CN108226141A - 一种基于原位合成的Ag纳米簇电致化学发光传感器的研制及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于原位还原的银纳米簇富集在含有胞嘧啶(C)的环型DNA序列作为信号探针以及采用双重放大策略的电化学发光生物传感器检测目标凝血酶。本发明技术方案是设计识别发夹DNA且具有催化作用的DNA剪切酶，当有目标凝血酶时，打开发夹DNA，在Zn2+作用下对底物DNA进行剪切。再通过杂交链式反应(HCR)聚合大量的含有胞嘧啶(C)的DNA序列，通过NaBH4在电极表面原位还原AgNO3，形成大量的银纳米簇，构建具有双重放大作用的电化学发光生物传感器。将传感器进行发光检测，发光信号与待测样品的浓度成线性关系。本发明将Ag纳米簇信号探针与DNA双重放大技术相结合，快速、高灵敏检测凝血酶，在早期临床分析检测中具有巨大的应用潜力。
Description
技术领域：
本发明涉及了一种基于原位合成的银纳米簇电化学发光生物传感器的研制新方法；以及利用该电化学发光生物传感器结合双重信号放大技术检测凝血酶的分析应用。
背景技术：
跟踪分析和检测生物分子如DNA、蛋白质的生物活性与人类健康密切相关[Fields,S.Science 2001,291,1221-1224.]。然而在疾病诊断和活体探究过程中生物分子的浓度却很低，仍需研究更灵敏的方法检测这些生物分子。电致化学发光(ECL)分析具有较低的背景和较高的灵敏度，已被广泛用于生物分析中。纳米粒子由于其在诊断和治疗方面具有潜在的功能被广泛应用于生物医学领域。[Dreaden,E.C.；Alkilany,A.M.；Huang,X.；Murphy,C.J.；El-Sayed,M.A.Chem.Soc.Rev.2012,41,2740-2779.]。早在2002年，Bard’s课题组首次报道了量子点纳米材料的电化学发光[Ding,Z.F.；Quinn,B.M.；Haram,S.K.；Pell,L.E.；Korgel,B.A.；Bard,A.J.Science 2002,296,1293-1297.]，随后量子点的电化学发光性能被广泛关注[Hesari,M.；Swanick,K.N.；Lu,J.-S.；Whyte,R.；Wang,S.；Ding,Z.J.Am.Chem.Soc.2015,137,11266-11269.]。但是，在ECL研究中大多数量子点带有有毒的重金属离子(比如铅、镉重金属)，限制了其在生物分析中的应用。因此，探究一种新型低毒的ECL纳米材料具有非常重要的意义。贵金属纳米簇，如AuNCs、AgNCs，由于具有低毒性、较好的生物相容性、较大的比表面积、良好的稳定性在生物传感领域得到越来越多的研究[Hesari,M.；Workentin,M.S.；Ding,Z.ACS Nano 2014,8,8543-8553.]。目前，DNA稳定的AgNCs被广泛应用于多功能的生物标记中[Tao,Y.；Ran,X.；Ren,J.；Qu,X.Small 2014,10,3667-3671.]。Dickson’s课题组首次以DNA为模板合成了AgNCs[Petty,J.T.；Zheng,J.；Hud,N.V.；Dickson,R.M.J.Am.Chem.Soc.2004,126,5207-5212.]。Willner’s课题组[Enkin,N.；Wang,F.；Sharon,E.；Albada,H.B.；Willner,I.ACS Nano 2014,8,11666-11673.]利用DNA稳定的AgNCs荧光实现了基因的检测。AgNCs作为荧光标记物被广泛应用于细胞染色[Han,B.Y.；Wang,E.K.Chem.2012,402,129-138.]及分子检测中，如：DNA[Zhang,L.B.；Zhu,J.B.；Zhou,Z.X.；Guo,S.J.；Li,J.；Dong,S.J.；Wang,E.K.Chem.Sci.2013,4,4004-4010.]，RNA[Dong,H.F.；Hao,K.H.；Tian,Y.P.；Jin,S.；Lu,H.T.；Zhou,S.F.；Zhang,X.J.Biosens.Bioelectron.2014,53,377-383.]，及蛋白质[Liu,J.J.；Song,X.R.；Wang,Y.W.；Zheng,A.X.；Chen,G.N.；Yang,H.H.Anal.Chim.Acta 2012,749,70-74.]。虽然AgNCs具有氧化还原性，但很少应用于ECL分析检测中。
