CN108918477A - 一种近红外Ag2S纳米组装体探针及其制备和应用 - Google Patents

一种近红外Ag2S纳米组装体探针及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出一种近红外Ag2S纳米组装体探针，其包括多个基于HCR反应组装的单体M1和单体M2；所述单体M1由DNA‑Ag2S纳米点和如SEQ ID NO.2所示的核酸序列H1组装而成；其中，所述DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述单体M2由如SEQ ID NO.3所示的适配体和如SEQ ID NO.4所示的核酸序列H2组装而成。本发明还提供了近红外Ag2S纳米组装体探针的制备方法，其具有原料易得、条件温和、常温反应无需加热、产品质量稳定等特点。本发明还提出所述近红外Ag2S纳米组装体探针用于检测循环肿瘤细胞的方法及应用。本发明应用于检测循环肿瘤细胞，具有高特异性识别能力及高灵敏度，可用于全血中靶细胞的进一步分析。本发明在癌症临床诊断、术后预防和治疗等方面具有广泛应用前景。

Description

一种近红外Ag2S纳米组装体探针及其制备和应用
技术领域
本发明属于生物分析领域，具体涉及了一种近红外Ag2S纳米组装体探针及其制备方法以及在检测循环肿瘤细胞中的应用。
背景技术
循环肿瘤细胞(Circulatingtumorcells，CTCs)是存在于外周血中肿瘤细胞的统称，其在血液中的表达水平与癌症患者的预后和生存息息相关。CTCs的检测对于转移灶早期的诊断，癌症预后，治疗监测和转移诊断具有重要意义。但是CTCs的检测和分析并不容易，因为CTCs与其他血细胞之间没有明确的区别。此外，外周血中的CTCs数量很少，通常在109个白细胞中只有一个。因此，从全血中高度有效分离及检测CTCs是一个挑战性的课题。
目前已有许多的技术方法用于CTCs的富集和检测。例如，依赖于癌细胞和正常细胞之间大小差异的微流控技术，这种技术虽然会增加癌症患者中CTCs回收的效率。然而，其是通过微阵列和微过滤器来实现的，技术的复杂性和破坏性释放限制了其应用。最近，还有一些利用不同信号传导模式的分析方法被用来分析CTCs，包括电感耦合等离子体质谱法，拉曼成像法，比色法，荧光法等。其中具备响应快，灵敏度高，无破坏性和实时监测的荧光检测方法引起了人们的极大关注。目前研究中，许多有机荧光染料和荧光纳米材料(CdSe/ZnSQDs，CdTe/CdS QDs和AuNCs)具有可见光发射(<650nm)，已被用于检测CTCs。众所周知，可见光在复杂基质中会引起背景信号以及散射光干扰，而近红外荧光(NIR)发射的材料在生物分析领域具有较高的穿透深度和低的散射。Wang课题组设计合成了NIR荧光钕标记物用于CTCs的定量分析，但是该探针涉及到复杂的有机合成。总之，使用NIR探针用于全血中CTCs的高效捕获和检测体系还比较少。因此，开发NIR荧光探针用于高灵敏捕获和检测CTCs仍然是高度需求的和具有挑战性的。
发明内容
本发明提出了一种基于杂交链式反应(HCR)核酸放大技术(杂交链式反应技术，Hybridizationchainreaction，HCR)组装的近红外Ag2S纳米组装体(纳米点)，作为探针应用于灵敏分析CTCs。本发明具有稳定、灵敏度高以及选择性好等优点，有利于实现癌症的早期诊断。
本发明提出了一种近红外Ag2S纳米组装体探针，其包括基于HCR反应组装的单体M1和单体M2；所述单体M1包含DNA-Ag2S纳米点和如SEQ ID NO.2所示的核酸序列H1，其中，所述DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述单体M2包含如SEQ ID NO.3所示的适配体和如SEQID NO.4所示的核酸序列H2。
其中，所述近红外Ag2S纳米组装体探针含有多个适配体及多个Ag2S纳米点。一个近红外Ag2S纳米组装体探针包括基于HCR反应组装的多个单体M1和多个单体M2。单体M1由一个DNA-Ag2S纳米点和如SEQ ID NO.2所示的发夹结构核酸序列H1组装而成，其中，所述DNA序列如SEQ ID NO.1所示。单体M2由如SEQ ID NO.3所示的适配体和如SEQ ID NO.4所示的核酸序列H2组装而成。
