方案中,所述电化学原位定量目标细胞膜蛋白表达量的检测方法为:
将一系列不同浓度的多肽-金团簇修饰电极,采用差分脉冲伏安法(DPV)检测相应的峰电流信号,以峰电流对金浓度绘制标准曲线。实验组将肿瘤细胞与金团簇共孵育的复合物修饰到电极表面,在同样的测试条件下进行DPV法测试,将得到的峰电流信号与标准曲线进行对比,获得细胞膜上识别的金的含量;根据金团簇精确的原子组成,计算得到团簇分子数目,进而按照金团簇与细胞膜蛋白分子间1:1的结合比例,从而得到肿瘤细胞目标膜蛋白的表达量。
在一些实施方案中,靶向肽为靶向N-钙粘连蛋白的多肽序列为:H2N-SWTLYTPSGQSKKKKKYCC-COOH或H2N-CCYSWTLYTPSGQSKKKKK-COOH。
在一些实施方案中,靶向肽为靶向整合素αIIbβ3的多肽,如序列为H2N-KQAGDVKKKYCC-COOH或H2N-CCYKKKKQAGDV-COOH。
本发明的有益成果是:
(1)本发明以用靶向性良好的多肽为模板合成的金团簇作为分子识别探针,特异性结合到细胞膜表面特定膜蛋白,提高了电化学传感器的选择性。
(2)本发明利用与抗体靶向性和特异性类似,但更加稳定的多肽合成金团簇,作为修饰材料修饰电极,避免了传统电化学免疫传感器修饰过程中抗原抗体的活性降低,影响测试方法灵敏度的问题;同时将具有电催化特性的金团簇应用于电化学传感器的构建,有效促进电极表面电子的转移,提高了测试方法的检测灵敏度,实现了在群体细胞水平上定量检测肿瘤细胞膜蛋白的目的,具有重要的科学意义和应用价值。
(3)本发明所采用的多肽序列,其特异性识别序列和矿化序列自然集成,不需要其他化学修饰或连接,制备步骤简单,成本低廉,所需试剂量少。
(4)本发明利用DPV作为电化学信号的输出方式,该技术本身能够降低背景电流,提高电化学测试的灵敏度。
(5)本发明所利用的金团簇,具有精确的原子组成,在标准曲线组,可利用电感耦合等离子体质谱定量的方法精确定量电极表面金含量,确保标准曲线的可靠性。同时可利用质谱法定量测定细胞表面膜蛋白含量,测试结果与该电化学分析方法结果进行相互验证,增强结果的可靠性。
附图说明
图1是电化学传感器的制备与分析原理;
图2是不同浓度靶向N-钙粘连蛋白的多肽-金团簇1修饰电极对应的DPV测试图谱;
图3是利用靶向N-钙粘连蛋白的多肽-金团簇1制备的电化学传感器建立的电化学分析标准曲线;
图4是靶向N-钙粘连蛋白的多肽-金团簇1的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱图;
图5是1.0×104个胰腺癌PANC-1细胞-金团簇复合物修饰电极测试得到的DPV曲线;
图6是不同浓度靶向N-钙粘连蛋白的多肽-金团簇2修饰电极对应的DPV测试图谱;
图7是利用靶向N-钙粘连蛋白的多肽-金团簇2制备的电化学传感器建立的电化学分析标准曲线;
图8是靶向N-钙粘连蛋白的多肽-金团簇2的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱图;
图9是0.5×104个PANC-1细胞-金团簇复合物修饰电极测试得到的DPV曲线;
图10是不同浓度靶向整合素αIIbβ3的多肽-金团簇3修饰电极对应的DPV测试图谱;
图11是利用靶向整合素αIIbβ3的多肽-金团簇3制备的电化学传感器建立的电化学分析标准曲线;
图12是靶向整合素αIIbβ3的多肽-金团簇3的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱图;
图13是0.5×104个人红白血病HEL细胞-金团簇复合物修饰电极测试得到的DPV曲线;
图14是不同浓度靶向整合素αIIbβ3的多肽-金团簇4修饰电极对应的差分脉冲伏安测试图谱;