另外，DNA酶相比于蛋白质酶具有更好的稳定性，近年来，为提高生物分析的灵敏度，DNA酶被用于不同的信号放大策略[Zhao,X.H.；Gong,L.；Zhang,X.B.；Yang,B.；Fu,T.；Hu,R.；Tan,W.H.；Yu,R.Q.Versatile DNAzyme-Based Amplified Biosensing Platformsfor Nucleic Acid,Protein,and Enzyme Activity Detection.Anal.Chem.2013,85,3614-3620.]。基于DNA酶的循环放大技术与适体结合应用于蛋白质的检测[Li,J.S.；Jia,Y.H.；Zheng,J.；Zhong,W.W.；Shen,G.L.；Yang,R.H.；Tan,W.H.Chem.Commun.2013,49,6137-6139.]。然而，还鲜有报道将DNA酶循环放大技术与纳米放大效应等相结合，并应用于高灵敏的ECL生物传感分析。
本发明以DNA为模板原位还原的AgNCs作为信号探针，研制了基于DNA酶的循环剪切和杂交链式反应相结合的双重信号放大技术的电化学发光生物传感器，建立了高灵敏、快速、简便检测目标凝血酶的电化学发光分析新方法。目标凝血酶通过DNA酶循环剪切产生大量的DNA中间序列(s1)，s1引发了杂交链式反应(HCR)放大方法，产生大量的原位还原的AgNCs，实现了对凝血酶的高灵敏ECL检测。该ECL生物传感器在生物医学分析和早期临床诊断中具有巨大的应用潜力。
发明内容：
本发明的目的之一是提供一种具有良好电化学发光(ECL)性能的银纳米簇信号探针，它以富含胞嘧啶(C)的环型DNA为模板，通过NaBH4在金电极表面原位还原AgNO3合成大量银纳米簇AgNCs。
具体包括以下步骤：
步骤1.DNA酶循环剪切过程:1μM发夹DNA在37℃下预活化1h，然后加入10μL不同浓度的目标凝血酶，在Tris-HCl缓冲液中(37℃)温育1h。再向上述缓冲液中加入底物(5μL，3μM)和醋酸锌溶液(10μL，0.01M)，溶液总体积为50μL，在37℃下温育50～60min。记为溶液s1。
步骤2.DNA模板的制备：将修饰电极浸入循环剪切后的DNA产物溶液(s1)中1h，用PBS缓冲液冲洗后，接着将电极浸入到含有H1(1μΜ)和H2(1μM)混合溶液中，室温下培养1～2h，用PBS冲洗并用氮气吹干。
步骤3.银纳米簇的制备：然后取8μL 200μM的AgNO3(溶解在柠檬酸钠溶液中，20mM柠檬酸钠pH＝7.4)滴加在电极表面，置于黑暗下15min。随后，取5μL 500μM新鲜的NaBH4溶液(在柠檬酸钠溶液中，20mM柠檬酸钠pH＝7.4)滴加在电极表面完全覆盖AgNO3溶液，在室温黑暗下反应1～2h，将AgNO3还原制备了银纳米簇(AgNCs)。
本发明的目的之二是提供一种基于银纳米簇信号探针的电化学发光生物传感器，以及利用该生物传感器结合双重放大技术检测凝血酶的分析应用。它由下列步骤组成：
生物传感器的制备：
步骤1.取8μL 0.05％PDDA滴加在金电极表面，自然晾干，然后将电极浸入到金胶溶液中20min，冲洗，用氮气吹干。再取8μL SH-DNA(0.5～1μM)滴加在电极表面，并在室温下培养过夜。接着用8μL1mM MCH封阻2h。
步骤2.将电极浸入到目标引发的循环剪切产物s1溶液中培养1h，然后按照发明一的方法在电极上制得原位合成的银纳米簇信号探针。
步骤3.最后将带有银纳米簇信号探针的电极用PBS冲洗(0.1M pH＝7.4)，并进行ECL检测，发光强度和目标凝血酶的浓度成线性关系。
