CN101182578B - 基于纳米金探针的基因芯片的dna检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于纳米金探针的基因芯片的高灵敏度的DNA检测方法，其特征在于首先将纳米金通过低温离心浓缩富集，用无菌去离子水或TE(PH7.4)按一定浓度重悬，再在纳米金里加一定量的巯基修饰的DNA信号探针，大大节约了巯基修饰DNA的用量；标记完后，与待测目的分子一起置于芯片上采用一步法杂交，将待测DNA与芯片上的捕捉探针及标记纳米金的信号探针同时杂交上，杂交完后再进行清洗，晾干，加改进的银染试剂于芯片上进行银染显色，使杂交信号强度大大提高，以提高检测灵敏度，肉眼观测或用CCD扫描拍照。本发明提供的检测方法具有大大降低DNA探针用量、灵敏度高和信号检测方便等优点。
Description
技术领域
本发明涉及基因芯片的DNA检测方法，特别是一种基于纳米金探针的基因芯片的高灵敏度的DNA检测方法，可应用于医学领域。
背景技术
基因芯片是利用微电子芯片技术的集约化和平行处理原理，将大量具有生物学意义的特点序列的生物样品有序地固化在硅衬底或玻璃上构成，利用基因芯片可以快速地获取或处理大量的生命信息(包括基因的识别、基因突变检测、基因表达谱检测等)，其在基因表达、基因突变、基因多态性研究和基因诊断等领域获得成功应用。
目前，基因芯片杂交结果的检测方法主要有荧光标记检测法和同位素标记检测法，同位素标记检测法由于操作复杂，有污染，获取数据速度慢等缺点；荧光标记检测法则主要因为荧光试剂价格昂贵、生物分子自身荧光干扰、荧光衰减以及读取所用仪器价格昂贵等缺点，也大大限制了其在医学临床诊断方面的应用。随着纳米科学技术的不断发展，纳米材料和纳米结构取得了引人瞩目的成就，各种不同的纳米功能材料不断涌现，比如各种纳米颗粒(纳米磁珠、纳米金粒子)、纳米管、纳米棒、纳米丝和纳米薄膜等，这就为生物医学的发展提供了新的契机。纳米材料具有传统材料所不具备的特有的三大效应：表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应。作为标记材料而广泛应用于免疫检测中的纳米纳米金颗粒对生物分子有很强的吸附功能，可以与蛋白质、核酸等非共价结合，因而在生物医学基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。纳米金颗粒具有高电子密度的特性，在纳米金颗粒结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而广泛应用于定性或半定量的快速检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为银染色。纳米金颗粒标记技术具有简单、快速、准确和无污染等优点，且检测不依赖昂贵的激光检测仪器，只需普通光学仪器，甚至肉眼即可辨别。鉴于以上优点，基于纳米粒子的纳米金技术现已成为当今最快速敏感的免疫学检测技术之一，特别适合于广大基层单位、医院、野外作业人员以及大批量时间紧的检测和大面积普查等，因此该技术具有巨大的发展潜力和应用前景。
近几年，基于纳米金的基因芯片的检测方法虽已有报道，但均存在探针用量大、杂交过程繁琐等问题，本发明拟在纳米金的DNA探针标记、芯片杂交、芯片杂交液配方及银染方法上有一定的改进，从而可以大大的节约DNA探针用量、缩短杂交时间并提高检测的灵敏度。
发明内容
本发明目的在于提供一种基于纳米金探针的基因芯片的DNA检测方法，所提供的检测方法是先将纳米金溶液离心进行富集，再用缓冲液重悬进行标记、采用一步法杂交的方法。以要解决的技术问题主要是针对目前纳米金标记探针用量大、杂交过程繁琐等问题。
本发明提供的DNA检测方法主要包括：首先将纳米金通过低温(4℃)离心浓缩富集，用无菌去离子水或TE缓冲液(PH7.4)按一定浓度重悬，再在纳米金里加一定量的巯基修饰的DNA信号探针，标记完后，与待测目的分子一起置于同一芯片上采用一步法杂交，将待测DNA与芯片上的捕捉探针及标记纳米金的信号探针同时杂交上，杂交完后再进行清洗，晾干后，加银染试剂于芯片上进行银染显色，肉眼观测或显微镜下观察、或用CCD扫描拍照，本发明的主要流程见图1。
主要包括以下具体技术：
1目的基因组DNA的提取及PCR扩增