图15是利用靶向整合素αIIbβ3的多肽-金团簇4制备的电化学传感器建立的电化学分析标准曲线;
图16是靶向整合素αIIbβ3的多肽-金团簇4的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱图;
图17是1.0×104个HEL细胞-金团簇复合物修饰电极测试得到的DPV曲线。
具体实施方式
下面将结合附图及实施例对本发明进行详细描述,以便于本领域技术人员理解和实施本发明,并进一步认识本发明的优点。
除非在本发明说明书中另有定义,否则在此所有的技术术语都是根据本领域一般技术人员所通常使用和理解的惯用定义来使用。下述实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所述试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
如图1所示,本发明的一种基于多肽-金团簇原位定量细胞膜蛋白表达量的电化学传感器的制备及检测原理为:选择导电性能良好,化学稳定性高的玻碳电极作为基底电极。随后在玻碳电极表面化学聚合一层聚多巴胺薄膜,由于聚多巴胺表面存在游离的活性羰基,因此能够与金团簇或细胞表面游离的氨基发生席夫碱反应,形成席夫碱键,从而将其固定在电极表面。将玻碳电极浸泡在含CuSO4/H2O2的多巴胺盐酸盐溶液中,CuSO4作为氧化剂氧化多巴胺,CuSO4/H2O2作为“触发器”大大加速了多巴胺聚合和沉积的速率。本发明以靶向性良好的多肽为模板合成的具有精确原子数的金团簇作为分子识别探针,特异性结合到细胞膜表面的特异性膜蛋白,多肽-金团簇与细胞膜蛋白分子间存在1:1的结合关系。由于金团簇本身具有电催化作用,不同浓度的金团簇可电催化电解液中含有的H2O2和对苯二酚(HQ)产生相应的电流信号。鉴于此,标准曲线组用一系列不同浓度的多肽-金团簇修饰电极,采用DPV法检测相应的峰电流信号,以峰电流对金浓度绘制标准曲线。实验组将肿瘤细胞与金团簇共孵育的复合物修饰到电极表面,在同样的测试条件下进行DPV法测试,将得到的峰电流信号与标准曲线进行对比,获得细胞膜上识别的金的浓度值。根据金团簇精确的原子组成,计算得到团簇分子数目,进而按照金团簇与细胞膜蛋白分子间1:1的结合比例,从而得到肿瘤细胞目标膜蛋白的表达量。
实施例1
在本实施例中,针对N-钙粘连蛋白制备特异性识别的多肽-金团簇1,基于此金团簇,制备电化学传感器。其中,靶向肽序列为H2N-SWTLYTPSGQSKKKKKYCC-COOH(Peptide1),具体制备步骤如下:
(1)制备特异性识别N-钙粘连蛋白的多肽-金团簇1
(a)将10mg多肽溶于3000μL超纯水中配制成1.5mM多肽溶液置于干净干燥的材料反应瓶中,加入磁子,放在37℃水浴锅中以600rpm/min搅拌3min;
(b)取HAuCl4标准品配制成25mM HAuCl4溶液,取180μL HAuCl4溶液滴入(a)所述多肽溶液中,在37℃水浴锅中以600rpm/min继续搅拌3min,得到多肽-HAuCl4混合液;
(c)将NaOH溶于超纯水中配制成0.5M NaOH,取447μL浓度为0.5M的NaOH滴入步骤(b)所述混合液中,所形成的溶液继续在37℃下以600rpm/min继续避光搅拌24h,超滤得到金团簇。
(2)电化学传感器的组装
(a)玻碳电极的预处理:为了去除玻碳电极表面的一些杂质,以及活化电极表面易于后续电极的进一步修饰,玻碳电极在使用之前要进行预处理。具体步骤为将直径5mm玻碳电极在柔软的抛光布上分别用0.3μm和0.05μm的Al2O3抛光粉仔细打磨至表面光亮,随后将玻碳电极分别在无水乙醇和去离子水中超声清洗2min,晾干待用;
