CN109991297A - 基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法 - Google Patents

基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于G‑四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法，与传统的黄体酮检测方法相比，其避免了贵重仪器的分析方法的建立；使用核酸适配体为识别元件提高了目标物检测的选择性和稳定性。将信号放大策略与电分析方法相结合，构建以黄体酮为检测对象的电化学传感新方法和新技术，提高分析的灵敏度。本发明检测黄体酮的方法更简便，更灵敏，选择性且成本效益更高，在痕量生物小分子分析中有着重要的实际意义和发展前景。

Description

基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体 酮检测方法
技术领域
本发明涉及一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器构建及其在黄体酮检测中的应用，属于适配体传感技术领域。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：
黄体酮是一类典型的内分泌干扰物质，其在人体或动物体中含量高于或低于某个阈值，均会对动物和人类产生不利影响。此外，当人类或动物摄入高剂量的黄体酮后，通常机体吸收的量很少，其余的则作为废物排放到污水中，并可能对环境造成影响。因此，在适当范围内监测环境或临床样品中黄体酮的浓度至关重要。目前检测黄体酮的方法主要是HPLC、LC/MS、酶联免疫吸附试验和放射免疫分析，但这些方法通常成本高，耗时长，操作步骤繁琐且需要经过专门训练的人员来执行，所以限制了它们的进一步应用。电化学检测方法由于具有低成本，快速，高灵敏性和易于小型化等优点，有望用于进行免贵重仪器分析方法的建立，其得到迅速的发展和应用，逐步成为应用最广泛的生物分析方法之一，涉及生物学检测的各个领域。
适配体是指经指数富集的配体系统进化技术体外筛选合成得到的一小段单链寡核昔酸序列，对目标分子具有高度亲和性和特异性的识别能力。与免疫传感器相比，核酸适配体与目标物间的亲合力常常要强于抗原抗体之间的亲合力。2015年，研究人员成功筛选出了黄体酮适体并开发了一种电化学适体传感器用于黄体酮的检测，检测限为2.86nM，与其分析方法相比，其成本更低，稳定性更高，检测策略更简单，成为检测目标物的又一极具优势的新方法。然而，这些适配体传感器大多按1:1的信号：目标物比例输出信号，无法实现更低浓度目标物的高灵敏检测。因此，将信号放大策略运用到适配体传感器中以提高检测的灵敏度，这对于检测低浓度生物分子具有重要意义。
杂交链放大技术(Hybridization Chain Reaction，HCR)是基于两个发夹分子的识别、杂交的连锁反应的一种新技术，是检测特定序列的一种无酶扩增技术。HCR技术是目前构建高灵敏生物传感器常用的扩增方法。此外，酶催化放大技术亦是电化学信号放大技术中运用较成熟的技术之一，DNA模拟酶是指由G-四联体序列与血红素(Hemin)组成的具有过氧化物酶活性的复合物，也被称为G-四联体DNAzyme。相比于HRP，G-四联体DNAzyme具有高的化学稳定性，成本低，简单合成，易于修饰等优点，正作为催化信标引起人们的极大关注，在分析测试中具有广泛的应用。G-四联体DNAzyme可催化H2O2氧化邻苯二胺(OPD)生成具有电化学活性的2,2′-氨基偶氮苯(DAP)，其可作为电化学信号指示剂。G-四联体DNAzyme这种独特的催化性能非常有利于基于信号放大策略用于检测黄体酮适配体传感器的构建。因此，利用G-四联体DNAzyme信号放大策略进行电化学传感分析方法的开发具有重大的实际意义。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)用于检测黄体酮的方法，如HPLC、LC/MS、酶联免疫吸附试验和放射免疫分析，这些方法成本高，耗时长，需要复杂昂贵的科学仪器和专业的操作人员，且不易于小型化。
