CN109765387B - 基于硫化银光热效应的生物传感器及其制备方法和应用以及NF-kB1的定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于硫化银光热效应的生物传感器及其制备方法和应用以及NF‑kB1的定量检测方法，通过氨基和羧基缩合反应将末端修饰氨基且含有NF‑kB1结合位点、部分配对的DNA双链修饰在羧基功能的孔板中，并且与一条引发链通过胡斯坦碱基配对构成DNA三链结构，加入少量银离子强化这种结构稳定性。再加入富胞嘧啶的首尾部分配对的两条发夹DNA，在引发链作用下诱导HP1和HP2发生杂交链式反应，并加入银离子在富C部分构成C‑Ag+‑C超夹心结构。当加入转录因子NF‑kB1后，NF‑KB1会与DNA双链结合，释放出杂交链上的大量Ag+。Ag+与ZnS反应置换出的Ag2S在808nm近红外激光的照射下会产生明显的光热效应。进而使用简单的温度计即可实现对于NF‑kB1浓度的定量检测，该检测方法的灵敏度高，且操作方便。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于硫化银光热效应的生物传感器及其制备方法和应用以及NF-kB1的定量检测方法。
背景技术
转录因子在基因调控中扮演着至关重要的角色，影响的生物体细胞的生长、分化、增殖及凋亡。近年来，对转录因子的定量检测受到越来越多人的关注。
许多研究表明，通常情况下，转录因子以非活性状态存在于细胞中等待被特定配体激活，激活后导致靶基因的表达。抑制活性或者不正确地激活转录因子可能导致包括发育障碍、激素分泌异常、炎症和癌症等多种疾病。
对转录因子定量检测的研究，目前已经有很多方法，如电泳迁移率变动分析(EMSA)、DNA足迹法、酶链免疫吸附实验(ELISA)以及免疫印迹分析等。但是，这些传统方法需要使用昂贵的仪器作为读出器对目标物进行定量检测，这样限制了在偏远贫穷地区的推广使用和即时检测上的应用。
因此，有关转录因子NF-kB的定量检测已成为当下病理生理检测的研究热点，能够实现对转录因子NF-kB的简便、读出器易得的定量检测是当下需要解决的问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于硫化银光热效应的生物传感器及其制备方法和应用以及NF-kB1的定量检测方法。根据本发明的方法构建的生物传感器，仅利用简单的温度计即可实现对于转录因子NF-kB1的定量检测，且操作简单，灵敏度高。
本发明采取的技术方案为：
一种基于硫化银光热效应的生物传感器的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将等体积等摩尔浓度的DNA S1溶液和DNA S2溶液混合并稀释，加热反应后得到双链dsDNA溶液；
(2)将等体积等摩尔浓度的HP1溶液、HP2溶液混合并稀释得到未杂交的 HPs溶液，向未杂交的HPs溶液中加入等体积的硝酸银溶液，于黑暗中反应后得到包含C-Ag+-C的未杂交HPs溶液；
(3)向羧基功能化的孔板中加入双链dsDNA溶液，反应后回收双链dsDNA 溶液；
(4)继续向羧基功能化的孔板中加入Trigger溶液和硝酸银溶液；
(5)步骤(4)反应结束后，继续向羧基功能化的孔板中加入步骤(2)得到的包含C-Ag+-C的未杂交HPs溶液；
(6)步骤(5)反应结束后，继续向羧基功能化的孔板中加入转录因子NF-kB1 溶液，即可得到基于硫化银光热效应的生物传感器。步骤(6)反应结束后，移取部分反应液加入到含有硫化锌的普通孔板中，用808nm红外激光照射，并用温度计进行测温，可发现随着照射时间的延长，溶液的温度逐渐升高，并在照射5min之后趋于稳定。
进一步地，步骤(6)中，硫化锌相对于从羧基功能化的孔板中取出的溶液的浓度为1g/L。
进一步地，所述DNA S1、DNA S2、Trigger、HP1、HP2的基因序列分别如下：
DNA S1：3’-NH-(CH2)6-GGAGGACCTTTCAGGGTG-5’；
DNA S2：3’-CACCCTGAAAGGTC-5’；
Trigger：3’-GGCACTTACCAGGGGGTTAGTGGGTCTTTCCAG-5’；
HP1：
3’-CCCCCCCCCCCCCCCCCCTGGTAAGTGCCAGAGAGGCACTTACCA-5’；
HP2：3’-GGCACTTACCAAGAGATGGTAAGTGCC-5’。