(b)配制含2mg/mL多巴胺盐酸盐,2mM硫酸铜,20mM H2O2的混合水溶液。将玻碳电极在所述混合水溶液中浸泡20min后,取出,用去离子水轻轻冲洗,室温晾干,得到PDA/GCE;
(c)用微量进样器分别取10μL含金浓度为15、25、30、40、55μM的多肽-金团簇1均匀滴加到电极表面,使材料均匀的附着在电极上,实现纳米复合材料的捕获,得到一系列AuCs/PDA/GCE,即为原位定量分析细胞膜蛋白表达水平的电化学传感器。
(4)建立分析标准曲线
以上述(2)制备得到的原位定量分析细胞膜蛋白表达水平的电化学传感器为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,铂片电极为对电极,构建三电极系统。将该三电极体系浸泡于含有10mM H2O2和10mM HQ,pH 7.4的PBS电解质溶液中进行差分脉冲伏安法测试,测试参数设置为:测试电压范围为0.3~-0.3V,脉冲振幅25mV,脉冲宽度50ms。以金浓度为横坐标,不同浓度的金团簇修饰电极所测试得到的DPV峰电流值为纵坐标建立标准曲线。图2为不同浓度多肽-金团簇1修饰电极对应的DPV测试图谱,图3为DPV峰电流与金浓度的线性关系图,作为此电化学传感器针对细胞膜表面N-钙粘连蛋白的电化学分析的标准曲线。
(5)电化学原位定量细胞膜表面N-钙粘连蛋白表达量
将培养24h后的PANC-1细胞培养皿取出,去除培养基,PBS洗两次,在培养皿中留少许PBS,用预冷的细胞刮将培养皿中的细胞轻轻刮下,用移液枪转移到1.5mL离心管中。800rpm/min条件下离心10min以收集细胞,然后去除上层清液,在离心管中加入1mL 3.7%的多聚甲醛,摇匀,固定30min。之后离心收集细胞,除去多聚甲醛,加入1mL PBS溶液摇匀,离心清洗收集细胞,重复此操作三次。然后用1mL 3%BSA封闭,清洗后,用稀释10倍的多肽-金团簇1室温孵育30min,充分用PBS洗涤五次后,去除PBS。最后离心管加入500μL PBS,即得到已用多肽-金团簇1标记的肿瘤细胞复合悬液,取10μL悬液计数,另取10μL悬液均匀滴加到PDA/GCE表面,获得cells-AuCs/PDA/GCE。晾干后在上述(3)条件下进行DPV测试,将标记金团簇1后的肿瘤细胞修饰电极的DPV峰电流带入到标准曲线中,获得相应的金浓度值。根据金团簇精确的原子组成,计算得到团簇分子数目,进而按照金团簇与细胞膜蛋白分子间1:1结合,从而得到PANC-1细胞膜表面N-钙粘连蛋白的表达量。如图4所示为靶向N-钙粘连蛋白的多肽-金团簇的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱,由图得知多肽-金团簇1的精确分子组成为Au20(Peptide1)7。如研究1.0×104个PANC-1细胞上N-钙粘连蛋白的表达量,由图5可知,1.0×104个PANC-1细胞测试得到的DPV峰电流为19.72μA,将该DPV峰电流值代入到标准曲线(图3)中得到对应金浓度为19.98μM,根据多肽-金团簇1的精确原子组成Au20(Peptide1)7,计算得到10μL中多肽-金团簇的数目为6.01×108个,从而得到PANC-1细胞膜表面N-钙粘连蛋白的表达量为6.01×108。
同时,通过ICP-MS分析方法测得的单个PANC-1细胞表面N-钙粘连蛋白的表达量为6.14×108,二者结果非常接近,从而验证了基于金团簇的电化学分析方法的准确性。
实施例2
在本实施例中,针对N-钙粘连蛋白制备特异性识别的多肽-金团簇2,基于此金团簇,制备电化学传感器。其中,靶向肽序列为H2N-CCYSWTLYTPSGQSKKKKK-COOH(Peptide2),具体制备步骤如下:
(1)制备特异性识别N-钙粘连蛋白的多肽-金团簇2