(2)目前，用于黄体酮检测的适配体传感策略的研究较少，且黄体酮在生物基质中的检测具有挑战性，因为其浓度在1ng·mL-1(1ng·mL-1＝0.325nM)左右，甚至更低。而大多适配体传感器按1:1的信号：目标物比例输出信号，其灵敏度低，检测范围窄，无法实现低浓度目标物的高灵敏检测。
解决上述技术问题的难度：一种基于信号放大策略的高灵敏度、高选择性用于黄体酮检测的适配体传感器的构建。
解决上述技术问题的意义：公开一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法。与传统的黄体酮检测方法相比，其避免了贵重仪器的分析方法的建立；使用核酸适配体为识别元件提高了目标物检测的选择性和稳定性。将信号放大策略与电分析方法相结合，构建以黄体酮为检测对象的电化学传感新方法和新技术，提高分析的灵敏度。本发明检测黄体酮的方法更简便，更灵敏，选择性且成本效益更高，在痕量生物小分子分析中有着重要的实际意义和发展前景。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法。
本发明的技术方案是：
基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法，具体包括以下步骤：
步骤一：黄体酮适配体、cDNA、H1和H2首次开盖使用前先离心，分别将其溶于二次水中配成100μM的母液，再用DNA稀释液分别稀释到特定浓度，4℃保存待用；
步骤二：玻碳电极的打磨及清洗：用三种不同粒径的Al2O3抛光粉依次在麂皮上将玻碳电极打磨抛光；之后用丙酮、无水乙醇、二次水依次超声清洗，自然晾干待用；
步骤三：通过电聚沉金的方法在步骤(二)处理好的玻碳电极表面沉积金纳米颗粒；
步骤四：将步骤(一)获得的适配体溶液滴加在步骤(三)玻碳电极表面上进行孵育，二次水轻轻冲洗，自然晾干；然后加入巯基己醇孵育，用于封闭电极表面剩余的活性位点，二次水轻轻冲洗，自然晾干；
步骤五：将步骤(一)获得的cDNA溶液滴加在步骤(四)电极表面上进行孵育，水洗、晾干。继续加上不同浓度的黄体酮目标溶液进行孵育，重复水洗、晾干操作；
步骤六：在步骤(五)电极表面上同时加入步骤(一)获得的H1和H2溶液混合孵育，水洗、晾干；继续加Hemin溶液孵育，重复水洗晾干操作；
步骤七：电化学检测：步骤(六)获得的修饰电极作为工作电极，参比电极是Ag/AgCl电极，对电极为铂电极，将三电极与电化学工作站相连接，通过示差脉冲伏安法对含有H2O2,OPD的PBS混合液进行扫描，记录电化学响应信号。
进一步，步骤一中，黄体酮适配体碱基序列为：5’-SH-TTT TTG CAT CAC ACA CCGATA CTC ACC CGC CTG ATT AAC ATT AGC CCA CCG CCC ACC CCC GCT GC-3’，cDNA碱基序列为：3’-TTG GTG GCG GGT-5’，H1碱基序列为：3’-GAG TGG GCG GAC TAA TTG TAA TCGTGC TTT GCA TTA CAA TTA GTC CGC TTT GGG TTG GGC GGG ATG GGT TTC TT-5’，H2碱基序列为：5’-ACG AAA CGT AAT GTT AAT CAG GCG CTC ACC CGC CTG ATT AAC ATT AGC TTCTTT GGG TAG GGC GGG TTG GGT TT-3’；离心条件为10000rpm，4℃条件下离心3min；DNA稀释液为pH 7.4、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液(包含1mmol/L MgCl2、1mmol/L CaCl2、5mmol/LKCl、0.14mol/LNaCl)；黄体酮适配体、cDNA、H1和H2浓度均为10μmol/L；对黄体酮适配体、cDNA、H1和H2浓度的控制，保证电化学响应信号峰值且无浪费。
进一步，步骤二中，依次用1μm、0.3μm、0.05μm不同粒径的Al2O3抛光粉打磨玻碳电极，分别顺时针磨50次，逆时针磨50次，丙酮、无水乙醇、二次水依次超声清洗时间为1min。对工作电极进行打磨及清洗，避免金属电极表面有一层氧化膜以及防止使用过的电极表面有残余，影响测定。