进一步地，所述的基于硫化银光热效应的生物传感器的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将等体积等摩尔浓度的DNA S1溶液和DNA S2溶液混合并稀释至 DNA S1的浓度为1μM，95℃加热反应5min后得到双链dsDNA溶液；
(2)将等体积等摩尔浓度的HP1溶液、HP2溶液混合并稀释得到未杂交的 HPs溶液，未杂交的HPs溶液中的HP1的浓度为50μM；向未杂交的HPs溶液中加入等体积的450μM的硝酸银溶液，于黑暗中反应1h后得到包含C-Ag+-C 的未杂交HPs溶液；
(3)向羧基功能化的孔板中加入30μL双链dsDNA溶液，反应24h后回收双链dsDNA溶液；
(4)继续向羧基功能化的孔板中加入10μL Trigger溶液和10μL 8μM的硝酸银溶液，反应40min；
(5)步骤(4)反应结束后，继续向羧基功能化的孔板中加入30μL步骤(2) 得到的包含C-Ag+-C的未杂交HPs溶液，反应4h；
(6)步骤(5)反应结束后，继续向羧基功能化的孔板中加入30μL转录因子NF-kB1溶液，反应1h，即可得到基于硫化银光热效应的生物传感器。
进一步地，所述DNA S1溶液、DNA S2溶液、HP1溶液、HP2溶液、Trigger 溶液是通过分别将DNA S1、DNA S2、HP1、HP2、Trigger溶解在PH＝7.4的10mM Tris-HCl缓冲溶液中得到的浓度均分别为100μM、100μM、100μM、100μM、3μM 的溶液；所述转录因子NF-kB1溶液的浓度为10～1000nM。
进一步地，步骤(1)中，稀释所用的溶液为PH＝7.4的10mM Tris-HCl缓冲溶液。
进一步地，步骤(2)中，稀释所用的溶液为PH＝7.4的TFs缓冲溶液；所述TFs缓冲溶液的成分为：10mM Tris-Hcl，50mM NaCl，1mM MgCl2，1mM二硫苏糖醇，10％甘油。
进一步地，所用808nm红外激光照射时的强度为2W/cm2。
进一步地，所述羧基功能化的孔板的制备方法包括以下步骤：
(a)向孔板的孔中加入含有邻苯二甲酸酐的二氯甲烷和硝基苯的混合溶液以及氯化铝溶液，避光反应9～11h后，洗涤、干燥至恒重；
(b)将NHS溶液和EDC溶液等体积混合后，滴加到步骤(a)处理之后的孔中，反应0.8～1.2h后，以Tris-HCl缓冲溶液冲洗，即可得到羧基功能化的孔板。
进一步地，步骤(a)中，所述二氯甲烷和硝基苯的体积之比为7:3～9:1；邻苯二甲酸酐在二氯甲烷和硝基苯的混合溶液中的浓度为0.12～0.18mg/mL。
进一步地，步骤(b)中，所述NHS溶液和EDC溶液的摩尔浓度之比为1:3～5。
本发明还提供了根据上述制备方法制备得到的基于硫化银光热效应的生物传感器在定量检测NF-kB浓度中的应用。
本发明还提供了一种基于硫化银光热效应的生物传感器定量检测NF-kB浓度的方法，所述方法包括以下步骤：
A、多次重复上述步骤(1)～步骤(5)，得到多组步骤(5)反应之后的反应液；
B、分别向步骤(5)反应之后的反应液中加入不同浓度的NF-kB1溶液，反应1h；
C、步骤B反应结束后，移取羧基功能化的孔板中的反应液加入到含有硫化锌的普通孔板中，用808nm红外激光照射，并用温度计记录激光照射之前和激光照射5min后的温度，并分别计算激光照射前后的温度升高值△T；
D、以NF-kB1溶液的浓度CNF-kB对数为横坐标，激光照射前后的温度升高值△T为纵坐标构建线性曲线，进而得出线性方程，根据线性方程即可得到任意温度升高值△T下所对应的待测NF-kB1的浓度。
步骤C中，如果不将反应液移出羧基功能化的孔板与硫化锌反应而直接将硫化锌加入至反应液中，由于硫离子和银离子的结合比较强，硫离子会进一步夺取NF-KB1与DNA双链结合后未释放完全的C-Ag+-C中的银离子，进一步产生光热效应，但是这样导致的结果是这种光热效应无法建立起与NF-kB1浓度的对应关系，进而无法实现对于NF-kB1浓度的定量检测。
进一步地，步骤B中，所述NF-kB1溶液的浓度分别为成1000nM、500nM、 200nM、100nM、50nM、20nM、10nM。
进一步地，所述线性方程为：△T＝3.900LogCNF-kB-3.275，其线性相关系数为0.99226。