(a)将10mg多肽溶于3000μL超纯水中配制成1.5mM多肽溶液置于干净干燥的材料反应瓶中,加入磁子,放在37℃水浴锅中以600rpm/min搅拌3min;
(b)取HAuCl4标准品配制成25mM HAuCl4溶液,取180μL HAuCl4溶液滴入(a)所述多肽溶液中,在37℃水浴锅中以600rpm/min继续搅拌3min,得到多肽-HAuCl4混合液;
(c)将NaOH溶于超纯水中配制成0.5M NaOH,取894μL浓度为0.5M的NaOH滴入步骤(b)所述混合液中,所形成的溶液继续在37℃下以600rpm/min继续避光搅拌24h,超滤得到金团簇。
(2)电化学传感器的组装
(a)玻碳电极的预处理:为了去除玻碳电极表面的一些杂质,以及活化电极表面易于后续电极的进一步修饰,玻碳电极在使用之前要进行预处理。具体步骤为将直径5mm玻碳电极在柔软的抛光布上分别用0.3μm和0.05μm的Al2O3抛光粉仔细打磨至表面光亮,随后将玻碳电极分别在无水乙醇和去离子水中超声清洗2min,晾干待用;
(b)配制含2mg/mL多巴胺盐酸盐,3mM硫酸铜,20mM H2O2的混合水溶液。将玻碳电极在所述混合水溶液中浸泡30min后,取出,用纯水轻轻冲洗,室温晾干,得到PDA/GCE;
(c)用微量进样器取10μL含金浓度为12、16、20、24、30μM的多肽-金团簇2均匀滴加到电极表面,使材料均匀的附着在电极上,实现纳米复合材料的捕获,得到一系列AuCs/PDA/GCE,即为原位定量分析细胞膜蛋白表达水平的电化学传感器。
(3)建立分析标准曲线
以上述(2)制备得到的原位定量分析细胞膜蛋白表达水平的电化学传感器为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,铂片电极为对电极,构建三电极系统。将该三电极体系浸泡于含有10mM H2O2和10Mm HQ,pH 7.4的PBS电解质溶液中进行差分脉冲伏安法测试,测试参数设置为:测试电压范围为0.3~-0.3V,脉冲振幅25mV,脉冲宽度50ms。以金浓度为横坐标,不同浓度的金团簇修饰电极所测试得到的DPV峰电流为纵坐标建立标准曲线。图6为不同浓度多肽-金团簇2修饰电极对应的DPV测试图谱,图7为DPV峰电流与金浓度的线性关系图,作为此电化学传感器针对细胞膜表面N-钙粘连蛋白的电化学分析的标准曲线。
(4)电化学原位定量细胞膜表面N-钙粘连蛋白表达量
将培养24h后的PANC-1细胞培养皿取出,去除培养基,PBS洗两次,在培养皿中留少许PBS,用预冷的细胞刮将培养皿中的细胞轻轻刮下,用移液枪转移到1.5mL离心管中,800rpm/min条件下离心10min以收集细胞。然后去除上层清液,在离心管中加入1mL 3.7%的多聚甲醛,摇匀,固定30min。之后离心收集细胞,除去多聚甲醛,加入1mL PBS溶液摇匀,离心清洗收集细胞,重复此操作三次。然后用1mL 3%BSA封闭,清洗后,用稀释10倍的金团簇2室温孵育30min,充分用PBS洗涤五次后,去除PBS。最后离心管加入500μL PBS即得到已用多肽-金团簇2标记的肿瘤细胞复合悬液,取10μL悬液计数,另取10μL悬液均匀滴加到PDA/GCE表面,获得cells-AuCs/PDA/GCE。晾干后在上述(3)条件下进行DPV测试,将标记多肽-金团簇2后的肿瘤细胞修饰电极的DPV测试峰电流带入到标准曲线中,获得相应的金浓度值。根据金团簇精确的原子组成,计算得到团簇分子数目,进而按照金团簇与细胞膜蛋白分子间1:1结合,从而得到PANC-1细胞膜表面N-钙粘连蛋白的表达量。如图8所示为靶向N-钙粘连蛋白的多肽-金团簇的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱,由图得知多肽-金团簇2的精确分子组成为Au19(Peptide2)3。