进一步，步骤三中，电极表面电聚沉金：将步骤(二)中的玻碳电极浸入1.0wt％氯金酸溶液中，在-0.2V沉积电位下沉积60s，之后用循环伏安法在-0.4V～0.4V电位下进行扫描直至获得稳定的电流响应信号，即在玻碳电极表面沉积了金纳米颗粒。其提高了电极表面积，且可通过Au-S键将大量适配体捕获在电极表面上，增加检测的灵敏性。
进一步，步骤四中，黄体酮适配体浓度为10μmol/L，用量为4μL，4℃下孵育12h；巯基己醇浓度为10mmol/L，用量为4μL，25℃下孵育30min。黄体酮适配体浓度、用量及孵育条件的控制，保证适配体完全修饰在电极表面上而无浪费；巯基己醇浓度、用量及孵育条件的控制，确保巯基己醇完全封闭电极表面剩余的活性位点而无浪费。
进一步，步骤五中，cDNA的浓度为10μmol/L,用量为4μL，25℃下孵育2h；不同浓度黄体酮溶液的用量为4μL，25℃下孵育2h。cDNA浓度、用量及孵育条件的控制，保证cDNA与适配体的完全杂交而无浪费；不同浓度黄体酮溶液的用量及孵育条件的控制，确保对目标物的完全结合并在实现检测的前提下，达到微量检测的目的，实现对目标样品的微损检测。
进一步，步骤六中，H1和H2浓度均为10μmol/L,用量均为2μL，25℃下孵育2h；Hemin浓度为0.3mmol/L，用量为4μL，25℃下孵育2h。H1、H2和Hemin浓度、用量及孵育条件的控制，保证电化学响应信号峰值且无浪费。
进一步，步骤七中，示差脉冲伏安法的扫描电位范围为0V～-0.6V，混合液为pH7.5、0.1mol/L PBS缓冲液(含0.003mol/L H2O2,0.018mol/L OPD)，混合液用量为3mL。检测底液pH控制亦是为了获得响应信号峰值；H2O2和OPD浓度控制保证信号获取及放大效果；本方法中响应信号出峰位置为-0.4V附近，对扫描电位范围的控制可以更好展示响应信号峰。
本发明基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器在黄体酮中的应用测定原理是：黄体酮适配体与cDNA形成双链通过Au-S键固定在电极上，当没有目标物黄体酮时，其作为杂交链式反应的引发序列，与其中一个发夹分子(H1)部分互补，使H1打开，其进一步与另一个发夹分子(H2)互补，打开H2。两个发夹分子不断相互打开并形成一条长的杂交链。同时H1和H2的富G序列与Hemin特异性结合形成具有过氧化物酶活性的G-四联体DNAzyme，其催化H2O2氧化邻苯二胺(OPD)生成具有强电化学活性的2,2′-氨基偶氮苯(DAP),从而产生电化学信号。当存在黄体酮时，黄体酮与适配体结合，不存在引发序列，两个发夹分子稳定存在，从而获得增强的电化学信号变化值。随着黄体酮浓度的增加，生成具有电化学活性的2,2′-氨基偶氮苯的量不断减少，DPV信号响应强度也就不断减弱，从而达到定量检测黄体酮的目的。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
(1)本发明提供了一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器用于黄体酮检测的方法，其电化学响应时间小于10s。与其他电化学分析方法(Journal ofMaterials Chemistry B.2016,4,3782--3787；Talanta.2017,174:243-255；Sensor andActuators B.2018,256:775-789)相比，由于G-四联体DNAzyme具有较强的催化性能，使得其对黄体酮检测的灵敏度大大的提高，其检测限达到了0.36ng/mL。
(2)此外，本发明使用核酸适配体为识别元件提高了目标物检测的选择性和稳定性。在常见黄体酮类似物炔诺酮、雌二醇、炔诺酮和雌二醇混合干扰物存在下，对黄体酮均具有良好的选择性(见图6)。
(3)相比于HRP，G-四联体DNAzyme具有较高的化学稳定性，成本低，合成简单，易于修饰等优点，避免使用高成本且稳定性差的生物酶。通过利用G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器，不仅可用于黄体酮的定量检测，只需将本发明中的适配体换成对应目标物的适配体即可应用于新目标物的检测分析。
本发明通过电化学传感示差脉冲伏安法对黄体酮进行高灵敏性定量检测，使用核酸适配体为识别元件提高目标物检测的选择性和稳定性。将信号放大策略与电分析方法相结合，构建以黄体酮为检测对象的电化学传感新方法和新技术，提高分析的灵敏度。为临床生物分子检测提供了一种简单、低廉、快速、高灵敏且性能稳定的检测新方法。
