CN105628931A - 一种基于银沉积的甲胎蛋白电化学免疫传感器的制备及应用 - Google Patents

一种基于银沉积的甲胎蛋白电化学免疫传感器的制备及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及电化学免疫传感器技术领域，特别是涉及一种基于银沉积的甲胎蛋白电化学免疫传感器的制备及应用。具体是利用金纳米簇修饰玻碳电极表面作为抗体捕获基底，C60负载金纳米复合物跟踪标记甲胎蛋白第二抗体，通过夹心免疫反应，第二抗体功能化的金纳米被捕获到传感器的表面并诱导银沉积，通过检测银纳米在KCl溶液中的电化学溶出信号实现甲胎蛋白的检测。

Description

一种基于银沉积的甲胎蛋白电化学免疫传感器的制备及应用
技术领域
本发明涉及电化学免疫传感技术领域，特别是涉及一种基于银沉积的甲胎蛋白(AFP)电化学免疫传感器的制备及应用。具体是利用金纳米簇修饰玻碳电极表面作为抗体捕获基底，C60负载金纳米复合物跟踪标记AFP第二抗体，通过夹心免疫反应，第二抗体功能化的金纳米被捕获到传感器的表面并诱导银沉积，通过检测银纳米在KCl溶液中的电化学溶出信号实现AFP的检测。
背景技术
灵敏准确的检测肿瘤标志物对于疾病的早期治疗和诊断具有至关重要的作用，肿瘤标志物在血清、组织、唾液中的含量能够反映癌症在一个特定时间的生理状态。AFP作为一种肿瘤标志物主要在胎儿肝中合成，在正常人血清中AFP的含量不高于20μg/L，然而当成人体内肝细胞发生癌变时血清中的含量会明显增加。因此，AFP常被作为诊断原发性肝癌的特异性肿瘤标志物。目前常用化学发光法、酶标法、酶标电泳法、放射免疫法检测。这些分析方法通常存在操作复杂，价格昂贵，不适合实时检测的缺陷。因此，发展快速、灵敏的分析方法去定量检测AFP对肝癌的早期发现、早期诊断和早期治疗具有重大意义。电化学免疫传感器由于所需仪器设备简单，灵敏度高，检测速度快，成本低，尤其是满足实时检测的需要而备受人们的广泛关注。基于电化学传感器的优良性质本发明制备了一种基于银沉积的AFP电化学免疫传感器，以银沉积作为电化学信号输出方式实现对AFP的检测。
本发明中金纳米簇作为第一抗体捕获基底，由于其良好的生物相容性，优异的导电性和大的表面积，不仅可以负载更多的抗体，而且可以促进蛋白质和电极之间的电子传递。C60负载金纳米复合物跟踪标记AFP第二抗体，通过夹心免疫反应，第二抗体功能化的金纳米被捕获到传感器的表面并诱导银沉积，通过检测银纳米在KCl溶液中的电化学溶出信号实现AFP的检测。在本发明中构建的电化学免疫传感器具有成本低，稳定性好，制备过程简单，灵敏度高等优点。
发明内容
本发明的目的之一是以C60负载金纳米复合物作为跟踪标记AFP第二抗体的载体，并利用第二抗体功能化的金纳米诱导银沉积，以银沉积作为电化学信号的输出方式，构建了一种简单快速，稳定性好，灵敏度高的电化学免疫传感器。
本发明的目的之二是将该电化学免疫传感器用于AFP的检测。
本发明的技术方案为：
1.一种基于银沉积的AFP电化学免疫传感器的制备方法：
(1)用Al2O3抛光粉打磨直径为4mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3min，氮气吹干；以10mL含有浓度为1.0mmoL/L的HAuCl4溶液为底液，以GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极在-0.8～0.6V电位范围内进行循环伏安扫描30圈后，将电极在0.1moL/L的KCl溶液中浸泡过夜，用PBS(pH7.4)缓冲液冲洗得到金纳米簇修饰玻碳电极(nano-Au/GCE)；
(2)取10μL1.0~2.5μg/mL的AFP第一抗体(Ab1)标准溶液滴涂到nano-Au/GCE表面，在4℃冰箱中孵育12h，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗除去物理吸附得到Ab1/nano-Au/GCE；
(3)取10μL质量分数为1~3%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到Ab1/nano-Au/GCE表面，在37℃下孵育1h，以封闭非特异性结合位点，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到BSA/Ab1/nano-Au/GCE；