如研究0.5×104个PANC-1细胞上N-钙粘连蛋白的表达量,由图9可知,0.5×104个PANC-1细胞测试得到的DPV峰电流为9.29μA,将该DPV峰电流值代入到标准曲线(图7)中得到对应金浓度为9.53μM,根据多肽-金团簇2的精确原子组成Au19(Peptide2)3,计算得到10μL中多肽-金团簇的数目为6.04×108个,从而得到PANC-1细胞膜表面N-钙粘连蛋白的表达量为6.04×108。
同时,通过ICP-MS分析方法测得的单个PANC-1细胞表面N-钙粘连蛋白的表达量为6.14×108,二者结果非常接近,从而验证了基于金团簇的电化学分析方法的准确性。
实施例3
在本实施例中,针对整合素αIIbβ3制备特异性识别的多肽-金团簇3,基于此金团簇制备电化学传感器。其中,靶向肽序列为H2N-KQAGDVKKKYCC-COOH(Peptide3),具体制备步骤如下:
(1)制备特异性识别整合素αIIbβ3的多肽-金团簇3
(a)将5mg多肽溶于3650μL超纯水中配制成1.0mM多肽溶液置于干净干燥的材料反应瓶中,加入磁子,放在37℃水浴锅中以600rpm/min搅拌3min;
(b)取HAuCl4标准品配制成25mM HAuCl4溶液,取146μL HAuCl4溶液滴入(a)所述多肽溶液中,在37℃水浴锅中以600rpm/min继续搅拌3min,得到多肽-HAuCl4混合液;
(c)将NaOH溶于超纯水中配制成0.5M NaOH,取365μL浓度为0.5M的NaOH滴入步骤(b)所述混合液中,所形成的溶液继续在37℃下以600rpm/min继续避光搅拌24h,超滤得到金团簇。
(2)电化学传感器的组装
(a)玻碳电极的预处理:为了去除玻碳电极表面的一些杂质,以及活化电极表面易于后续电极的进一步修饰,玻碳电极在使用之前要进行预处理。具体步骤为将直径5mm玻碳电极在柔软的抛光布上分别用0.3μm和0.05μm的Al2O3抛光粉仔细打磨至表面光亮,随后将玻碳电极分别在无水乙醇和去离子水中超声清洗2min,晾干待用;
(b)配制含2mg/mL多巴胺盐酸盐,4mM硫酸铜,20mM H2O2的混合水溶液,将玻碳电极在所述混合水溶液中浸泡30min后,取出,用纯水轻轻冲洗,室温晾干,得到PDA/GCE;
(c)用微量进样器分别取10μL含金浓度为7.5、15、30、37.5、60μM的多肽-金团簇3均匀滴加到电极表面,使材料均匀的附着在电极上,实现纳米复合材料的捕获,得到一系列AuCs/PDA/GCE,即为原位定量分析细胞膜蛋白表达水平的电化学传感器。
(3)建立分析标准曲线
以上述(2)制备得到的原位定量分析细胞膜蛋白表达水平的电化学传感器为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,铂片电极为对电极,构建三电极系统。将该三电极体系浸泡于含有10mM H2O2和10Mm HQ,pH 7.4的PBS电解质溶液中进行差分脉冲伏安法测试,测试参数设置为:测试电压范围为0.3~-0.3V,脉冲振幅25mV,脉冲宽度50ms。以金浓度为横坐标,不同浓度的金团簇修饰电极所测试得到的DPV峰电流为纵坐标建立标准曲线。图10为不同浓度多肽-金团簇3修饰电极对应的DPV测试图谱,图11为DPV峰电流与金浓度的线性关系图,作为此电化学传感器针对细胞膜表面整合素αIIbβ3的电化学分析的标准曲线。
(4)电化学原位定量细胞膜表面整合素αIIbβ3表达量