本发明中，所述DNA是指硫代磷酸化的DNA序列SEQ ID NO.1。
本发明中，所述适配体是指含有与MUC1黏蛋白适配体序列的SEQ ID NO.3。
本发明中，所述H1是指能与硫代磷酸化的DNA序列SEQ ID NO.1部分杂交的发夹结构序列SEQ ID NO.2。
本发明中，所述H2是指能与含有与MUC1黏蛋白适配体序列的SEQ ID NO.3部分杂交的发夹结构序列SEQ ID NO.4。
其中，所述DNA-Ag2S纳米点为球形纳米点，其平均粒径为2.45-4.85nm。优选地，平均粒径为3.51nm。
本发明还提出了所述近红外Ag2S纳米组装体探针的制备方法，所述方法包括如下步骤：
1)将所述DNA-Ag2S纳米点和核酸序列H1组装成单体M1；将所述适配体和核酸序列H2组装成单体M2；
2)在引发剂的作用下，所述单体M1和M2进行HCR循环放大扩增反应，得到所述近红外Ag2S纳米组装体探针。
其中，所述DNA-Ag2S纳米点是通过在Ag2S纳米点合成过程中加入硫代磷酸化DNA一步法合成的平均粒径为2.45-4.85nm的球形纳米点。优选地，所述DNA-Ag2S纳米点的平均粒径为3.51nm。
一具体实施方案中，所述步骤1)中，DNA-Ag2S纳米点的合成步骤包括：将5mM的AgNO3和25mM的3-MPA溶解于30mL除氧的去离子水中，在pH＝7.5的条件下，90℃下搅拌反应搅拌12h以制备Ag2S纳米点。在此基础上，通过一步法成功合成了DNA-Ag2S纳米点，将硫代硫酸盐DNA加入100μM到400μL的量子点反应前驱体溶液中，并在相同条件下反应以获得DNA功能化的Ag2S。然后使用截留分子量为3000Da的超滤管洗涤获得的DNA-Ag2S纳米点并在4℃下储存。
所述步骤1)中，进一步地，将前述制备得到的纯化后的DNA-Ag2S纳米点和其他的DNA序列(H1、适配体、H2、引发剂即诱发链)放置入离心管，在12000rpm下离心1分钟，将粘贴在离心管壁上的物料离心至管底，以备使用。然后，将H1、适配体、H2和诱发链序列以紫外分光光度计进行定量，接着将其在95℃加热5min，在冰上孵育5min，室温2h依次进行退火处理。接着，用DNA-Ag2S和适配体分别通过突出端与发夹结构的H1和H2杂交，在含有10mMNa2HPO4和0.1M NaCl的缓冲液中分别形成DNA-Ag2S-H1和适配体-H2。
所述步骤2)中，所述引发剂是指能与H1茎部杂交的序列。优选地，所述引发剂的序列如SEQ ID NO.5所示。
所述步骤2)中，所述引发剂打开单体M1的茎部杂交部分，引发打开的M1再进一步打开单体M2的茎部，使HCR循环反应不断地进行，直到引发剂(即诱发链)消耗完全为止。
其中，所述DNA-Ag2S纳米点中的DNA序列在5’端进行硫代磷酸化修饰。
其中，所述DNA-Ag2S纳米点中的DNA序列在3’端的部分与所述核酸序列H1发夹结构的茎的部分进行杂交。
其中，所述适配体的5’端部分与所述核酸序列H2发夹结构的茎的部分进行杂交。
在一具体实施方案中，所述步骤2)中，所述HCR循环放大扩增反应是将前述制备得到的DNA-Ag2S-H1(5μM)和适配体(Aptamer)-H2(5μM)的溶液，加入诱发链(终浓度：0.5μM，2.5μM，4.5μM)以分别得到短(Short)-Ag2S组装体，中(Middle)-Ag2S组装体，长(Long)-Ag2S组装体，以引发杂交链式循环反应，将溶液在室温下孵育24h，即形成所述近红外Ag2S组装体探针。
本发明中，基于DNA-Ag2S纳米点参与的杂交链式反应放大技术组装获得所述近红外Ag2S纳米点探针的方法，其步骤如下：首先将DNA-Ag2S纳米点和发夹结构核酸序列H1组装成单体M1，并将含有粘蛋白MUC1的适配体和H2的核酸序列组装成单体M2；然后将单体M1和M2在诱发链的作用下进行HCR循环放大扩增反应；基于核酸信号的扩增得到适配体修饰的Ag2S纳米点探针，即本发明近红外Ag2S组装体探针。