附图说明
图1为本发明实施例提供的基于基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法的流程图；
图2为本发明实施例提供的基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法的原理示意图；
图3为不同pH的PBS缓冲液对检测黄体酮的影响；
图4为不同反应时间对检测黄体酮的影响；
图5为不同黄体酮浓度的(A)DPV响应曲线图，(B)标准工作曲线图；
图6为检测黄体酮的选择性实验结果示意图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的目的在于提供一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法，以黄体酮检测为例；由于G-四联体DNAzyme催化H2O2氧化邻苯二胺生成具有电化学活性的2,2′-氨基偶氮苯后，其在电极表面产生氧化还原峰电流，导致电流响应信号大小随着G-四联体DNAzyme浓度的变化而变化；利用这个特点，可以建立一种简单、低廉、快速、灵敏且性能稳定的基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法的新方法。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细说明；
实施例中，各DNA序列如下：
aptamer：5’-SH-TTT TTG CAT CAC ACA CCG ATA CTC ACC CGC CTG ATT AAC ATTAGC CCA CCG CCC ACC CCC GCT GC-3’；
cDNA：3’-TTG GTG GCG GGT-5’；
H1：3’-GAG TGG GCG GAC TAA TTG TAA TCG TGC TTT GCA TTA CAA TTA GTC CGCTTT GGG TTG GGC GGG ATG GGT TTC TT-5’；
H2：5’-ACG AAA CGT AAT GTT AAT CAG GCG CTC ACC CGC CTG ATT AAC ATT AGCTTC TTT GGG TAG GGC GGG TTG GGT TT-3’.
实施例1:不同pH的PBS缓冲液对检测黄体酮的影响
(1)aptamer、cDNA、H1和H2首次开盖使用前先在10000rpm，4℃条件下离心3min；分别将其溶于二次水中配成100μmol/L的母液，再分别用pH 7.4、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液(包含1mmol/L MgCl2、1mmol/L CaCl2、5mmol/L KCl、0.14mol/L NaCl)稀释到特定浓度，4℃保存待用；
(2)玻碳电极的打磨及清洗：依次用1μm、0.3μm、0.05μm不同粒径的Al2O3抛光粉打磨玻碳电极，分别顺时针磨50次，逆时针磨50次，丙酮、无水乙醇、二次水依次超声清洗时间为1min，自然晾干待用；
(3)电聚沉金：将步骤(2)获得的玻碳电极浸入1.0wt％氯金酸溶液中，在-0.2V沉积电位下沉积60s，之后用循环伏安法在-0.4V～0.4V电位下进行扫描直至获得稳定的电流响应信号；
(4)将4μL步骤(1)获得的10μmol/L aptamer溶液滴加在步骤(3)获得的电极表面上，在4℃下孵育12h后，用二次水轻轻冲洗，自然晾干；然后加入4μL，10mmol/L巯基己醇在25℃下孵育30min。用于封闭电极表面剩余的活性位点，之后用二次水轻轻冲洗，自然晾干待用；
(5)将4μL步骤(1)获得的10μmol/L cDNA溶液滴加在步骤(4)获得的电极表面上，25℃下孵育2h，二次水轻轻冲洗、自然晾干。继续加上4μL，二次水在25℃下孵育2h，重复水洗、晾干操作。
(6)在步骤(5)获得的电极表面上同时加入4μL步骤(1)获得10μmol/LH1和H2，在25℃下混合孵育2h，水洗、晾干；继续加4μL，0.3mmol/L Hemin溶液，25℃孵育2h，重复水洗晾干操作；