(4)将10μL1.0pg/mL~10ng/mL的一系列不同浓度的AFP标准溶液滴涂到BSA/Ab1/nano-Au/GCE表面用于与抗体特异性识别，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到AFP/BSA/Ab1/nano-Au/GCE；
(5)滴加6~10μLAuNPsPAMAM-C60标记AFP第二抗体(Ab2-AuNPsPAMAM-C60)到上述电极表面，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，再取10μL4~10mmoL的银增强剂滴涂到电极表面室温下避光孵育5min后用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种基于银沉积的AFP电化学免疫传感器(Ab2-AuNPsPAMAM-C60/AFP/BSA/Ab1/nano-Au/GCE)。
2.上述的Ab2-AuNPsPAMAM-C60的制备：
(1)AuNPsPAMAM-C60的制备
在磁力搅拌下，将1.0mg的树枝状高分子聚酰胺(PAMAM)加入到1mL超纯水中，然后加入4.0mL乙醇继续搅拌使得溶液充分混匀，将1mL1.0mg/mL的C60的甲苯溶液加入到上述混合溶液中，在室温下持续搅拌36h，用超纯水离心洗涤3次得到PAMAM-C60；将PAMAM-C60重新分散到2mLPBS(pH7.4)缓冲溶液中；取97.0mL的超纯水于锥形瓶，在搅拌下加入1mL0.01mol/L的HAuCl4和1mL的0.03mol/L柠檬酸二钠，之后逐滴滴加1mL0.047mol/L的硼氢化钠至溶液变为亮酒红色，再搅拌15min得金纳米溶液；取2mL上述金纳米溶液于2mLPAMAM-C60分散液中室温下搅拌过夜，所得溶液在8000r/s离心，弃去上清液，重新溶解到2mLPBS(pH7.4)缓冲溶液中，得到AuNPsPAMAM-C60溶液；
(2)Ab2-AuNPsPAMAM-C60的制备
取0.2mL10μg/mL的Ab2在搅拌的条件下加入到2mLAb2-AuNPsPAMAM-C60溶液中，室温下搅拌30min后在4℃下孵育过夜，得到的混合溶液在9000r/s离心15min，弃去上清液，重新溶解到1mLPBS(pH7.4)缓冲溶液中，得到Ab2-AuNPsPAMAM-C60溶液。
3.AFP的检测：
(1)实验在电化学工作站上进行，采用三电极体系以所制备的免疫传感器为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极。在PBS(pH7.4)缓冲溶液中进行测试；
(2)用线性扫描伏安法对一系列不同浓度AFP标准溶液及未特异性结合AFP的电极进行检测，扫描的电位区间为-0.1V~0.5V，扫描速度为50mV/s，记录示差脉冲伏安图，根据所得的峰电流值和AFP浓度的对数呈线性关系，绘制工作曲线；
(3)将待测样品溶液代替AFP标准溶液进行检测。
本发明的有益成果
(1)本发明以金纳米簇作为第一抗体捕获基底，不仅可以负载更多的抗体，而且可以促进蛋白质和电极之间的电子传递，进而增加电极的灵敏度；另外C60负载金纳米复合物作为跟踪标记AFP第二抗体的载体，具有大的表面积和活性位点可以增加第二抗体的负载量，使传感器具有更高的灵敏度；
(2)以第二抗体功能化的金纳米原位催化诱导银沉积作为电化学信号的输出方式，解决了银纳米探针不稳定的难题；
(3)本发明制备的电化学免疫传感器用于AFP的检测，具有简单、快速、高灵敏检测的优势。线性范围为1.0pg/mL~10ng/mL，检出限为0.1pg/mL。
附图说明：
图1所示为不同浓度AFP的线性扫描伏安图。
图2所示为本发明峰电流差值与lgc线性关系图。
其中，图1中由a到f的氧化峰图分别代表AFP的浓度为0、1.0×10-12、1.0×10-11、1.0×10-10、1.0×10-9、1.0×10-8g/mL；
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
实施例1一种基于银沉积的AFP电化学免疫传感器的制备方法：
(1)用Al2O3抛光粉打磨直径为4mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3min，氮气吹干；以10mL含有浓度为1.0mmoL/L的HAuCl4溶液为底液，以GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极在-0.8～0.6V电位范围内进行循环伏安扫描30圈后，将电极在0.1moL/L的KCl溶液中浸泡过夜，用PBS(pH7.4)缓冲液冲洗得到金纳米簇修饰玻碳电极(nano-Au/GCE)；
