CN101519695A - 多靶标量子点标记核酸芯片及其制备方法和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了多靶标量子点标记核酸芯片及其制备方法和检测方法，该核酸芯片包括固相支持物和固定在固相支持物表面的寡核苷酸探针阵列，寡核苷酸探针阵列由至少两种不含自身互补序列的寡核苷酸探针组成，寡核苷酸探针的一端标记量子点并通过量子点固定，不同序列的寡核苷酸探针用发射不同波长荧光的量子点标记；或者寡核苷酸探针阵列由至少两种分子信标组成，分子信标的一端标记量子点并通过量子点固定，不同序列的分子信标用发射不同波长荧光的量子点标记，另一端用荧光猝灭基团标记；利用碱基互补配对原则和FRET现象，可以同时实现待测核酸样品中多种特定核酸序列的检测，且制备简单、检测准确、灵敏、简便、快速，可同时检测多个样品。

Description

多靶标量子点标记核酸芯片及其制备方法和检测方法

技术领域

本发明涉及生物传感器，特别涉及多靶标量子点标记核酸芯片，还涉及该核酸芯片的制备方法和检测方法。

背景技术

在核酸分析领域，核酸传感器作为准确、简便、快速的检测方法，已受到越来越多的关注。其基本原理是将能够识别特定核酸序列的寡核苷酸探针固定于固相支持物上，测定时与待测核酸样品进行杂交反应，并将杂交反应结果转化为可以读取的信号输出，从而实现对待测核酸样品中特定核酸序列的定性或定量检测。

核酸传感器检测时的输出信号可以是电信号或光信号等，这取决于具体所采用的检测技术。荧光共振能量转移(FRET)是指能量从一种受激发的荧光物质(给体)以非辐射的方式转移到另一种荧光物质(受体)的物理现象。当给体的发射光谱与受体的吸收光谱能够有效地重叠，并且给体和受体之间的距离在1～10nm以内，给体和受体之间就会发生FRET，使给体荧光强度降低，受体荧光强度增强或不发射荧光，同时伴随二者荧光寿命的相应缩短和延长。利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料分子标记到研究对象上，FRET技术已被成功地应用于核酸检测、免疫分析、生物大分子相互作用研究等诸多方面。

一个理想的FRET体系，要求给体的发射光谱和受体的吸收光谱有明显的重叠，给体的发射光谱和受体的发射光谱完全分开，在给体的激发波长下对受体无激发。但传统的有机荧光染料吸收光谱较窄，并且吸收峰和发射峰之间的斯托克斯位移较小，在给体的有效激发波长下常常会造成对受体的激发；其次，给体的发射光谱较宽且常常伴有拖尾，经常与受体的发射光谱重叠，造成光谱干扰；再次，许多有机荧光染料的光漂白和光降解现象比较严重，造成体系不稳定。此外，生物分析中经常需要同时检测多种核酸，但用不同的有机荧光染料分子分别标记检测对象时，因每种有机荧光染料需要不同波长的激发光而使检测变得非常困难。这些问题在很大程度上限制了FRET技术的发展和应用。

量子点的出现为克服以上问题带来了希望。量子点(quantum dots，QDs)是一种直径在1～10nm之间，能够接受激发光产生荧光的半导体纳米颗粒，由周期表中II-VI族或III-V族元素组成。其相对于有机染料具有许多优点：(1)量子点的激发波长范围宽，从紫外区到近红外区，可以用同一波长的光激发不同粒径的量子点，并且可以通过选择合适的激发波长来避免对受体分子的直接激发；(2)量子点的粒径越大，荧光波长越长，可以通过改变量子点的粒径来调节量子点发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，从而可以调节FRET效率；(3)量子点的荧光谱峰狭窄而对称，半高峰宽通常为25～45nm；(4)量子点的发光强度高，对光漂白有强烈的抵制作用。由于这些独特的量子优势，近年来量子点应用于FRET的研究逐渐深入，范围不断扩展，但迄今为止，尚未见将量子点制成基于固相支持物的核酸芯片的研究报道。

发明内容

有鉴于此，为克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供第一种多靶标量子点标记核酸芯片，可以实现待测核酸样品中多种特定核酸序列的准确、灵敏、简便、快速、高通量检测。

为达到此目的，在本发明的第一方面，提供了第一种多靶标量子点标记核酸芯片，包括固相支持物和固定在固相支持物表面的寡核苷酸探针阵列，所述寡核苷酸探针阵列由至少两种不含自身互补序列的寡核苷酸探针组成，所述寡核苷酸探针的一端标记量子点并通过量子点固定在固相支持物的表面，不同序列的寡核苷酸探针用发射不同波长荧光的量子点标记。