(7)将步骤(6)获得的修饰电极作为工作电极，参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为铂电极，将三电极与电化学工作站相连接；通过示差脉冲伏安法(电位设置为0V～-0.6V)对3mL，pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，0.1mol/L的PBS缓冲液(含0.003mol/L H2O2,0.018mol/L OPD)进行扫描，记录电化学响应信号。以pH为横坐标，电流信号为纵坐标做曲线，如图3所示，无目标物存在下，在PBS缓冲液pH为7.5时，电流响应信号最强。
实施例2：不同反应时间对检测黄体酮的影响
(1)aptamer、cDNA、H1和H2首次开盖使用前先在10000rpm，4℃条件下离心3min；分别将其溶于二次水中配成100μmol/L的母液，再分别用pH 7.4、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液(包含1mmol/L MgCl2、1mmol/L CaCl2、5mmol/L KCl、0.14mol/L NaCl)稀释到特定浓度，4℃保存待用；
(2)玻碳电极的打磨及清洗：依次用1μm、0.3μm、0.05μm不同粒径的Al2O3抛光粉打磨玻碳电极，分别顺时针磨50次，逆时针磨50次，丙酮、无水乙醇、二次水依次超声清洗时间1min，自然晾干待用；
(3)电聚沉金：将步骤(2)获得的玻碳电极浸入1.0wt％氯金酸溶液中，在-0.2V沉积电位下沉积60s，之后用循环伏安法在-0.4V～0.4V电位下进行扫描直至获得稳定的电流响应信号；
(4)将4μL步骤(1)获得的10μmol/L aptamer溶液滴加在步骤(3)获得的电极表面上，在4℃下孵育12h后，用二次水轻轻冲洗，自然晾干；然后加入4μL，10mmol/L巯基己醇在25℃下孵育30min。用于封闭电极表面剩余的活性位点，之后用二次水轻轻冲洗，自然晾干待用；
(5)将4μL步骤(1)获得的10μmol/L cDNA溶液滴加在步骤(4)获得的电极表面上，25℃下孵育2h，二次水轻轻冲洗、自然晾干。继续加上4μL，3ng/ml的黄体酮目标溶液在25℃下分别孵育0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h，重复水洗、晾干操作。
(6)分别在步骤(5)获得的电极表面上同时加入4μL步骤(1)获得的10μmol/L H1和H2，在25℃下混合孵育2h，水洗、晾干；继续加4μL，0.3mmol/L Hemin溶液，25℃孵育2h，重复水洗晾干操作；
(7)将步骤(6)获得的修饰电极作为工作电极，参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为铂电极，将三电极与电化学工作站相连接；通过示差脉冲伏安法(电位设置为0V～-0.6V)对3mL，pH值为7.5，0.1mol/L的PBS缓冲液(含0.003mol/L H2O2,0.018mol/L OPD)进行扫描，记录电化学响应信号。以黄体酮与适配体的反应时间为横坐标，电流信号为纵坐标做曲线，如图4所示，检测到的电流信号随着反应时间在0.5～2h区间内增大而减小，当反应时间超过2h后，电流趋于稳定。
实施例3：检测黄体酮
如图1所示，本发明实施例提供的基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器构建及在黄体酮检测中的应用，具体包括以下步骤：
S101：aptamer、cDNA、H1和H2首次开盖使用前先在10000rpm，4℃条件下离心3min；分别将其溶于二次水中配成100μmol/L的母液，再分别用pH 7.4、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液(包含1mmol/L MgCl2、1mmol/L CaCl2、5mmol/L KCl、0.14mol/L NaCl)稀释到特定浓度，4℃保存待用；
S102：玻碳电极的打磨及清洗：依次用1μm、0.3μm、0.05μm不同粒径的Al2O3抛光粉打磨玻碳电极，分别顺时针磨50次，逆时针磨50次，丙酮、无水乙醇、二次水依次超声清洗时间1min，自然晾干待用；