所述的ECL信号检测在pH＝7.4的含有0.05M K2S2O8和0.1M KCl的PBS溶液中进行，金电极为工作电极、Pt电极为对电极、甘汞电极为参比电极的三电极体系，用MPI-A型电致化学发光仪，电压从-2.0到0V，扫描速率为0.1V/S。光电倍增管为-900V。
本发明利用原位合成的银纳米簇作为电化学发光信号探针，具有较强的发光性能，并采用目标循环放大和杂交链式反应双重放大策略研制了电化学发光生物传感器，成功实现了对凝血酶高灵敏、高选择性检测。该研究在生物医学分析和早期临床诊断中具有良好的应用前景。
本发明与现有技术相比，主要优点在于：本发明利用原位制备的银纳米簇作为电化学发光信号探针，银纳米簇具有特异的光学、电化学性能，产生较强的电化学发光信号，极大的提高了检测的灵敏度；本发明将制备的银纳米簇ECL信号探针与目标循环放大和杂交链式反应技术相结合，大量的银纳米簇被组装到电极上，实现了对凝血酶的高灵敏、高选择性检测。
本发明的电致化学发光传感器表现出了优良的准确性、高灵敏性、高选择性，稳定性与重现性，分析检测迅速、方便，该生物传感器在生物医学分析检测和早期临床诊断中具有巨大的应用潜力，可用于实际样品的检测。
附图说明：
图1不同修饰阶段电极的扫描电镜图：(A)AuNPs/PDDA/电极，(B)H1、H2/s1/cDNA/AuNPs/PDDA/电极，(C)AgNPs/H1、H2/s1/cDNA/AuNPs/PDDA/电极；与能谱图：(D)AgNPs/H1、H2/s1/cDNA/AuNPs/PDDA/电极。
图2不同修饰阶段电极的循环伏安图：(a)裸电极，(b)AuNPs/PDDA/电极，(c)MCH/cDNA/AuNPs/PDDA/电极，(d)H1、H2/s1/cDNA/AuNPs/PDDA/电极。
图3基于原位合成Ag纳米簇的电致化学发光传感器原理图
图4不同修饰阶段电极的ECL-时间曲线图：(a)裸电极，(b)AuNPs/PDDA/电极，(c)AgNCs/H1、H2/s1/cDNA/AuNPs/PDDA/电极
图5(A)不同浓度凝血酶对应的ECL信号：(i)0，(a)10fM，(b)0.1fM，(c)1pM，(d)10pM，(e)0.1nM，(f)1nM，(g)10nM；(B)ECL信号变化(ΔECL)和目标凝血酶浓度的关系图，插图为目标凝血酶检测的标准校正曲线。
图6该生物传感器检测目标的选择性。
具体实施方式：
实施例1.电致化学发光生物传感器的制备及对凝血酶的检测
DNA酶循环剪切过程:首先，1μM发夹DNA在37℃预活化1h，然后取10μL不同浓度的凝血酶(2μM)加入，并在Tris-HCl缓冲液中37℃下培养1h。随后开始剪切和循环过程，向上述缓冲液中加入底物(5μL，3μM)和10μL0.01M醋酸锌溶液，最终使得上述溶液的体积为50μL，并在37℃培养50min。记为溶液s1。
DNA在稀释前，按照说明向管内加入相应量的缓冲液，配制成浓度均为10-4mol/LDNA溶液，将其置于4℃下保存备用。
电极的处理：首先，金电极用1.0，0.3，0.05μm的α-Al2O3粉磨光5min，之后用超纯水彻底冲洗并用氮气吹干。然后对电极进行电化学清洗，在0.5M H2SO4溶液中电位从-0.3到1.5V对电极进行电化学扫描，出现完整的循环伏安峰，用超纯水冲洗干净并用氮气干燥。之后，取8μL0.05％PDDA滴加在电极表面，自然晾干。接着将电极浸入到金胶溶液中20min，然后冲洗，用氮气吹干。
接下来取8μL用固定缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，10mM TCEP，0.1M NaCl pH＝7.4)稀释的SH-DNA(0.5μM)滴加在电极表面，并在室温下过夜。用超纯水冲洗并用氮气吹干，最终SH-DNA与纳米金通过Au-S键修饰在电极表面。接着用8μL1mM MCH封阻2h，制备MCH/SH-DNA/AuNPs/PDDA/AuE。再将电极浸入循环剪切后的s1溶液中培养1h，通过DNA杂交方式来捕获s1。用PBS缓冲液冲洗后，将电极浸入H1(1μΜ)和H2(1μM)混合物中，室温下培养2h，用PBS冲洗并用氮气吹干。然后取8μL200μM的AgNO3(溶解在柠檬酸钠溶液中，20mM柠檬酸钠，pH＝7.4)滴加在电极表面，置于黑暗下15min。随后，取5μL500μM新鲜的NaBH4溶液(在柠檬酸钠溶液中，20mM柠檬酸钠pH＝7.4)小心滴加在电极表面，完全覆盖AgNO3溶液，在室温黑暗下反应2h，AgNO3还原成AgNCs。最后电极用PBS冲洗(0.1M pH＝7.4)，进行ECL测量。