详细方法参照《分子克隆实验指南》第二版，1996，科学出版社出版，(美)萨姆布鲁等编著，金冬雁等译。
2纳米金的DNA探针标记：
首先将纳米金通过4℃，14000rpm离心40-60分钟，用一定量无菌去离子水或TE(PH7.4)重悬，使纳米金浓缩前后体积比例为10∶1-20∶1，再将按一定比例混合的巯基修饰的信号探针加入纳米金里，使信号探针的终浓度为3μM-5μM，标记16-24小时后，加入稳定剂稳定48-96小时后，清洗3-4次，洗去未标记上的DNA探针，4℃保存备用。纳米金粒径为10-20nm；稳定剂为0.1MNaCl和0.1MPB，PB由Na2HPO4和NaH2PO4组成。
3一步法芯片杂交
将各种浓度的待测DNA与纳米金标记的DNA探针置于同一芯片上，在一定温度25-50℃下杂交30分钟-2小时，将待测DNA与芯片上的捕捉探针及标记纳米金的信号探针同时杂交上；然后先用预热到30-32℃的0.1M磷酸缓冲液PBS清洗1-2遍，再用NaNO3洗液洗1-2遍，晾干。
4银染
将银染试剂按一定比例混合，快速置于芯片上避光反应5-10分钟，置入超纯水终止反应，晾干，肉眼观测，或普通显微镜下观察、拍照或者用普通扫描仪扫描并分析。
本发明提供的基于纳米金探针的基因芯片的DNA检测方法的有点及特点：
①可大大降低DNA探针用量
用来标记纳米金的DNA探针一般采用巯基修饰，探针合成费时费力，而且费用也较大，在标记纳米金时，为了尽可能的提高标记效率，所用DNA探针的浓度比较高，所以DNA探针的消耗量比较大。本技术通过低温超速离心，先使纳米金浓缩富集，再用合适的重悬液将纳米金按一定浓度重悬，使纳米金的总体积缩减，从而降低DNA探针的用量(可以减少80％用量)。
②节约时间
本发明采用一步法芯片杂交，即将待测DNA分子一起与纳米金探针置于芯片上只需进行20分钟-1小时的杂交，杂交完后通过清洗，洗去未杂交上的纳米金探针，大大缩减了操作的时间，而且通过改变洗液的配方及洗片方法，可以减少一步法杂交的非特异性。通常的两步法杂交是先将待测DNA分子与芯片上的捕捉探针杂交，杂交完后清洗，晾干，再将纳米金探针置于芯片上进行杂交，因此，两步法操作比较繁琐、费时，而且由于在第一步杂交完后要进行清洗，会将一部分杂交上的待测DNA分子洗掉，因此使杂交信号减弱，降低了检测的灵敏度。
③灵敏度高
本发明采用纳米金标记结合银染的检测方法，由于纳米颗粒的纳米效应，纳米金具有较大的比表面积，其表面可标记上大量的探针分子；纳米金颗粒又可以通过银染，通过银颗粒的聚集使信号进一步放大，从而提高了检测的灵敏度。
④信号检测方便
本发明通过纳米金标记及银染的方法，生成的信号为肉眼可见的灰色或黑色颗粒，不依赖昂贵的激光检测仪器，实验结果可以长期保存，便于临床上的推广。银染试剂的配方进行了改进，增加了银染试剂的稳定性，并降低了背景，提高信噪比。
附图说明
图1基于纳米金探针的基因芯片检测流程；
图2纳米金在修饰前后的紫外-可见分光光谱仪扫描图谱，图中曲线1为修饰前，曲线2为修饰后；
图3纳米金探针检测不同浓度靶核酸的芯片杂交结果(从左至右依次为10-10、10-11和10-12M)。
具体实施方式
实施例1
利用本发明提供的基于纳米金探针的基因芯片的检测方法检测合成的靶单链，检测靶单链DNA的灵敏度为10-12M。
一、所用试剂及材料：
1)基因芯片的制备
芯片点样仪型号为Prosys 5510A，芯片点直径100μM，点间距500μM，点样量为0.7nl，DNA探针浓度为75μM。
2)0.1MPBS洗液(PH7.2)：137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，4.3mmol/LNa2HPO4.7H2O，1.4mmol/L KH2PO4。
3)0.1MPB(PH7.2)：0.2M Na2HPO4，0.2M NaH2PO4。
4)TE缓冲液(PH7.4)：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L乙二胺四乙酸钠(EDTA)。
5)杂交缓冲液：0.3M NaCl、10mM PB、0.01％SDS、0.025％Tween20。
6)NaNO3洗液：0.3M NaNO3、10mM PB、0.01％SDS、0.025％Tween20。