本发明通过氨基和羧基缩合反应将末端修饰氨基且含有NF-kB1结合位点、部分配对的DNA双链修饰在羧基功能的孔板中，并且与一条引发链(Trigger) 通过胡斯坦碱基配对构成DNA三链结构，并且加入少量银离子强化这种结构稳定性。再加入大量富胞嘧啶(C)的首尾部分配对的两条发夹DNA(HP1，HP2)，在引发链作用下诱导HP1和HP2发生杂交链式反应(HCR)，并加入银离子在富C部分构成C-Ag+-C超夹心结构。当加入转录因子NF-kB1后，NF-KB1会与 DNA双链结合，释放出杂交链上的大量Ag+。将反应液转移至含有少量ZnS的微量容器中，Ag+与ZnS反应置换出的Ag2S在808nm近红外激光的照射下会产生明显的光热效应，且随着NF-kB1的浓度的增加，光热效应越强。进而利用这种现象使用简单的温度计即可实现对于NF-kB1浓度的定量检测，该检测方法的灵敏度高，且操作方便。
附图说明
图1为基于硫化银光热效应的生物传感器定量检测蛋白质转录因子NF-kB 浓度的方法示意图；
图2为纯水(a)、ZnS水溶液(b)、250μM AgNO3水溶液和ZnS反应后的反应液(c)、实施例1中的反应液与ZnS反应后的溶液(d)的红外激光照射时间与温度升高值△T之间的点阵曲线图；
图3为以NF-kB1溶液的浓度为横坐标，△T为纵坐标构建的点阵曲线图；
图4为以NF-kB1溶液的浓度对数为横坐标，△T为纵坐标构建的线性关系图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种基于硫化银光热效应的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)将等体积浓度均为100μM的DNA S1溶液和DNA S2溶液混合，并使用PH＝7.4的10mM Tris-HCl缓冲溶液稀释至DNA S1的浓度为1μM，95℃加热反应5min后得到双链dsDNA溶液；
(2)将浓度均为100μM的HP1、HP2分别在95℃下加热5分钟，冷却至室温后，将等体积的HP1溶液、HP2溶液混合，并使用PH＝7.4的TFs缓冲溶液稀释得到未杂交的HPs溶液，未杂交的HPs溶液中的HP1的浓度为50μM；向未杂交的HPs溶液中加入等体积的450μM的硝酸银溶液，摇晃30s并于黑暗中反应1h后得到包含C-Ag+-C的未杂交HPs溶液；
(3)向羧基功能化的孔板中加入30μL双链dsDNA溶液，室温下反应24h 后回收双链dsDNA溶液；
(4)将Trigger稀释至3μM，在95℃下加热5分钟，冷却至室温，继续向步骤(3)中的羧基功能化的孔板中加入10μL Trigger溶液和10μL 8μM的硝酸银溶液，室温下反应40min；
(5)步骤(4)反应结束后，继续向步骤(4)中的羧基功能化的孔板中加入30μL步骤(2)得到的包含C-Ag+-C的未杂交HPs溶液，室温下反应4h；
(6)步骤(5)反应结束后，继续向羧基功能化的孔板中加入30μL浓度为 1000nM的转录因子NF-kB1溶液，室温下反应1h，即可得到基于硫化银光热效应的生物传感器。
反应结束后，取50μL反应液于加入到含有50μg硫化锌的普通孔板的孔中，在照射强度为2W/cm2的808nm红外激光照射下，用温度计测量开始至5min后的温度，并构建红外激光照射时间与温度升高值△T之间的点阵曲线图，如图2 中的曲线d所示，从图中可见，随着照射时间的延长，反应液的温度逐渐升高，并在5min左右达到平衡。
为了验证这一现象的原理，分别进行了以下实验：
分别测试了纯水、ZnS水溶液、250μM AgNO3水溶液和ZnS反应后的反应液，在照射强度为2W/cm2的808nm红外激光照射下，用温度计分别测量三者自测量开始至5min后的温度，并构建红外激光照射时间与温度升高值△T之间的变化点阵曲线，如图2中的曲线a、b、c所示，从图中可以看出，单独的纯水、 ZnS水溶液并不存在光热效应，只有在Ag+和ZnS反应生成Ag2S之后，才具有光热效应，且这种光热效应在激光照射5min左右趋于稳定。
说明，本实施例构建的生物传感器，在加入转录因子NF-kB1后，NF-KB1 会与DNA双链结合，释放出杂交链上的大量Ag+，将反应液转移至含有少量ZnS 的孔中之后，Ag+与ZnS反应置换出的Ag2S在808nm近红外激光的照射下产生了明显的光热效应。
实施例2
一种基于硫化银光热效应的生物传感器定量检测NF-kB1浓度的方法，其检测示意图如图1所示，包括以下步骤：