将培养24h后的HEL细胞培养皿取出,去除培养基,PBS洗两次,在培养皿中留少许PBS,用预冷的细胞刮将培养皿中的细胞轻轻刮下。用移液枪转移到1.5mL离心管中,800rpm/min条件下离心10min以收集细胞,然后去除上层清液,在离心管中加入1mL 3.7%的多聚甲醛,摇匀,固定30min。之后离心收集细胞,除去多聚甲醛,加入1mL PBS溶液摇匀,离心清洗收集细胞,重复此操作三次。然后用1mL 3%BSA封闭,清洗后,用稀释10倍的金团簇3室温孵育30min,充分用PBS洗涤五次后,去除PBS。最后离心管加入500μL PBS即得到已用多肽-金团簇3标记的肿瘤细胞复合悬液,取10μL悬液计数,另取10μL悬液分别均匀滴加到PDA/GCE表面,获得cells-AuCs/PDA/GCE。晾干后在上述(3)条件下进行DPV测试,将标记多肽-金团簇3后的肿瘤细胞修饰电极的DPV测试峰电流带入到标准曲线中,获得相应的金浓度值。根据金团簇精确的原子组成,计算得到团簇分子数目,进而按照金团簇与细胞膜蛋白分子间1:1结合,从而得到HEL细胞膜表面整合素αIIbβ3的表达量。如图12所示为靶向整合素αIIbβ3的多肽-金团簇的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱,由图得知多肽-金团簇3的精确分子组成为Au24(Peptide3)8。如研究0.5×104个HEL细胞上整合素αIIbβ3的表达量,由图13可知,0.5×104个HEL细胞测试得到的DPV峰电流为4.11μA,将该DPV峰电流值代入到标准曲线(图11)中得到对应金浓度为1.13μM,根据多肽-金团簇3的精确原子组成Au24(Peptide3)8,计算得到10μL中多肽-金团簇的数目为5.71×107个,从而得到HEL细胞膜表面整合素αIIbβ3的表达量为5.71×107。
同时,通过ICP-MS分析方法测得的单个HEL细胞表面整合素αIIbβ3的表达量为4.04×107,二者结果非常接近,从而验证了基于金团簇的电化学分析方法的准确性。
实施例4
在本实施例中,针对整合素αIIbβ3制备特异性识别的多肽-金团簇4,基于此金团簇制备电化学传感器。其中,靶向肽序列为H2N-CCYKKKKQAGDV-COOH(Peptide4),具体制备步骤如下:
(1)制备特异性识别整合素αIIbβ3的多肽-金团簇4
(a)将5mg多肽溶于3650μL超纯水中配制成1.0mM多肽溶液置于干净干燥的材料反应瓶中,加入磁子,放在37℃水浴锅中以600rpm/min搅拌3min;
(b)取HAuCl4标准品配制成25mM HAuCl4溶液,取146μL HAuCl4溶液滴入(a)所述多肽溶液中,在37℃水浴锅中以600rpm/min继续搅拌3min,得到多肽-HAuCl4混合液;
(c)将NaOH溶于超纯水中配制成0.5M NaOH,取730μL浓度为0.5M的NaOH滴入步骤(b)所述混合液中,所形成的溶液继续在37℃下以600rpm/min继续避光搅拌24h,超滤得到金团簇。
(2)电化学传感器的组装
(a)玻碳电极的预处理:为了去除玻碳电极表面的一些杂质,以及活化电极表面易于后续电极的进一步修饰,玻碳电极在使用之前要进行预处理。具体步骤为将直径5mm玻碳电极在柔软的抛光布上分别用0.3μm和0.05μm的Al2O3抛光粉仔细打磨至表面光亮,随后将玻碳电极分别在无水乙醇和去离子水中超声清洗2min,晾干待用;
(b)配制含2mg/mL多巴胺盐酸盐,5mM硫酸铜,20mM H2O2的混合水溶液。将玻碳电极在所述混合水溶液中浸泡40min后,取出,用纯水轻轻冲洗,室温晾干,得到PDA/GCE;
(c)用微量进样器分别取10μL含金浓度为22.5、37.5、45.0、52.5、60.0μM的多肽-金团簇4均匀滴加到电极表面,使材料均匀的附着在电极上,实现纳米复合材料的捕获,得到一系列AuCs/PDA/GCE,即为原位定量分析细胞膜蛋白表达水平的电化学传感器。