其中，所述DNA-Ag2S纳米点中的DNA序列在5’端进行硫代磷酸化修饰用于一步法合成DNA-Ag2S纳米点，3’端的部分与发夹结构H1茎的部分进行杂交得到单体M1，蛋白MUC1的适配体的5’端部分与发夹结构H2茎的部分进行杂交得到单体M2。然后诱发链打开单体M1的茎部杂交部分，引发打开的M1再打开单体M2的茎部，因此，循环反应不断地进行，可获得含有多个适配体及多个Ag2S纳米点的Ag2S组装体。
本发明还提出了一种所述近红外Ag2S纳米纳米组装体探针在制备检测循环肿瘤细胞的试剂和/或体外诊断产品中的应用。
本发明还提出了基于所述近红外Ag2S纳米组装体探针和抗体修饰的磁纳米颗粒在检测循环肿瘤细胞中的应用。
本发明应用中，先将所述近红外Ag2S纳米组装体探针与肿瘤细胞孵育，然后，将其与抗体修饰的磁纳米颗粒Fe3O4-EpCAM孵育，得到基于所述Ag2S组装体和抗体修饰的磁纳米颗粒，应用于循环肿瘤细胞的检测中。
本发明中，所述肿瘤细胞包括乳腺癌细胞、舌鳞癌细胞、肝癌细胞等。优选地，所述肿瘤细胞包括人乳腺癌细胞(MCF-7)、人舌鳞癌细胞(CAL-27)、人肝癌细胞(HepG2)等。优选地，所述肿瘤细胞包括人乳腺癌细胞(MCF-7)。
本发明还提出了一种利用所述近红外Ag2S纳米组装体探针检测循环肿瘤细胞的方法。
本发明方法中，将所述近红外Ag2S纳米组装体探针与肿瘤细胞孵育，然后，将其与抗体修饰的磁纳米颗粒Fe3O4-EpCAM孵育，得到基于所述Ag2S组装体和抗体修饰的磁纳米颗粒，用于循环肿瘤细胞的检测。
本发明中，所述磁纳米颗粒Fe3O4-EpCAM是指抗体蛋白上皮细胞粘附分子与磁纳米颗粒Fe3O4通过偶联反应后组装的复合体。
本发明还提出了一种体外诊断产品，所述体外诊断产品包括如上所述的近红外Ag2S纳米组装体探针。
本发明还提出了一种基于近红外Ag2S纳米组装体探针来检测肿瘤细胞/癌细胞的高灵敏成像方法。具体地，在含有10％的胎牛血清和1％青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基中的培养人乳腺癌细胞(MCF-7)，将在实验过程中得到的不同形式的近红外Ag2S纳米组装体(即通过改变诱发链浓度而得到的不同长度的近红外Ag2S纳米组装体)与生长良好的MCF-7进行孵育，然后利用共聚焦显微镜对其进行成像分析。
本发明还提供一种所述基于近红外Ag2S组装体纳米探针和抗体修饰的磁纳米颗粒在检测循环肿瘤细胞中的应用及检测方法。本发明将所述基于Ag2S纳米组装体和抗体修饰的磁纳米颗粒用于全血中癌细胞的捕获及成像。具体地，Ag2S组装体染色MCF-7细胞12h后消化分散于PBS中，然后分别加入PBS中的Hela细胞悬液(103细胞/mL)和全血中的Hela细胞悬液(浓度约为10,50,100,500和1000个细胞/mL)。接着在上述样品中加入一定量的抗体修饰的磁纳米颗粒(Fe3O4-EpCAM)，37℃下温和振荡孵育后进行磁分离清洗。最后，采用荧光显微镜对捕获的细胞进行成像和计数以计算捕获效率。在此，以Ag2S组装体预先染色的Hela细胞与Fe3O4-EpCAM孵育的细胞用作阴性对照。同时根据制造商的说明首先用红细胞裂解缓冲液处理健康人全血。将细胞捕获实验作为纯癌细胞捕获的条件进行操作，对分离的MCF-7细胞进行成像并计数以定量回收率。为了定量纯度，用4％多聚甲醛固定Fe3O4-EpCAM上标记的Ag2S n组装体细胞10min，并用15μg/mL DAPI和FITC标记的CD45单克隆抗体染色40分钟。其中MCF-7细胞被鉴定为DAPI+/Ag2S组装体+/CD45-，而WBC是DAPI+/Ag2S组装体-/CD45+。
本发明应用及方法中，所述肿瘤细胞包括但不限于乳腺癌细胞、舌鳞癌细胞、肝癌细胞等。优选地，所述肿瘤细胞包括人乳腺癌细胞(MCF-7)、人舌鳞癌细胞(CAL-27)、人肝癌细胞(HepG2)等。优选地，所述肿瘤细胞包括人乳腺癌细胞(MCF-7)。
本发明有益效果包括：本发明近红外Ag2S纳米组装体探针的制备方法，其具有原料易得、条件温和、常温反应无需加热、产品质量稳定等优点。通过HCR循环放大成功制备近红外Ag2S组装体，以提高纳米材料的成像灵敏度，并结合磁分离技术实现血样中CTCs的有效分离和鉴定。本发明实验结果表明，纳米材料通过DNA信号放大反应的组装，不仅可以提高纳米材料的成像靶向性，还可以提高成像的灵敏度。即使在模拟的1mL临床样品中只有10个靶细胞时，本发明检测模型及方法也能检测到6个癌细胞，本发明具有极高的捕获效率。