A、多次重复实施例1中的步骤(1)～步骤(5)，得到多组步骤(5)反应之后的反应液；
B、分别向步骤(5)反应之后的反应液中加入浓度为1000nM、500nM、 200nM、100nM、50nM、20nM、10nM的NF-kB1溶液，室温下反应1h；
C、步骤B反应结束后，移取羧基功能化的孔板中的反应液50μL加入到含有50μg硫化锌的普通孔板中，用照射强度为2W/cm2的808nm红外激光照射，并用温度计记录激光照射之前和激光照射5min后的温度，并分别计算激光照射前后的温度升高值△T，△T为减去了ZnS分散在水中在同样条件下的温度升高值；并以NF-kB1溶液的浓度为横坐标，△T为纵坐标构建点阵曲线图，如图3 所示。
D、以NF-kB1溶液的浓度CNF-kB对数为横坐标，激光照射前后的温度升高值△T为纵坐标构建线性曲线，如图4所示，进而得出线性方程△T＝3.900LogCNF-kB-3.275，其线性相关系数为0.99226，根据线性方程即可得到任意温度升高值△T下所对应的待测NF-kB1的浓度。
上述参照实施例对基于硫化银光热效应的生物传感器及其制备方法和应用以及NF-kB1的定量检测方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽师范大学
<120> 一种基于硫化银光热效应的生物传感器及其制备方法和应用以及NF-kB1的定
量检测方法
<130> 1
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> DNA S1
<400> 1
3’-NH-(CH2)6-ggaggacctt tcagggtg-5’ 18
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> DNA S2
<400> 2
3’-caccctgaaa ggtc-5’ 14
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> Trigger
<400> 3
3’-ggcacttacc agggggttag tgggtctttc cag-5’ 33
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> HP1
<400> 4
3’-cccccccccc cccccccctg gtaagtgcca gagaggcact tacca-5’ 45
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> HP2
<400> 5
3’-ggcacttacc aagagatggt aagtgcc-5’ 27
Claims (10)
1.一种基于硫化银光热效应的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）将等体积等摩尔浓度的DNA S1溶液和DNA S2溶液混合并稀释，加热反应后得到双链dsDNA溶液；
（2）将等体积等摩尔浓度的HP1溶液、HP2溶液混合并稀释得到未杂交的HPs溶液，向未杂交的HPs溶液中加入等体积的硝酸银溶液，于黑暗中反应后得到包含C-Ag+-C的未杂交HPs溶液；
所述HP1、HP2的基因序列分别如下：
HP1:3’-CCCCCCCCCCCCCCCCCCTGGTAAGTGCCAGAGAGGCACTTACCA-5’；
HP2:3’-GGCACTTACCAAGAGATGGTAAGTGCC-5’；
（3）向羧基功能化的孔板中加入双链dsDNA溶液，反应后回收双链dsDNA溶液；
（4）继续向羧基功能化的孔板中加入Trigger溶液和硝酸银溶液；
（5）步骤（4）反应结束后，继续向羧基功能化的孔板中加入步骤（2）得到的包含C-Ag+-C的未杂交HPs溶液；
（6）步骤（5）反应结束后，继续向羧基功能化的孔板中加入转录因子NF-kB1溶液，即可得到基于硫化银光热效应的生物传感器。
2.根据权利要求1所述的基于硫化银光热效应的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述DNA S1、DNA S2、Trigger的基因序列分别如下：
DNA S1:3’-NH-(CH2)6-GGAGGACCTTTCAGGGTG-5’；
DNA S2:3’-CACCCTGAAAGGTC-5’；