(2)取10μL1.0μg/mL的AFP第一抗体(Ab1)标准溶液滴涂到nano-Au/GCE表面，在4℃冰箱中孵育12h，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗除去物理吸附得到Ab1/nano-Au/GCE；
(3)取10μL质量分数为1%的BSA溶液滴涂到Ab1/nano-Au/GCE表面，在37℃下孵育1h，以封闭非特异性结合位点，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到BSA/Ab1/nano-Au/GCE；
(4)将10μL1.0pg/mL~10ng/mL的一系列不同浓度的AFP标准溶液滴涂到BSA/Ab1/nano-Au/GCE表面用于与抗体特异性识别，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到AFP/BSA/Ab1/nano-Au/GCE；
(5)滴加6μLAuNPsPAMAM-C60标记AFP第二抗体(Ab2-AuNPsPAMAM-C60)到上述电极表面，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，再取10μL4mmoL的银增强剂滴涂到电极表面室温下避光孵育5min后用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种基于银沉积的AFP电化学免疫传感器(Ab2-AuNPsPAMAM-C60/AFP/BSA/Ab1/nano-Au/GCE)。
实施例2一种基于银沉积的AFP电化学免疫传感器的制备方法：
(1)用Al2O3抛光粉打磨直径为4mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3min，氮气吹干；以10mL含有浓度为1.0mmoL/L的HAuCl4溶液为底液，以GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极在-0.8～0.6V电位范围内进行循环伏安扫描30圈后，将电极在0.1moL/L的KCl溶液中浸泡过夜，用PBS(pH7.4)缓冲液冲洗得到金纳米簇修饰玻碳电极(nano-Au/GCE)；
(2)取10μL2.0μg/mL的AFP第一抗体(Ab1)标准溶液滴涂到nano-Au/GCE表面，在4℃冰箱中孵育12h，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗除去物理吸附得到Ab1/nano-Au/GCE；
(3)取10μL质量分数为2%的BSA溶液滴涂到Ab1/nano-Au/GCE表面，在37℃下孵育1h，以封闭非特异性结合位点，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到BSA/Ab1/nano-Au/GCE；
(4)将10μL1.0pg/mL~10ng/mL一系列不同浓度的AFP标准溶液滴涂到BSA/Ab1/nano-Au/GCE表面用于与抗体特异性识别，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到AFP/BSA/Ab1/nano-Au/GCE；
(5)滴加8μLAuNPsPAMAM-C60标记AFP第二抗体(Ab2-AuNPsPAMAM-C60)到上述电极表面，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，再取10μL6mmoL的银增强剂滴涂到电极表面室温下避光孵育5min后用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种基于银沉积的AFP电化学免疫传感器(Ab2-AuNPsPAMAM-C60/AFP/BSA/Ab1/nano-Au/GCE)。
实施例3一种基于银沉积的AFP电化学免疫传感器的制备方法：
(1)用Al2O3抛光粉打磨直径为4mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3min，氮气吹干；以10mL含有浓度为1.0mmoL/L的HAuCl4溶液为底液，以GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极在-0.8～0.6V电位范围内进行循环伏安扫描30圈后，将电极在0.1moL/L的KCl溶液中浸泡过夜，用PBS(pH7.4)缓冲液冲洗得到金纳米簇修饰玻碳电极(nano-Au/GCE)；