本发明中，所述探针适用于所有类型的肿瘤细胞。包含MUC1粘蛋白序列的适配体序列，对于探针应用的普适性起着决定性作用。由于MUC1粘蛋白在肿瘤组织中的异常表达，因此，MUC1粘蛋白可作为肿瘤生物学标志物，
本发明检测方法及应用中，适配体序列起靶向作用，探针中的一个或多个适配体提高靶向性(特异性)。灵敏度提高是在于，通过DNA得到了DNA-Ag2S，然后在H1、H2、适配体和诱发链的作用下形成所述近红外Ag2S纳米组装体从而提高了灵敏度。本发明对CTCs的检测和分离具有高度特异性和灵敏度，对于癌症的临床诊断和手术后的预防和治疗具有重要意义。本发明不仅为提高纳米材料的成像灵敏度提供了可行的方法，也为CTCs检测应用提供了依据。本发明中结合了杂交链式反应技术(Hybridization chain reaction，HCR)，鉴于HCR可得到多枝接的信号分子，放大核苷酸信号，提高CTCs分析灵敏度，且HCR具有简单、成本低、无酶信号放大等特点。
附图说明
图1(A)表示DNA-Ag2S和适配体与H1和H2分别杂交成单体M1和M2，并通过杂交链式循环反应在引发剂的作用下获得本发明近红外Ag2S组装体的原理示意图。
图1(B)表示将本发明近红外Ag2S组装体和抗Fe3O4-EpCAM结合构建用于分离和检测CTCs的原理示意图。
图2(A)表示Ag2S纳米点(实线)和DNA-Ag2S(虚线)的吸收和荧光光谱图。
图2(B)表示DNA-Ag2S的透射电镜图像。
图2(C)表示DNA-Ag2S的透射电镜图相对应的粒径统计图。
图2(D)表示本发明近红外Ag2S组装体的凝胶电泳表征，其中，a：DNA-Ag2S，b：DNA-Ag2S+H1，c：适配体+H2，d：适配体，e：DNA-Ag2S+H1+适配体+H2和f：DNA-Ag2S+H1+适配体+H2+引发剂/诱发链。
图2(E)表示本发明近红外Ag2S组装体的原子力显微镜图像。
图3(A)表示通过共聚焦显微镜观察MCF-7细胞的荧光成像(左图)，具有不同浓度(25,50,100μg/ml)的Ag2S纳米点。比例尺＝50μm。
图3(B)表示DNA-Ag2S和近红外Ag2S组装体探针的平均荧光强度统计(右图)。
图4(A)表示用不同诱发链浓度制备的DNA-Ag2S的聚丙烯酰氨凝胶电泳表征。
图4(B)表示不同长度的DNA-Ag2S的水合粒径统计图。
图4(C)表示具有不同聚合物长度DNA-Ag2S在MCF-7细胞中的成像图(标尺＝50μm)。
图4(D)表示不同聚合物长度DNA-Ag2S在MCF-7细胞中的成像图的平均荧光强度统计图。
图5(A)表示Ag2S组装体和ICG作为探针在MCF-7细胞中不同时间的细胞的荧光成像图(488nm激发下)。比例尺＝20μm。
图5(B)表示不同时间的相应荧光强度统计图。
图6(A)表示Fe3O4纳米粒子的透射电镜图像(标尺＝200nm)。
图6(B)表示Fe3O4纳米粒子的透射电镜图得粒径统计图。
图6(C)表示在15s，30s，45s，60s时间点放置磁铁之前和之后的Fe3O4胶体的照片。
图6(D)表示Fe3O4纳米颗粒的磁滞曲线表征。
图6(E)表示EpCAM修饰前后磁性纳米粒子的紫外吸收图谱。
图6(F)、(G)分别表示Fe3O4纳米颗粒修饰抗体EpCAM之前和之后的Zeta电位和水合颗粒大小。
图7表示本发明近红外Ag2S组装体与抗体EpCAM功能化Fe3O4对Hela和MCF-7的特异性识别的比较；其中，(A)表示Ag2S组装体对1000个Hela细胞中不同数目的MCF-7细胞标记后的平均荧光强度统计图；(B)表示Ag2S组装体与Fe3O4-EpCAM对1000个MCF-7中不同数目的Hela细胞标记后的平均荧光强度统计图；(C)表示Ag2S组装体对MCF-7和Hela细胞识别及Fe3O4-EpCAM分离后的流式细胞图。
图8表示本发明近红外Ag2S组装体和Fe3O4-EpCAM对MCF-7在PBS和全血中的捕获效率比较。