S103：电聚沉金：将步骤(S102)获得的玻碳电极浸入1.0wt％氯金酸溶液中，在-0.2V沉积电位下沉积60s，之后用循环伏安法在-0.4V～0.4V电位下进行扫描直至获得稳定的电流响应信号；
S104：将4μL步骤(S101)获得的10μmol/L aptamer溶液滴加在步骤(S103)获得的电极表面上，在4℃下孵育12h后，用二次水轻轻冲洗，自然晾干；然后加入4μL，10mmol/L巯基己醇在25℃下孵育30min。用于封闭电极表面剩余的活性位点，之后用二次水轻轻冲洗，自然晾干待用；
S105：将4μL步骤(S101)获得的10μmol/L cDNA溶液滴加在步骤(S104)获得的电极表面上，25℃下孵育2h，二次水轻轻冲洗、自然晾干。加上4μL，不同浓度的黄体酮目标溶液，在25℃下孵育2h，重复水洗、晾干操作。
S106：在步骤(S105)获得的电极表面上同时加入4μL步骤(S101)获得的10μmol/LH1和H2，在25℃下混合孵育2h，水洗、晾干；继续加4μL，0.3mmol/L Hemin溶液，25℃孵育2h，重复水洗晾干操作；
S107：将步骤(S106)获得的修饰电极作为工作电极，参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为铂电极，将三电极与电化学工作站相连接；通过示差脉冲伏安法(电位设置为0V～-0.6V)对3mL，pH值为7.5，0.1mol/L的PBS缓冲液(含0.003mol/L H2O2,0.018mol/L OPD)进行扫描，记录电化学响应信号。根据电流响应信号的大小和黄体酮浓度变化的关系绘制标准工作曲线。如图5(A)所示，检测到的电流信号随着目标物浓度在0.5～15ng/ml区间内增加而减小；图(B)显示黄体酮浓度的对数与电流峰值大小呈正比关系，拟合曲线为y＝-1.194x+3.252，y为电流峰值，x为黄体酮浓度的对数，相关系数是0.994。
本发明实施例提供的一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器构建及在黄体酮检测中应用的测定原理：
黄体酮适配体与cDNA形成双链通过Au-S键固定在电极上，当没有目标物黄体酮时，其作为杂交链式反应的引发序列，与其中一个发夹分子(H1)部分互补，使H1打开，其进一步与另一个发夹分子(H2)互补，打开H2。两个发夹分子不断相互打开并形成一条长的杂交链。同时H1和H2的富G序列与Hemin特异性结合形成具有过氧化物酶活性的G-四联体DNAzyme，其催化H2O2氧化邻苯二胺(OPD)生成具有强电化学活性的2,2′-氨基偶氮苯(DAP),从而产生电化学信号。当存在黄体酮时，黄体酮与适配体结合，不存在引发序列，两个发夹分子稳定存在，从而获得增强的电化学信号变化值。随着黄体酮浓度的增加，生成具有电化学活性的2,2′-氨基偶氮苯的量不断减少，DPV信号响应强度也就不断减弱，从而达到定量检测黄体酮的目的。
本发明可以通过电化学传感示差脉冲伏安法对黄体酮的浓度进行高灵敏性的定量检测，随着黄体酮浓度的增加，电流响应信号不断降低，对黄体酮的检测限为0.36ng/ml，线性范围是0.5ng/ml～15ng/ml。本发明涉及使用核酸适配体为识别元件提高目标物检测的选择性和稳定性。将信号放大策略与电分析方法相结合，构建以黄体酮为检测对象的电化学传感新方法和新技术，提高分析的灵敏度。为食品、环境和临床监测等重要领域提供技术平台和研究数据。实验数据见图3～图5。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：黄体酮适配体、cDNA、H1和H2首次开盖使用前先离心，分别将其溶于二次水中配成100μM的母液，再用DNA稀释液分别稀释，4℃保存待用；
步骤二：玻碳电极的打磨及清洗：用三种不同粒径的Al2O3抛光粉依次在麂皮上将玻碳电极打磨抛光；之后用丙酮、无水乙醇、二次水依次超声清洗，自然晾干待用；
步骤三：通过电聚沉金的方法在步骤二处理好的玻碳电极表面沉积金纳米颗粒；
步骤四：将步骤一获得的适配体溶液滴加在步骤三玻碳电极表面上进行孵育，二次水轻轻冲洗，自然晾干；然后加入巯基己醇孵育，用于封闭电极表面剩余的活性位点，二次水轻轻冲洗，自然晾干；