(2)取10μL2.5μg/mL的AFP第一抗体(Ab1)标准溶液滴涂到nano-Au/GCE表面，在4℃冰箱中孵育12h，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗除去物理吸附得到Ab1/nano-Au/GCE；
(3)取10μL质量分数为3%的BSA溶液滴涂到Ab1/nano-Au/GCE表面，在37℃下孵育1h，以封闭非特异性结合位点，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到BSA/Ab1/nano-Au/GCE；
(4)将10μL1.0pg/mL~10ng/mL的一系列不同浓度的AFP标准溶液滴涂到BSA/Ab1/nano-Au/GCE表面用于与抗体特异性识别，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到AFP/BSA/Ab1/nano-Au/GCE；
(5)滴加10μLAuNPsPAMAM-C60标记AFP第二抗体(Ab2-AuNPsPAMAM-C60)到上述电极表面，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，再取10μL10mmoL的银增强剂滴涂到电极表面室温下避光孵育5min后用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种基于银沉积的AFP电化学免疫传感器(Ab2-AuNPsPAMAM-C60/AFP/BSA/Ab1/nano-Au/GCE)。
实施例4上述的Ab2-AuNPsPAMAM-C60的制备
(1)AuNPsPAMAM-C60的制备
在磁力搅拌下，将1.0mg的树枝状高分子聚酰胺(PAMAM)加入到1mL超纯水中，然后加入4mL乙醇继续搅拌使得溶液充分混匀，将1mL1.0mg/mL的C60的甲苯溶液加入到上述混合溶液中，在室温下持续搅拌36h，用超纯水离心洗涤3次得到PAMAM-C60；将PAMAM-C60重新分散到2mLPBS(pH7.4)缓冲溶液中；取97mL的超纯水于锥形瓶，在搅拌下加入1mL0.01mol/L的HAuCl4和1mL的0.03mol/L柠檬酸二钠，之后逐滴滴加1mL0.047mol/L的硼氢化钠至溶液变为亮酒红色，再搅拌15min得金纳米溶液；取2mL上述金纳米溶液于2mLPAMAM-C60分散液中室温下搅拌过夜，所得溶液在8000r/s离心，弃去上清液，重新溶解到2mLPBS(pH7.4)缓冲溶液中，得到AuNPsPAMAM-C60溶液；
(2)Ab2-AuNPsPAMAM-C60的制备
取0.2mL10μg/mL的Ab2在搅拌的条件下加入到2mLAb2-AuNPsPAMAM-C60溶液中，室温下搅拌30min后在4℃下孵育过夜，得到的混合溶液在9000r/s离心15min，弃去上清液，重新溶解到1mLPBS(pH7.4)缓冲溶液中，得到Ab2-AuNPsPAMAM-C60溶液。
实施例5AFP的检测
(1)实验在电化学工作站上进行，采用三电极体系以所制备的免疫传感器为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极。在PBS(pH7.4)缓冲溶液中进行测试；
(2)用线性扫描伏安法对一系列不同浓度AFP标准溶液及未特异性结合AFP的电极进行检测，扫描的电位区间为-0.1V~0.5V，扫描速度为50mV/s，记录线性扫描伏安图，所得结果见图1，根据所得的峰电流值(不同浓度AFP标准溶液的电极的峰电流记为I，未特异性结合AFP的电极的峰电流记为I 0)和AFP浓度的关系，绘制工作曲线；
(3)得到的峰电流差值ΔI p即I 0-I与CEA浓度的对数(lgc)的线性关系见图2，由图2可知，AFP在1.0pg/mL~10ng/mL浓度范围内，ΔI p与AFP浓度的对数呈良好的线性相关，线性方程为ΔI p=295.2lgc+22.27，c是浓度，单位是g/mL，线性相关系数为0.9917，检出线为0.1pg/mL；
(4)将待测样品溶液代替AFP标准溶液进行检测。

Claims (3)

1.一种基于银沉积的甲胎蛋白(AFP)电化学免疫传感器的制备及应用，其特征在于包括以下步骤：