图9表示从模拟临床血液样品中捕获并鉴定循环肿瘤细胞的共聚焦显微镜图像。核(DAPI)：蓝色；Ag2S组装体：红色；CD45-FITC：绿色(标尺＝20μm)。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
实施例1：DNA-Ag2S以及Ag2S组装体的制备
DNA-Ag2S的制备：
根据我们以前的方法，即将5mM的AgNO3和25mM的3-MPA溶解于30mL除氧的去离子水中，在pH＝7.5的条件下，90℃下搅拌反应搅拌12h以制备Ag2S。在此基础上，我们通过一步法成功合成了DNA-Ag2S。
简言之，将100μM硫代硫酸盐的DNA加入到400μL的量子点反应前驱体溶液中，并在90℃条件下，搅拌反应12h，以获得DNA功能化的Ag2S。然后使用截留分子量为3000Da的超滤管洗涤获得的DNA-Ag2S并在4℃下储存。
近红外Ag2S纳米组装体探针的制备：
用于分离和检测CTC的Ag2S组装体和Fe3O4-EpCAM的组装，将DNA-Ag2S和适配体与H1和H2杂交，以获得引发剂作用下的HCR得到近红外Ag2S组装体探针，其原理示意如图1(A)所示。
首先，将前述制备得到的纯化后的DNA-Ag2S和其他的DNA序列(H1，适配体(Aptamer)，H2，引发剂Initiator)在12000rpm下离心1分钟，以将粘贴在离心管壁的物料离心到管底以供使用。
然后，将H1，适配体，H2和诱发链序列以紫外分光光度计进行定量，接着将其在95℃加热5min，在冰上孵育5min，室温2h依次进行退火处理。接着，用DNA-Ag2S和适配体分别通过突出端与发夹结构的H1和H2杂交，在含有10mM Na2HPO4和0.1MNaCl的缓冲液中分别形成DNA-Ag2S-H1和适配体Aptamer-H2。
随后，将前述制备得到的DNA-Ag2S-H1(5μM)和Aptamer-H2(5μM)的溶液，加入诱发链(终浓度：0.5μM，2.5μM，4.5μM)以分别得到Short-Ag2S组装体，Middle-Ag2S组装体，Long-Ag2S组装体。以引发杂交链式循环反应，将溶液在室温下孵育24h以形成所述近红外Ag2S组装体探针。
如图2(A)所示，用紫外-可见分光光度计表征了DNA组装的Ag2S，其在260nm处具有明显的DNA吸收峰，与之前合成的近红外Ag2S组装体探针的紫外-可见分光光度计表征的数据可知，Ag2S纳米点没有明显的吸收峰，这证明DNA-Ag2S的成功组装。此外，用DNA修饰Ag2S并没有改变其荧光性质，其最大发射峰的位置仍然在795nm，如图2(A)虚线所示。通过透射电子显微镜进一步表征了其粒径，得到其平均粒径为3.51nm，且具有良好的分散性，如图2(B)和(C)所示。
进一步使用聚丙烯酰胺凝胶电泳来表征Ag2S组装体的组装过程。如图2(D)所示，从左至右的六条带分别代表DNA-Ag2S，DNA-Ag2S+H1，适配体+H2，适配体，DNA-Ag2S+H1+适配体+H2和DNA-Ag2S+H1+适配体+H2+引发剂/诱发链。第二条带比第一条带迁移速率慢，第三条带比第四条带迁移速率慢，证实DNA-Ag2S和H1杂交形成具有双链DNA结构的单体M1，而适配体和H2杂交形成具有双链DNA结构的单体M2。并且，通过比较第五和第六条带可以看出诱发链，M1和M2通过杂交链扩增反应形成长链聚合物Ag2S组装体。同时图2(E)的AFM图也成功表征了Ag2S组装体的成功组装。
实施例2：Ag2S组装体的成像灵敏度和稳定性考察：
在含有10％的胎牛血清和1％青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基中的培养人乳腺癌细胞(MCF-7)，将在实验过程中得到的不同形式的近红外Ag2S组装体探针与生长良好的MCF-7进行孵育，然后利用共聚焦显微镜对其进行成像分析。
如图3(A)、(B)所示，在得到成像的图后，并对它们成像后强度的数据分析结果中，近红外Ag2S组装体探针的成像信号明显高于相同浓度的DNA-Ag2S(大约2.4倍)，而DNA-Ag2S的成像信号也高于Ag2S，这表明适配体修饰和组装的近红外Ag2S组装体探针可显着提高成像的灵敏度。