步骤五：将步骤一获得的cDNA溶液滴加在步骤四电极表面上进行孵育，水洗、晾干；继续加上不同浓度的黄体酮目标溶液进行孵育，重复水洗、晾干操作；
步骤六：在步骤五电极表面上同时加入步骤一获得的H1和H2溶液混合孵育，水洗、晾干；继续加Hemin溶液孵育，重复水洗晾干操作；
步骤七：电化学检测：步骤六获得的修饰电极作为工作电极，参比电极是Ag/AgCl电极，对电极为铂电极，将三电极与电化学工作站相连接，通过示差脉冲伏安法对含有H2O2,OPD的PBS混合液进行扫描，记录电化学响应信号。
2.根据权利要求1所述的一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法，其特征在于，步骤一中，黄体酮适配体碱基序列为：5’-SH-TTT TTG CATCAC ACA CCG ATA CTC ACC CGC CTG ATT AAC ATT AGC CCA CCG CCC ACC CCC GCT GC-3’，cDNA碱基序列为：3’-TTG GTG GCG GGT-5’，H1碱基序列为：3’-GAG TGG GCG GAC TAATTG TAA TCG TGC TTT GCA TTA CAA TTA GTC CGC TTT GGG TTG GGC GGG ATG GGT TTCTT-5’，H2碱基序列为：5’-ACG AAA CGT AAT GTT AAT CAG GCG CTC ACC CGC CTG ATT AACATT AGC TTC TTT GGG TAG GGC GGG TTG GGT TT-3’；离心条件为10000rpm，4℃条件下离心3min；DNA稀释液为pH7.4、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液(包含1mmol/L MgCl2、1mmol/LCaCl2、5mmol/L KCl、0.14mol/L NaCl)；稀释后黄体酮适配体、cDNA、H1和H2的浓度均为10μmol/L。
3.根据权利要求1所述的一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法，其特征在于，步骤二中，依次用1μm、0.3μm、0.05μm不同粒径的Al2O3抛光粉打磨玻碳电极，分别顺时针磨50次，逆时针磨50次，丙酮、无水乙醇、二次水依次超声清洗时间为1min。
4.根据权利要求1所述的一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法，其特征在于，步骤三中，电聚沉金的方法是将步骤二中的玻碳电极浸入1.0wt％氯金酸溶液中，在-0.2V沉积电位下沉积60s，之后用循环伏安法在-0.4V～0.4V电位下进行扫描直至获得稳定的电流响应信号，即得表面沉积了金纳米颗粒的玻碳电极。
5.根据权利要求1所述的一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法，其特征在于，步骤四中，黄体酮适配体浓度为10μmol/L，用量为4μL，4℃下孵育12h；巯基己醇浓度为10mmol/L，用量为4μL，25℃下孵育30min。
6.根据权利要求1所述的一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法，其特征在于，步骤五中，cDNA的浓度为10μmol/L,用量为4μL，25℃下孵育2h；不同浓度的黄体酮溶液的用量为4μL，25℃下孵育2h。
7.根据权利要求1所述的一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法，其特征在于，步骤六中，H1和H2浓度均为10μmol/L,用量均为2μL，25℃下孵育2h；Hemin浓度为0.3mmol/L，用量为4μL，25℃下孵育2h。
8.根据权利要求1所述的一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法，其特征在于，步骤七中，示差脉冲伏安法的扫描电位范围为0V～-0.6V；混合液为pH7.5、0.1mol/L PBS缓冲液(含0.003mol/L H2O2,0.018mol/L OPD)，混合液用量为3mL。
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