Trigger:3’-GGCACTTACCAGGGGGTTAGTGGGTCTTTCCAG-5’。
3.根据权利要求1所述的基于硫化银光热效应的生物传感器的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）将等体积等摩尔浓度的DNA S1溶液和DNA S2溶液混合并稀释至DNA S1的浓度为1μM，95℃加热反应5min后得到双链dsDNA溶液；
（2）将等体积等摩尔浓度的HP1溶液、HP2溶液混合并稀释得到未杂交的HPs溶液，未杂交的HPs溶液中的HP1的浓度为50μM；向未杂交的HPs溶液中加入等体积的450μM的硝酸银溶液，于黑暗中反应1h后得到包含C-Ag+-C的未杂交HPs溶液；
（3）向羧基功能化的孔板中加入30μL双链dsDNA溶液，反应24h后回收双链dsDNA溶液；
（4）继续向羧基功能化的孔板中加入10μL Trigger溶液和10μL 8μM的硝酸银溶液，反应40min；
（5）步骤（4）反应结束后，继续向羧基功能化的孔板中加入30μL步骤（2）得到的包含C-Ag+-C的未杂交HPs溶液，反应4h；
（6）步骤（5）反应结束后，继续向羧基功能化的孔板中加入30μL转录因子NF-kB1溶液，反应1h，即可得到基于硫化银光热效应的生物传感器。
4.根据权利要求1或3所述的基于硫化银光热效应的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述DNA S1溶液、DNA S2溶液、HP1溶液、HP2溶液、Trigger溶液是通过分别将DNA S1、DNA S2、HP1、HP2、Trigger溶解在PH=7.4的10mM Tris-HCl缓冲溶液中得到的浓度分别为100μM、100μM、100μM、100μM、3μM的溶液；所述转录因子NF-kB1溶液的浓度为10~1000nM。
5.根据权利要求1或3所述的基于硫化银光热效应的生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，稀释所用的溶液为PH=7.4的10mM Tris-HCl缓冲溶液。
6.根据权利要求1或3所述的基于硫化银光热效应的生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，稀释所用的溶液为PH=7.4的TFs缓冲溶液。
7.根据权利要求1或3所述的基于硫化银光热效应的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述羧基功能化的孔板的制备方法包括以下步骤：
（a）向孔板的孔中加入含有邻苯二甲酸酐的二氯甲烷和硝基苯的混合溶液以及氯化铝溶液，避光反应9~11h后，洗涤、干燥至恒重；
（b）将NHS溶液和EDC溶液等体积混合后，滴加到步骤（a）处理之后的孔中，反应0.8~1.2h后，以Tris-HCl缓冲溶液冲洗，即可得到羧基功能化的孔板。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的制备方法制备得到的基于硫化银光热效应的生物传感器在定量检测NF-kB1浓度中的应用。
9.利用权利要求1-7任意一项所述的制备方法制备得到的基于硫化银光热效应的生物传感器定量检测NF-kB1浓度的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
A、多次重复步骤（1）~步骤（5），得到多组步骤（5）反应之后的反应液；
B、分别向步骤（5）反应之后的反应液中加入不同浓度的NF-kB11溶液，反应1h；
C、步骤B反应结束后，移取羧基功能化的孔板中的反应液加入到含有硫化锌的普通孔板中，用808nm红外激光照射，并用温度计记录激光照射之前和激光照射5min后的温度，并分别计算激光照射前后的温度升高值△T；
D、以NF-kB11溶液的浓度CNF-kB1对数为横坐标，激光照射前后的温度升高值△T为纵坐标构建线性曲线，进而得出线性方程，根据线性方程即可得到任意温度升高值△T下所对应的待测NF-kB11的浓度。
10.根据权利要求9所述的基于硫化银光热效应的生物传感器定量检测NF-kB1浓度的方法，其特征在于，所述线性方程为：△T=3.900LogCNF-kB1-3.275,其线性相关系数为0.99226。
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