本发明通过调整HCR反应中诱发链的浓度来制备了不同长度大小的近红外Ag2S组装体探针，并对比了其成像灵敏度。如图4(A)所示，与单体DNA-Ag2S相比，加入不同浓度的引发剂，通过HCR反应可以形成的不同链长的近红外Ag2S组装体。从聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果可以看出，随着诱发链浓度的增加，所得复合物的迁移速度减慢，这间接证明了近红外Ag2S组装体的长度可以通过改变诱发链的浓度而改变。本发明通过其水合粒径的变化来证实了这一结果，如图4(B)所示。
本发明将得到的不同链长的所述近红外Ag2S组装体用于细胞成像实验。如图4(C)所示，可以观察到不同浓度的近红外Ag2S组装体在相同浓度的细胞中成像的效果，这种结果也与软件统计的荧光的强度结果变化一致，如图4(D)所示。上述结果表明，DNA修饰Ag2S可以提高细胞成像的灵敏度，并且通过调节HCR反应过程中引发链的浓度，可以获得不同链长的近红外Ag2S组装体探针。本发明不仅为提高实验灵敏度提供了机会，也为将来DNA组装设计提供了基础。
且，通过本发明方式得到的近红外Ag2S组装体探针具有良好的光稳定性，如图5(A)所示，近红外Ag2S组装体探针和荧光染料吲哚菁绿(ICG)同时孵育MCF-7细胞后，在共聚焦显微镜下用488nm的激光对其进行持续照射后，可以得到近红外Ag2S组装体的荧光还能保持96.35％，如图5(B)所示，而ICG的荧光只剩24.32％。
实施例3：Fe3O4磁性纳米粒子的制备及与抗体EpCAM的偶联
首先，将8.1g FeCl3·6H2O溶于142.5mL去离子水中后，转移到三颈瓶中，搅拌下加热至70℃。然后，称取4.4g FeCl2·4H2O溶于10mL去离子水中，过滤，取7.5mL加入三口瓶中。在剧烈搅拌下，快速加入18mL质量分数为25％的浓氨水，1min后，滴加4.66g油酸，并在70℃下快速继续搅拌1h。反应完成后得到深色溶胶，通过施加外部磁场将所得沉淀物从反应体系中分离出来。用乙醇洗涤两次以去除过量的油酸，用去离子水冲洗至pH＝7。然后加入160mL浓度为10mg/mL的KMnO4溶液，并用超声波清洗器超声处理8h。磁力分离后，用去离子水洗涤溶液三次，得到磁性流体。或者洗涤后真空冷冻干燥40h，得到表面改性羧基的磁性纳米粒子。使用酰胺化反应将抗体上的氨基与Fe3O4-COOH表面上的羧酸基团交联。
其具体过程为，在室温下，7.5mg的Fe3O4-COOH溶于1.5mL 0.01M pH＝6.8的PBS中，然后依次加入75mM EDC和75mM NHS并轻轻摇动30min。之后，通过磁性分离活化的Fe3O4-COOH，并用0.01M pH＝7.2的PBS洗涤三次。然后将它们重悬于1mL 0.01M pH＝7.2的PBS中，与75μg抗体EpCAM反应约4h，反应中在室温下保持连续摇动。最后用PBS洗涤得到的免疫磁性纳米粒子以除去多余的抗体，然后在0.01M pH＝7.2的PBS中于4℃下储存以供使用。
如图6所示，本发明成功地合成了粒径为36.12nm，饱和磁化强度为39.26emu/g的Fe3O4磁性纳米粒子，如图6(A)，(B)和(D)所示。通过观察Fe3O4胶体溶液在不同时间的磁性分离效果，进一步证明了Fe3O4纳米粒子具有自然磁性，并具有良好的磁响应速度，如图6(C)。
为了将得到的表面带有-COOH的Fe3O4纳米粒子用于CTCs的识别，本发明通过酰胺化反应将抗体EpCAM修饰在Fe3O4纳米粒子表面。如图6(E)所示，与反应前的Fe3O4纳米粒子相比，在磁力清洗后的Fe3O4-EpCAM纳米粒子的紫外可见吸收光谱图中，可以观察到257nm处蛋白质特征吸收峰，由此证明本发明成功地将抗体EpCAM修饰到了Fe3O4纳米粒子表面。如图6(F)所示，Fe3O4-COOH纳米粒子表面带负电荷，Zeta电位为-29.7mV，而Fe3O4-EpCAM纳米粒子的表面带正电荷，Zeta电位为41.1mV，这证明本发明成功将EpCAM修饰到Fe3O4纳米粒子的表面。