(3)建立分析标准曲线
以上述(2)制备得到的原位定量分析细胞膜蛋白表达水平的电化学传感器为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,铂片电极为对电极,构建三电极系统。将该三电极体系浸泡于含有10mM H2O2和10Mm HQ,pH 7.4的PBS电解质溶液中进行DPV测试,测试参数设置为:测试电压范围为0.3~-0.3V,脉冲振幅25mV,脉冲宽度50ms。以金浓度为横坐标,不同浓度的金团簇修饰电极所测试得到的DPV峰电流为纵坐标建立标准曲线。图14为不同浓度多肽-金团簇4修饰电极对应的DPV测试图谱,图15为DPV峰电流与金浓度的线性关系图,作为此电化学传感器针对细胞膜表面整合素αIIbβ3的电化学分析的标准曲线。
(4)电化学原位定量细胞膜表面整合素αIIbβ3表达量
将培养24h后的HEL细胞培养皿取出,去除培养基,PBS洗两次,在培养皿中留少许PBS,用预冷的细胞刮将培养皿中的细胞轻轻刮下,用移液枪转移到1.5mL离心管中。800rpm/min条件下离心10min以收集细胞,然后去除上层清液,在离心管中加入1mL 3.7%的多聚甲醛,摇匀,固定30min。之后离心收集细胞,除去多聚甲醛,加入1mL PBS溶液摇匀,离心清洗收集细胞,重复此操作三次。然后用1mL 3%BSA封闭,清洗后,用稀释10倍的金团簇4室温孵育30min,充分用PBS洗涤五次后,去除PBS。最后离心管加入500μL PBS即得到已用多肽-金团簇4标记的肿瘤细胞复合悬液,取10μL悬液计数,另取10μL悬液分别均匀滴加到PDA-GCE表面,获得cells-AuCs/PDA/GCE。晾干后在上述(3)条件下进行DPV测试,将标记多肽-金团簇4后的肿瘤细胞修饰电极的DPV测试峰电流带入到标准曲线中,获得相应的金浓度值。根据金团簇精确的原子组成,计算得到团簇分子数目,进而按照金团簇与细胞膜蛋白分子间1:1结合,从而得到HEL细胞膜表面整合素αIIbβ3的表达量。如图16所示为靶向整合素αIIbβ3的多肽-金团簇的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱,由图得知多肽-金团簇4的精确分子组成为Au25(Peptide4)9。如研究1.0×104个HEL细胞上整合素αIIbβ3的表达量,由图17可知,1.0×104个HEL细胞测试得到的DPV峰电流为5.15μA,将该DPV峰电流值代入到标准曲线(图15)中得到对应金浓度为2.32μM,根据多肽-金团簇4的精确原子组成Au25(Peptide4)9,计算得到10μL多肽-金团簇的数目为5.58×107个,从而得到HEL细胞膜表面整合素αIIbβ3的表达量为5.58×107。
同时,通过ICP-MS分析方法测得的单个HEL细胞表面整合素αIIbβ3的表达量为4.04×107,二者结果非常接近,从而验证了基于金团簇的电化学分析方法的准确性。
本发明所述的电化学传感器可以用于原位定量检测肿瘤细胞膜蛋白,通过对肿瘤侵袭转移相关蛋白标志物的定量分析对肿瘤侵袭转移进行早期预测和评估。该原位电分析方法无需裂解细胞提取蛋白,操作步骤简单,成本低廉,具有广泛的应用前景。
本发明通过上述实例来说明本发明的基于金团簇原位定量检测细胞膜蛋白的电化学传感器的制备方法及其应用。本说明书中每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处,各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。尽管本发明已经参照附图和优选实施例进行了说明,但是,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。本发明的各种更改、变化和等同物由所附的权利要求书的内容涵盖。