7)银染液：柠檬酸缓冲液(2.55g柠檬酸和2.35g柠檬酸三钠/10ml H2O)，氢醌(0.4g/15ml H2O及15ml柠檬酸缓冲液)，明胶(1％)，按1∶1的体积比取氢醌及明胶各50μl混匀，再加硝酸银溶液(0.5g AgNO3/2ml H2O)2μl。
二、具体的检测步骤：
1)所需要的探针序列：
标记纳米金的信号探针序列为：5′TCT CAA CTC GTA GCT-A10-(CH2)6-SH 3’，芯片上固定的捕捉探针序列为：5′NH2-(CH2)6-A10-CGT CGC ATT CAG GAT 3’，合成的靶单链序列：5’AGC TAC GAG TTGAGAATC CTG AAT GCG ACG3’，所有探针或序列均由TakaRa公司合成。
2)纳米金的DNA探针标记
取浓度为10nM的15nm纳米金溶液1ml，14,000rpm离心45分钟，去上清，用200μl无菌去离子水重悬，再加入浓度为100μM的DNA探针10μl，使其终浓度为5μM，室温放置16小时以上；再分3次逐渐加入1MNaCl、0.1M PB(PH7.2)至终浓度分别为0.1M、10mM，充分混匀，室温放置48小时以上；14,000rpm离心45分钟-1小时，去上清，用0.1MPBS洗两次，再加100μl的0.1M PBS(含50％的无菌甘油)，4℃储存备用，用紫外-可见光光谱仪测其吸光光谱及OD值(扫描结果见附图2)，从光谱分析图上可以看出，标记了DNA探针的纳米金的最大吸收峰的波长后移了4nm(标记前后最大吸收峰波长分别是520nm和524nm)。
3)芯片杂交
将合成靶单链用杂交缓冲液稀释成各种浓度与纳米金标记的DNA探针置于芯片上，32℃杂交40分钟，用预热到32℃的0.1M PBS洗液洗两遍；再用NaNO3洗液洗一次，晾干。
4)银染检测
按1∶1的体积比取氢醌及明胶各50μl混匀，再添加硝酸银溶液(由0.5g AgNO3和2ml H2O组成)2μl，迅速混匀，置于芯片上，盖上盖玻片，避光反应5-10分钟，置入超纯水，晾干，肉眼观测，或普通显微镜下观察、拍照或者用普通扫描仪扫描，检测结果见附图3，可检测到10-12M的靶单链DNA。
实施例2
利用基于纳米金的基因芯片的检测方法检测野生型p53基因及248位点突变的p53基因
1)所需要的探针序列：
标记纳米金的信号探针序列为：
5’TGGAAGACTCCAGGTCAGGAGCC AC-A10-(CH2)6-SH 3’，检测野生型p53的捕捉探针序列为：5’NH2-(CH2)6-T10-GGCATGAACCGGAGGCCCAT 3.’，检测突变型p53的捕捉探针序列为5’NH2-(CH2)6-T10-GGCATGAACCTGAGGCCCAT 3.’，所有探针均由TaKaRa公司合成。
2)人组织基因组DNA的提取及p53基因的PCR扩增
人基因组DNA的提取的详细方法参照《分子克隆实验指南》第二版，1996，科学出版社出版，(美)萨姆布鲁等编著，金冬雁等译。P53基因扩增的引物序列为：引物1：5′-TCT TGGGCC TGT GTT ATC TC-3′，引物2：5′-AGGGTG GCA AGT GGC TCC-3′。扩增条件为：首先94℃，5分钟，以94℃，40秒，55℃，40秒，72℃，40秒循环30次，最后，72℃延伸5分钟。用电泳检测PCR产物。
3)纳米金的DNA探针标记
取浓度为10nM的15nm纳米金溶液1ml，14,000rpm离心45分钟，去上清，用100μl TE(PH7.4)重悬，再加入浓度为100μM的DNA探针4μl，使其终浓度为4μM，室温放置16小时以上；再分3次逐渐加入1MNaCl、0.1M PB(PH7.2)至终浓度分别为0.1M、10mM，充分混匀，室温放置48小时以上；14,000rpm离心45分钟-1小时，去上清，用0.1MPBS洗两次，再加适当量的0.1M PBS(含50％的无菌甘油)，4℃储存备用，用紫外分光光度计测其OD值，换算成浓度。
4)芯片杂交
将PCR扩增产物与杂交缓冲液按1∶1比例稀释，并与纳米金标记的DNA探针(2μl)置于芯片上，32℃杂交20分钟，用预热到32℃的0.1M PBS洗两遍；再用NaNO3洗液洗一次，晾干。
5)银染检测