进一步，所述量子点选自MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、ZnO、ZnS、ZnSe、ZnTe、SrS、SrSe、SeTe、CdS、CdSe、CdTe、BaS、BaSe、BaTe、HgS、HgSe、HgTe、PbSe、CaAs、InP、InAs、InCaAs、ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdS/ZnS、CdS/Ag₂S、CdS/HgS、CdS/HgS/CdS、CdS/PbS、CdS/Cd(OH)₂、CdSe/CuSe、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdSe/CdS、CdSe/HgSe、CdSe/HgSe/CdSe、CdSe/HgTe、CdTe/HgS、CdTe/HgTe、InAs/ZnSe、InAs/CdSe、InAs/InP、ZnS:Mn、ZnS:Cu、CdS:Mn和CdS:Cu中的任一种，以及以上述任一种为核、二氧化硅为壳的核壳型量子点。

本发明的目的之二在于提供所述第一种多靶标量子点标记核酸芯片的制备方法。

为达到此目的，在本发明的第二方面，提供了所述第一种多靶标量子点标记核酸芯片的制备方法，包括以下步骤：

a、制备至少两种发射不同波长荧光且链霉亲和素标记的量子点；

b、制备至少两种不含自身互补序列且一端生物素标记的寡核苷酸探针；

c、将步骤b所得一端生物素标记的寡核苷酸探针与步骤a所得链霉亲和素标记的量子点通过生物素-链霉亲和素的特异性结合进行偶联，不同序列的寡核苷酸探针对应发射不同波长荧光的量子点，制备至少两种一端量子点标记的寡核苷酸探针；

d、将固相支持物的表面用生物素标记，再利用生物素-链霉亲和素的特异性结合将步骤c所得至少两种一端量子点标记的寡核苷酸探针通过量子点固定至固相支持物的表面，且每种寡核苷酸探针同时固定多个至形成阵列，即得核酸芯片。

本发明的目的之三在于提供所述第一种多靶标量子点标记核酸芯片的检测方法。

为达到此目的，在本发明的第三方面，提供了所述第一种多靶标量子点标记核酸芯片的检测方法，包括以下步骤：

a、制备一端荧光淬灭基团标记的待测核酸样品；

b、将步骤a所得一端荧光淬灭基团标记的待测核酸样品分别与核酸芯片表面的至少两种寡核苷酸探针进行杂交反应，当寡核苷酸探针和待测核酸样品中的特定核酸序列杂交后，量子点和荧光猝灭基团彼此靠近并发生FRET；

c、以一定波长的激发光照射杂交反应后的核酸芯片，通过杂交前后各量子点荧光强度的变化同时进行待测核酸样品中至少两种特定核酸序列的检测。

进一步，所述荧光淬灭基团选自5-羧基荧光素(5-FAM)、6-FAM、异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明B、罗丹明101、罗丹明123、罗丹明640、罗丹明6G、四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、四乙基罗丹明异硫氰酸盐(TRITC)、罗丹明红-X(RRX)、阿历克斯350(Alexa350)、Alexa488、Alexa555、Alexa568、Alexa594、Alexa647、Alexa680、花青染料2(Cy2)、Cy3、Cy5、黑猝灭剂-1(Black Hole Quencher1，BHQ-1)、BHQ-2、BHQ-3、LightCycler-Red640(LC-Red640)、LC-Red705、德克萨斯红(TR)、氨甲香豆素乙酸(AMCA)、4-(4′-二甲基氨基)偶氮苯基苯甲酸(DABCYL)、赛博绿-I(SYBR Green I)和纳米金中的任一种。

本发明的目的之四在于提供第二种多靶标量子点标记核酸芯片，可以实现待测核酸样品中多种特定核酸序列的准确、灵敏、简便、快速、高通量检测。

为达到此目的，在本发明的第四方面，提供了第二种多靶标量子点标记核酸芯片，包括固相支持物和固定在固相支持物表面的寡核苷酸探针阵列，所述寡核苷酸探针阵列由至少两种分子信标组成，所述分子信标的一端标记量子点并通过量子点固定在固相支持物的表面，不同序列的分子信标用发射不同波长荧光的的量子点标记，另一端标记荧光猝灭基团。

进一步，所述量子点选自MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、ZnO、ZnS、ZnSe、ZnTe、SrS、SrSe、SeTe、CdS、CdSe、CdTe、BaS、BaSe、BaTe、HgS、HgSe、HgTe、PbSe、CaAs、InP、InAs、InCaAs、ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdS/ZnS、CdS/Ag₂S、CdS/HgS、CdS/HgS/CdS、CdS/PbS、CdS/Cd(OH)₂、CdSe/CuSe、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdSe/CdS、CdSe/HgSe、CdSe/HgSe/CdSe、CdSe/HgTe、CdTe/HgS、CdTe/HgTe、InAs/ZnSe、InAs/CdSe、InAs/InP、ZnS:Mn、ZnS:Cu、CdS:Mn和CdS:Cu中的任一种，以及以上述任一种为核、二氧化硅为壳的核壳型量子点；