(1)用Al2O3抛光粉打磨直径为4mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3min，氮气吹干；以10mL含有浓度为1.0mmoL/L的HAuCl4溶液为底液，以GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极在-0.8～0.6V电位范围内进行循环伏安扫描30圈后，将电极在0.1moL/L的KCl溶液中浸泡过夜，用PBS(pH7.4)缓冲液冲洗得到金纳米簇修饰玻碳电极(nano-Au/GCE)；
(2)取10μL1.0~2.5μg/mL的AFP第一抗体(Ab1)标准溶液滴涂到nano-Au/GCE表面，在4℃冰箱中孵育12h，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗除去物理吸附得到Ab1/nano-Au/GCE；
(3)取10μL质量分数为1~3%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到Ab1/nano-Au/GCE表面，在37℃下孵育1h，以封闭非特异性结合位点，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到BSA/Ab1/nano-Au/GCE；
(4)将10μL1.0pg/mL~10ng/mL的一系列不同浓度的AFP标准溶液滴涂到BSA/Ab1/nano-Au/GCE表面用于与抗体特异性识别，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到AFP/BSA/Ab1/nano-Au/GCE；
(5)滴加6~10μLAuNPsPAMAM-C60标记AFP第二抗体(Ab2-AuNPsPAMAM-C60)到上述电极表面，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，再取10μL4~10mmoL的银增强剂滴涂到电极表面室温下避光孵育5min后用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种基于银沉积的甲胎蛋白电化学免疫传感器(Ab2-AuNPsPAMAM-C60/AFP/BSA/Ab1/nano-Au/GCE)。
2.根据权利要求1所述的一种基于银沉积的甲胎蛋白电化学免疫传感器的制备及应用，其特征在于所述步骤(5)中Ab2-AuNPsPAMAM-C60的具体制作步骤为：
(1)AuNPsPAMAM-C60的制备
在磁力搅拌下，将1.0mg的树枝状高分子聚酰胺(PAMAM)加入到1mL超纯水中，然后加入4mL乙醇继续搅拌使得溶液充分混匀，将1mL1.0mg/mL的C60的甲苯溶液加入到上述混合溶液中，在室温下持续搅拌36h，用超纯水离心洗涤3次得到PAMAM-C60；将PAMAM-C60重新分散到2mLPBS(pH7.4)缓冲溶液中；取97mL的超纯水于锥形瓶，在搅拌下加入1mL0.01mol/L的HAuCl4和1mL的0.03mol/L柠檬酸二钠，之后逐滴滴加1mL0.047mol/L的硼氢化钠至溶液变为亮酒红色，再搅拌15min得金纳米溶液；取2mL上述金纳米溶液于2mLPAMAM-C60分散液中室温下搅拌过夜，所得溶液在8000r/s离心，弃去上清液，重新溶解到2mLPBS(pH7.4)缓冲溶液中，得到AuNPsPAMAM-C60溶液；
(2)Ab2-AuNPsPAMAM-C60的制备
取0.2mL10μg/mL的Ab2在搅拌的条件下加入到2mLAb2-AuNPsPAMAM-C60溶液中，室温下搅拌30min后在4℃下孵育过夜，得到的混合溶液在9000r/s离心15min，弃去上清液，重新溶解到1mLPBS(pH7.4)缓冲溶液中，得到Ab2-AuNPsPAMAM-C60溶液。
3.根据权利要求1所述的制备方法制备的一种基于银沉积的甲胎蛋白电化学免疫传感器的制备及应用，其特征在于，用于AFP的检测，检测步骤如下：
(1)实验在电化学工作站上进行，采用三电极体系以所制备的免疫传感器为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，在PBS(pH7.4)缓冲溶液中进行测试；
(2)用线性扫描伏安法对一系列不同浓度AFP标准溶液及未特异性结合AFP的电极进行检测，扫描的电位区间为-0.1V~0.5V，扫描速度为50mV/s，记录示差脉冲伏安图，根据所得的峰电流值和AFP浓度的对数呈线性关系，绘制工作曲线；
(3)将待测样品溶液代替AFP标准溶液进行检测。
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