且，如图6(G)所示，Fe3O4-EpCAM纳米粒子的水合粒径稍大于Fe3O4-COOH，这可间接证明是Fe3O4纳米粒子表面上覆盖了EpCAM胶体层。且，本发明发现Fe3O4纳米粒子的水合粒径明显大于TEM所测得的粒径，根据文献报道，这是由于带电纳米粒子表面形成了胶体层。由此证明了EpCAM成功修饰到Fe3O4纳米粒子表面后。
实施例4：癌细胞捕获实验
MCF-7细胞加标样品制备如下：近红外Ag2S组装体探针染色MCF-7细胞12h后消化分散于PBS中，然后分别加入PBS中的Hela细胞悬液(103细胞/mL)和全血中的Hela细胞悬液(浓度约为10，50，100，500和1000个细胞/mL)。接着，在上述样品中加入0.4mg的Fe3O4-EpCAM，37℃下温和振荡孵育后进行磁分离清洗。然后，采用荧光显微镜对捕获的细胞进行成像和计数以计算捕获效率以及采用流式进一步分析特异性捕获性质。
近红外Ag2S组装体预先染色的Hela细胞与Fe3O4-EpCAM孵育的细胞用作阴性对照。用MCF-7和Hela细胞进行对照实验，来研究HCR-QDs和抗体EpCAM功能化的Fe3O4对CTCs的特异性识别。
实验结果表明，从图7A可见，1000个Hela细胞具有非常弱的背景荧光，在1000个Hela细胞中分别加入10，100和1000个MCF-7细胞后，所述Ag2S组装体标记的MCF-7细胞的荧光信号逐渐增强，这表明所述Ag2S组装体上的适配体可以特异性识别MCF-7表面过表达的MUC1蛋白。且，进一步研究了抗体EpCAM功能化的Fe3O4对CTCs的特异识别效应。如图7B所示，将不同数量的Hela细胞分别加入到1000个HCR-QDs标记的MCF-7细胞中，然后通过抗EpCAM功能化的Fe3O4进行磁分离，四组的实验结果几乎一致，表明Hela细胞产生的背景信号极其微弱，通过磁分离技术可以进一步减少干扰。并且7C中的流式图辅助的结果也与此一致。
综上，所述近红外Ag2S组装体探针与抗体EpCAM功能化Fe3O4的结合可用于CTCs的特异性识别与分离。通过Ag2S组装体和Fe3O4-EpCAM对CTCs的特异性识别和分离，将本发明近红外Ag2S纳米组装体和Fe3O4-EpCAM结合构建用于分离和检测CTCs，如图1(B)所示。
基于细胞表面抗原分子与特异性单克隆抗体结合的磁珠可以有效分离和富集CTCs的事实，并且特异性核苷酸探针可用于高灵敏的检测CTCs表面标志物的表达水平。因此，本发明将Fe3O4-EpCAM与Ag2S组装体结合来有效分离富集及识别检测CTCs(将5-500个Ag2S组装体标记的MCF-7细胞分别分散在PBS和全血中)。
如图8所示，在血液和PBS溶液中(实际检测到了6-476个MCF-7细胞)，其识别线性方程分别为y＝-2.49+0.9623x(R2＝0.9999)和y＝-1.56+0.9876x(R2＝0.9998)。从其微弱的差别中可以得到，即使在复杂的血液样本中，对于少量的CTCs也能够实现良好的识别；并且在1mL血样中能检测到6个癌细胞。因此，通过将Fe3O4-EpCAM和本发明近红外Ag2S组装体探针结合可以高效率捕获的血样中的较少的靶细胞。
实施例5：从裂解的血液样品中捕获癌细胞
为了制备人造CTCs样品，根据西格玛公司购买的HISTIPAQUE-1077试剂，并根据其说明书的使用方法，首先用红细胞裂解缓冲液处理健康人全血。将细胞捕获实验作为纯癌细胞捕获的条件进行操作，对分离的MCF-7细胞进行成像并计数以定量回收率。
为了定量纯度，用4％多聚甲醛固定Fe3O4-EpCAM上标记的Ag2S组装体细胞10min，并用15μg/mL DAPI和FITC标记的CD45单克隆抗体染色40min。其中MCF-7细胞被鉴定为DAPI+/Ag2S组装体+/CD45-，而WBC是DAPI+/Ag2S组装体-/CD45+。在此过程中，本发明近红外Ag2S组装体标记细胞显红色信号，CD45-FITC标记白细胞显绿色信号，DAPI标记细胞核显蓝色信号。
如图9所示，本发明Ag2S组装体可特异性标记MCF-7细胞显红色信号，CD45-FITC可特异性标记白细胞显绿色信号，而且在MCF-7细胞和白细胞共存的条件下可分别进行识别。同时，从两细胞的尺寸也可以对其进行明显的区分，说明通过Fe3O4-EpCAM和Ag2S组装体可以排除WBCs在血液中的干扰而特异性识别CTCs。从而进一步证明了Fe3O4-EpCAM和本发明近红外Ag2S组装体探针可用于血液样品中CTCs的分离和鉴定。