按1∶1的体积比取氢醌及明胶各50μl混匀，再添加硝酸银溶液(0.5gAgNO3和2ml H2O)2μl，迅速混匀，置于芯片上，盖上盖玻片，避光反应5-10分钟，置入超纯水，晾干，肉眼观测，或普通显微镜下观察、拍照或者用普通扫描仪扫描。
Claims (2)
1.一种基于纳米金探针的基因芯片的DNA检测方法，其特征在于检测合成靶单链，灵敏度达10-12M；检测步骤是：
a)所需要的探针序列：
标记纳米金的信号探针序列为：5′TCT CAA CTC GTA GCT-A10-(CH2)6-SH 3’，芯片上固定的捕捉探针序列为：5′NH2-(CH2)6-A10-CGT CGC ATT CAG GAT 3’，合成的靶单链序列：5’AGC TAC GAG TTGAGA ATC CTG AAT GCG ACG3’，所有探针或序列均由TakaRa公司合成；
b)纳米金的DNA探针标记
取浓度为10nM的15nm纳米金溶液1ml，14,000rpm离心45分钟，去上清，用200μl无菌去离子水重悬，再加入浓度为100μM的DNA探针10μl，使其终浓度为5μM，室温放置16小时以上；再分3次逐渐加入PH为7.2的1M NaCl、0.1M PB至终浓度分别为0.1M、10mM，充分混匀，室温放置48小时以上；14,000rpm离心45分钟-1小时，去上清，用0.1MPBS洗两次，再加100μl的含50％的无菌甘油0.1M PBS，4℃储存备用，用紫外-可见光光谱仪测其吸光光谱及OD值标记了DNA探针的纳米金的最大吸收峰的波长后移了4nm；
c)芯片杂交
将合成靶单链用杂交缓冲液稀释成各种浓度与纳米金标记的DNA探针置于芯片上，32℃杂交40分钟，用预热到32℃的0.1M PBS洗液洗两遍；再用NaNO3洗液洗一次，晾干；
d)银染检测
按1∶1的体积比取氢醌及明胶各50μl混匀，再添加由0.5g AgNO3和2ml H2O组成的硝酸银溶液2μl，混匀，置于芯片上，盖上盖玻片，避光反应5-10分钟；置入超纯水，晾干，肉眼观测，或普通显微镜下观察、拍照或者用普通扫描仪扫描。
2.一种基于纳米金探针的基因芯片的DNA检测方法，其特征在于检测野生型p53基因及248位点突变的p53基因的步骤为：
a)所需要的探针序列：
标记纳米金的信号探针序列为：
5’TGGAAGACTCCAGGTCAGGAGCC AC-A10-(CH2)6-SH3.’，检测野生型p53的捕捉探针序列为：5’NH2-(CH2)6-T10-GGCATGAACCGGAGGCCCAT 3.’，检测突变型p53的捕捉探针序列为5’NH2-(CH2)6-T10-GGCATGAACCTGAGGCCCAT 3.’，所有探针均由TaKaRa公司合成；
b)人组织基因组DNA的提取及p53基因的PCR扩增
P53基因扩增的引物序列为：引物1：5′-TCT TGGGCC TGT GTT ATCTC-3′，引物2：5′-AGGGTG GCA AGT GGC TCC-3′， 扩增条件为：首先94℃，5分钟，以94℃，40秒，55℃，40秒，72℃，40秒循环30次，最后，72℃延伸5分钟， 用电泳检测PCR产物；
c)纳米金的DNA探针标记
取浓度为10nM的15nm纳米金溶液1ml，14,000rpm离心45分钟，去上清，用PH为7.4的TE缓冲液100μl重悬，再加入浓度为100μM的DNA探针4μl，使终浓度为4μM，室温放置16小时以上；再分3次逐渐加入PH为7.2的1M NaCl、0.1M PB至终浓度分别为0.1M、10mM，混匀，室温放置48小时以上；14,000rpm离心45分钟-1小时，去上清，用0.1MPBS洗两次，再加适当量的0.1M含50％的无菌甘油PBS，4℃储存备用，用紫外分光光度计测其OD值，换算成浓度；
d)芯片杂交
将PCR扩增产物与杂交缓冲液按1∶1比例稀释，并与纳米金标记的DNA探针置于芯片上，32℃杂交20分钟，用预热到32℃的0.1M PBS洗两遍；再用NaNO3洗液洗一次，晾干；
e)银染检测
按1∶1的体积比取氢醌及明胶各50μl混匀，再添加由0.5g AgNO3和2ml H2O组成的硝酸银溶液2μl，混匀，置于芯片上，盖上盖玻片，避光反应5-10分钟，置入超纯水，晾干，肉眼观测，或普通显微镜下观察、拍照或者用普通扫描仪扫描。
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