实施例2.电致化学发光生物传感器的制备及对凝血酶的检测
将“随后开始剪切和循环过程，向上述缓冲液中加入底物(5μL，3μM)和10μL0.01M醋酸锌溶液，最终使得上述溶液的体积为50μL，并在37℃培养50min。”改为“随后开始剪切和循环过程，向上述缓冲液中加入底物(5μL，3μM)和10μL 0.01M醋酸锌溶液，最终使得上述溶液的体积为50μL，并在37℃培养60min。”制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的生物传感器。对凝血酶检测的结果同实施例1。
实施例3.电致化学发光生物传感器的制备及对凝血酶的检测
将“接下来取8μL用固定缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，10mM TCEP，0.1M NaClpH＝7.4)稀释的SH-DNA(0.5μM)滴加在电极表面”改为“接下来取8μL用固定缓冲液(10mMTris-HCl，1mM EDTA，10mM TCEP，0.1M NaCl pH＝7.4)稀释的SH-DNA(1μM)滴加在电极表面”。制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的生物传感器。对凝血酶检测的结果同实施例1。
实施例4.电致化学发光生物传感器的制备及对凝血酶的检测
将“随后，取5μL 500μM新鲜的NaBH4溶液(溶液在柠檬酸钠溶液中，20mM柠檬酸钠pH＝7.4)小心滴加在电极表面完全覆盖AgNO3溶液，在室温黑暗下反应1h将AgNO3还原成AgNCs”改为“随后，取5μL 500μM新鲜的NaBH4溶液(溶液在柠檬酸钠溶液中，20mM柠檬酸钠pH＝7.4)小心滴加在电极表面完全覆盖AgNO3溶液，在室温黑暗下反应2h将AgNO3还原成AgNCs”。制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的生物传感器。对凝血酶检测的结果同实施例1。
Claims (3)
1.一种基于原位合成的Ag纳米簇电致化学发光传感器，其特征是：原位还原的银纳米簇富集在含有胞嘧啶(C)的环型DNA序列上作为ECL信号探针，通过DNA酶辅助目标循环和杂交链式反应(HCR)双重放大策略，构建电致化学发光生物传感器。
2.一种制备权利要求1所述的Ag纳米簇的电致化学发光传感器的方法，其特征步骤由下列步骤组成：
步骤1.DNA酶循环剪切过程：DNA酶循环剪切过程按照以前文献中报道的培养。首先，1μM发夹DNA在37℃预活化1h，然后取10μL不同浓度的凝血酶(2μM)加入，并在Tris-HCl缓冲液中37℃下培养1h。随后开始剪切和循环过程，向上述缓冲液中加入底物(5μL，3μM)和10μL0.01M醋酸锌溶液，最终使得上述溶液的体积为50μL，并在37℃培养1h。
步骤2.电极的处理：首先，金电极浸在piranha溶液(98％H2SO4:30％H2O2为3:1)中至少30min。接着用1.0，0.3，0.05μm的α-Al2O3泥浆磨光5min，之后用超纯水彻底冲洗并用氮气吹干后，分别在乙醇、超纯水中对电极进行超声处理以除去残留的氧化铝粉。然后对电极进一步电化学清洗，在0.5M H2SO4溶液中电位从-0.3到1.5V对电极进行电化学扫描，直到出现一个完整的循环伏安峰，接下来用超纯水冲洗干净并用氮气干燥。之后，取8μL0.05％PDDA滴加在电极表面，自然晾干，这样电极表面修饰一层带正电荷的PDDA，可与带负电荷的金胶结合。接着将电极浸入到金胶溶液中20min，然后冲洗，用氮气吹干。