本发明及实施例1-5所涉及的相关核酸序列，经由NUPACK软件设计DNA探针，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，如以下表1所示。
表1：相关核酸序列
<110> 华东师范大学
<120> 一种近红外Ag2S纳米组装体探针及其制备和应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
GGGGGGGGGGAAAAAACGTCCGTGCT 26
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
TTAACCGAATCCTAGACTCAAAGTAGTCTAGGATTCAAAA AGCACGGACG 50
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
CAGCCTGCACTCTAACGCAGTTGATCCTTTGGATAGCCTGGGTTAGA 47
<210> 4
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
GTGCAGGCTGAATTAAAGTCTAGGATTCGGTTAAGAATCCTAGACT ACTTTG 52
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
AGTCTAGGATTCGGTTAA 18

Claims (10)

1.一种近红外Ag2S纳米组装体探针，其特征在于，其包括基于HCR反应组装的单体M1和单体M2；所述单体M1包含DNA-Ag2S纳米点和如SEQ ID NO.2所示的核酸序列H1；其中，所述DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述单体M2包含如SEQ ID NO.3所示的适配体和如SEQ IDNO.4所示的核酸序列H2。
2.如权利要求1所述的近红外Ag2S纳米组装体探针的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)将所述DNA-Ag2S纳米点和核酸序列H1组装成单体M1；将所述适配体和核酸序列H2组装成单体M2；
2)在引发剂的作用下，所述单体M1和M2进行HCR循环放大扩增反应，得到所述近红外Ag2S纳米组装体探针。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述引发剂的序列如SEQID NO.5所示。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述引发剂打开单体M1的茎部杂交部分，引发打开的M1再进一步打开单体M2的茎部，使HCR循环反应不断地进行，直到引发剂消耗完全为止。
5.如权利要求1所述的近红外Ag2S纳米组装体探针在制备检测循环肿瘤细胞的试剂盒/体外诊断产品中的应用。
6.基于如权利要求1所述的近红外Ag2S纳米组装体探针和抗体修饰的磁纳米颗粒在检测循环肿瘤细胞中的应用。
7.一种基于如权利要求1所述的近红外Ag2S纳米组装体探针来检测肿瘤细胞的成像方法。
8.一种将近红外Ag2S纳米组装体探针用于检测肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，将如权利要求1所述的近红外Ag2S纳米组装体探针与肿瘤细胞孵育，然后，将其与抗体修饰的磁纳米颗粒Fe3O4-EpCAM孵育，得到基于所述近红外Ag2S纳米组装体探针和抗体修饰的磁纳米颗粒，用于循环肿瘤细胞的检测。
9.如权利要求5、6所述的应用以及如权利要求7、8所述的方法，其特征在于，所述循环肿瘤细胞为乳腺癌细胞、舌鳞癌细胞、肝癌细胞。
10.一种体外诊断产品，其特征在于，所述体外诊断产品包括如权利要求1所述的近红外Ag2S纳米组装体探针。
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