Claims (8)
1.一种基于多肽-金团簇用于原位定量检测细胞膜蛋白的电化学传感器的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)制备特异性识别细胞膜蛋白的多肽-金团簇;其中,所述多肽-金团簇含有与所述细胞膜蛋白结合的靶向多肽;
(2)电化学传感器的组装。
2.按照权利要求1所述的一种基于多肽-金团簇用于原位定量检测细胞膜蛋白的电化学传感器的制备方法,其特征在于,所述多肽-金团簇的制备步骤如下:
(a)将靶向性多肽溶于超纯水中配制成1mM~2mM多肽溶液并置于干净干燥的材料反应瓶中,放在37℃水浴锅中搅拌均匀;
(b)取HAuCl4标准品配制成25mM HAuCl4溶液,滴入(a)所述多肽溶液中,在37℃水浴锅中搅拌均匀,得到多肽-HAuCl4混合液;
其中,多肽与HAuCl4的物质的量之比为1:1~1:1.5;
(c)将NaOH溶液滴入步骤(b)所述混合液中,调节pH值到12,所形成的溶液继续在37℃下搅拌,超滤得到多肽-金团簇。
3.按照权利要求1所述的一种基于多肽-金团簇用于原位定量检测细胞膜蛋白的电化学传感器的制备方法,其特征在于,所述电化学传感器的组装过程为:
(a)将直径为5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨,仔细打磨至表面光亮,然后用无水乙醇和去离子水超声清洗,晾干待用;
(b)配制含2mg/mL多巴胺盐酸盐,2~5mM硫酸铜,20mM的H2O2混合水溶液,将玻碳电极在所述混合水溶液中浸泡20~50min后,用纯水轻轻冲洗,得到PDA/GCE;
(c)用微量进样器取10μL含一系列不同金浓度的多肽-金团簇均匀滴加到电极表面,使材料均匀的附着在电极上,实现金团簇在电极表面上的共价修饰,得到一系列AuCs/PDA/GCE,即为原位定量分析细胞膜蛋白表达水平的电化学传感器。
4.按照权利要求1所述的一种基于多肽-金团簇用于原位定量检测细胞膜蛋白的电化学传感器的制备方法,其特征在于,靶向多肽为靶向N-钙粘连蛋白的多肽序列为:H2N-SWTLYTPSGQSKKKKKYCC-COOH或H2N-CCYSWTLYTPSGQSKKKKK-COOH;
或靶向多肽为靶向整合素αIIbβ3的多肽,序列为H2N-KQAGDVKKKYCC-COOH或H2N-CCYKKKKQAGDV-COOH。
5.按照权利要求1-4任一项所述的方法制备得到的基于多肽-金团簇用于原位定量检测细胞膜蛋白的电化学传感器。
6.按照权利要求1-4任一项所述的方法制备得到的基于多肽-金团簇用于原位定量检测细胞膜蛋白的电化学传感器的应用,电化学原位定量目标细胞膜蛋白表达量。
7.按照权利要求6的应用,其特征在于,将一系列不同浓度的多肽-金团簇修饰电极,采用差分脉冲伏安法(DPV)检测相应的峰电流信号,以峰电流对金浓度绘制标准曲线;实验组将肿瘤细胞与金团簇共孵育的复合物修饰到电极表面,在同样的测试条件下进行DPV法测试,将得到的峰电流信号与标准曲线进行对比,获得细胞膜上识别的金的含量;根据金团簇精确的原子组成,计算得到团簇分子数目,进而按照金团簇与细胞膜蛋白分子间1:1的结合比例,从而得到肿瘤细胞目标膜蛋白的表达量。
8.按照权利要求7的应用,其特征在于,采用差分脉冲伏安法(DPV)检测相应的峰电流信号时,电催化电解液中含有的H2O2和对苯二酚(HQ)产生相应的电流信号。
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