步骤3生物传感器的制备：DNA在稀释前，首先在12000rpm下离心5min，目的是将DNA附在管壁上，防止打开时散失。然后按照说明向管内加入相应量的缓冲液，配制成浓度均为10-4mol/L DNA溶液,将其置于4℃下保存备用。
接下来取8μL用固定缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，10mM TCEP，0.1M NaCl pH＝7.4)稀释的SH-DNA(0.5μM)滴加在电极表面，并在室温下过夜培养，之后，用超纯水冲洗并用氮气吹干，最终SH-DNA与金纳米颗粒通过Au-S键修饰在电极表面。接着用8μL1mM MCH封阻2h制备得到MCH/SH-DNA/AuNPs/PDDA/AuE。之后用超纯水冲洗，并用氮气干燥。接下来，将电极浸入经过之前循环剪切之后的溶液中培养1h，通过DNA杂交方式来捕获碎片。用PBS缓冲液冲洗后，接着将浸入到用PBS缓冲液稀释的H1(1μΜ)和H2(1μM)混合物中，室温下培养2h，用PBS冲洗并用氮气吹干。然后取8μL 200μM的AgNO3(溶解在柠檬酸钠溶液中，20mM柠檬酸钠pH＝7.4)滴加在电极表面，置于黑暗下15min。随后，取5μL 500μM新鲜的NaBH4溶液(溶液在柠檬酸钠溶液中，20mM柠檬酸钠pH＝7.4)小心滴加在电极表面完全覆盖AgNO3溶液，在室温黑暗下反应2h将AgNO3还原成AgNCs[62]。最后电极用PB冲洗(PB，0.1M pH＝7.4)并进行ECL检测。
3.根据权利要求2所述的凝血酶检测方法，其特征是：所述的电化学发光测试是以修饰好的金电极(基于Ag纳米簇的电化学发光传感器)为工作电极、Pt电极为对电极、甘汞电极为参比电极的三电极体系，用MPI-A型电致化学发光仪，在0到-2.0V进行循环伏安扫描，光电倍增管高压设为-900V。
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Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108982483A (zh) * | 2018-08-21 | 2018-12-11 | 青岛科技大学 | 一种基于Walker DNA和放大技术的电化学发光生物传感器及其制法和应用 |
| CN109444117A (zh) * | 2018-11-05 | 2019-03-08 | 青岛科技大学 | 一种基于银纳米簇猝灭效应和多重放大技术的电化学发光生物传感器及其应用 |
| CN109580743A (zh) * | 2018-11-08 | 2019-04-05 | 青岛科技大学 | 一种基于离子交换技术及多重放大反应的光致电化学传感器的研制及其应用 |
| CN109765387A (zh) * | 2019-02-27 | 2019-05-17 | 安徽师范大学 | 基于硫化银光热效应的生物传感器及其制备方法和应用以及NF-kB1的定量检测方法 |
| CN110082412A (zh) * | 2019-05-22 | 2019-08-02 | 苏州健雄职业技术学院 | 一种基于生物传感器的检测痕量银离子的方法 |
| CN110132946A (zh) * | 2019-06-11 | 2019-08-16 | 安徽师范大学 | 一种适配体传感器及其制备方法和应用 |
| CN113552188A (zh) * | 2021-07-23 | 2021-10-26 | 济南大学 | 一种基于dna四面体的检测赭曲霉毒素a的电化学生物传感器 |
| CN115518701A (zh) * | 2022-09-30 | 2022-12-27 | 天津医科大学 | 用于miRNA检测的金纳米花微阵列芯片的制备及检测方法 |
| CN113073132B (zh) * | 2021-03-30 | 2024-01-19 | 安徽工业大学 | ECL生物传感器及其在制备用于检测心梗miRNA的检测体系中的应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104267192A (zh) * | 2014-03-06 | 2015-01-07 | 上海大学 | 检测凝血酶用生物电化学传感器其制备方法及应用 |
-
2018
- 2018-01-04 CN CN201810000965.9A patent/CN108226141A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104267192A (zh) * | 2014-03-06 | 2015-01-07 | 上海大学 | 检测凝血酶用生物电化学传感器其制备方法及应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GUIFEN JIE 等: "A novel silver nanocluster in situ synthesized as versatile probe for electrochemiluminescence and electrochemical detection of thrombin by multiple signal amplification strategy", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 * |
| 刘琳: "基于银纳米簇和核酸探针生物传感新方法研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》 * |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108982483A (zh) * | 2018-08-21 | 2018-12-11 | 青岛科技大学 | 一种基于Walker DNA和放大技术的电化学发光生物传感器及其制法和应用 |
| CN109444117A (zh) * | 2018-11-05 | 2019-03-08 | 青岛科技大学 | 一种基于银纳米簇猝灭效应和多重放大技术的电化学发光生物传感器及其应用 |
| CN109580743A (zh) * | 2018-11-08 | 2019-04-05 | 青岛科技大学 | 一种基于离子交换技术及多重放大反应的光致电化学传感器的研制及其应用 |
| CN109765387A (zh) * | 2019-02-27 | 2019-05-17 | 安徽师范大学 | 基于硫化银光热效应的生物传感器及其制备方法和应用以及NF-kB1的定量检测方法 |
| CN109765387B (zh) * | 2019-02-27 | 2021-09-28 | 安徽师范大学 | 基于硫化银光热效应的生物传感器及其制备方法和应用以及NF-kB1的定量检测方法 |
| CN110082412A (zh) * | 2019-05-22 | 2019-08-02 | 苏州健雄职业技术学院 | 一种基于生物传感器的检测痕量银离子的方法 |
| CN110132946A (zh) * | 2019-06-11 | 2019-08-16 | 安徽师范大学 | 一种适配体传感器及其制备方法和应用 |
| CN110132946B (zh) * | 2019-06-11 | 2021-09-28 | 安徽师范大学 | 一种适配体传感器及其制备方法和应用 |
| CN113073132B (zh) * | 2021-03-30 | 2024-01-19 | 安徽工业大学 | ECL生物传感器及其在制备用于检测心梗miRNA的检测体系中的应用 |
| CN113552188A (zh) * | 2021-07-23 | 2021-10-26 | 济南大学 | 一种基于dna四面体的检测赭曲霉毒素a的电化学生物传感器 |
| CN115518701A (zh) * | 2022-09-30 | 2022-12-27 | 天津医科大学 | 用于miRNA检测的金纳米花微阵列芯片的制备及检测方法 |
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