进一步，所述荧光淬灭基团选自5-FAM、6-FAM、FITC、罗丹明B、罗丹明101、罗丹明123、罗丹明640、罗丹明6G、RRX、TAMRA、TRITC、Alexa350、Alexa488、Alexa555、Alexa568、Alexa594、Alexa647、Alexa680、Cy2、Cy3、Cy5、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、LC-Red640、LC-Red705、TR、AMCA、DABCYL、SYBR Green和纳米金中的任一种。

本发明的目的之五在于提供所述第二种多靶标量子点标记核酸芯片的制备方法。

为达到此目的，在本发明的第五方面，提供了所述第二种多靶标量子点标记核酸芯片的制备方法，包括以下步骤：

a、制备至少两种发射不同波长荧光且链霉亲和素标记的量子点；

b、制备至少两种一端生物素标记、另一端荧光猝灭基团标记的分子信标；

c、将步骤b所得一端生物素标记、另一端荧光猝灭基团标记的分子信标与步骤a所得链霉亲和素标记的量子点进行偶联，不同序列的分子信标对应发射不同波长荧光的量子点，制备至少两种一端量子点标记、另一端荧光猝灭基团标记的分子信标；

d、将固相支持物的表面用生物素标记，再利用生物素-链霉亲和素的特异性结合将步骤c所得至少两种一端量子点标记、另一端荧光猝灭基团标记的分子信标通过量子点固定至固相支持物的表面，且每种分子信标同时固定多个至形成阵列，即得核酸芯片。

本发明的目的之六在于提供所述第二种多靶标量子点标记核酸芯片的检测方法。

为达到此目的，在本发明的第六方面，提供了所述第二种多靶标量子点标记核酸芯片的检测方法，包括以下步骤：

a、将待测核酸样品分别与核酸芯片表面的至少两种分子信标进行杂交反应，当分子信标和待测核酸样品中的特定核酸序列杂交后，量子点和荧光猝灭基团彼此远离而不发生FRET；

b、以一定波长的激发光照射杂交反应后的核酸芯片，通过杂交前后各量子点荧光强度的变化同时进行待测核酸样品中至少两种特定核酸序列的检测。

本发明的有益效果在于：本发明基于碱基互补配对原则和FRET现象，建立了多靶标量子点标记核酸芯片，第一种形式是将多种不含自身互补序列且一端量子点标记的寡核苷酸探针(不同序列的寡核苷酸探针用发射不同波长荧光的量子点标记)通过量子点固定在固相支持物的表面，其可以与荧光猝灭基团标记的特定核酸序列进行杂交，从而使量子点和荧光猝灭基团彼此靠近并发生FRET；第二种形式是将多种一端量子点标记、另一端荧光猝灭基团标记的分子信标(不同序列的分子信标用发射不同波长荧光的量子点标记)通过量子点固定在固相支持物的表面，其可以与特定核酸序列进行杂交，从而使量子点和荧光猝灭基团彼此远离而不发生FRET；采用同一波长的激发光同时激发各发射不同波长荧光的量子点，通过杂交前后各量子点荧光强度的变化可以同时检测核酸样品中多种特定核酸序列，且具有制备简单，检测准确、灵敏、简便、快速等优点；此外，采用每种不含自身互补序列的寡核苷酸探针或分子信标重复设置多个形成阵列的形式，还可以实现一个样品的多次重复检测或多个样品的同步、快速检测；应用前景好。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为第一种多靶标量子点标记核酸芯片的制备和检测示意图；

图2为第二种多靶标量子点标记核酸芯片的制备和检测示意图；

图3为分别以Na₂SeSO₃和NaHSe为前驱体制得的CdSe量子点随回流反应时间的最大吸收波长变化趋势图；

图4为分别以Na₂SeSO₃和NaHSe为前驱体制得的CdSe量子点随回流反应时间的粒径(由图3的最大吸收波长算得)变化趋势图；

图5为不同回流反应时间制得的CdTe/CdSe量子点的荧光光谱图；

图6为CdTe核和CdTe/CdSe核壳结构的紫外-可见吸收光谱图；

图7为CdTe核和CdTe/CdSe核壳结构的X射线粉末衍射(XRD)图。

具体实施方式

本发明的多靶标量子点标记核酸芯片主要包括两种形式：

第一种多靶标量子点标记核酸芯片的制备和检测示意图如图1所示，该核酸芯片制备是先将多种不含自身互补序列的寡核苷酸与多种发射不同波长荧光的量子点通过生物素-亲和素(亲和素或链霉亲和素)系统进行偶联(不同序列的寡核苷酸对应发射不同波长荧光的量子点)，制得多种一端量子点标记的寡核苷酸探针(QD1-P1、QD2-P2)；再将量子点与固相支持物(对于核酸传感器，可供选择的固相支持物包括硅片、玻片、瓷片、聚丙烯膜或尼龙膜等)通过生物素-亲和素(亲和素或链霉亲和素)系统进行偶联，从而将多种寡核苷酸探针通过量子点固定在固相支持物的表面；采用相同方法将每种寡核苷酸探针同时固定多个至形成寡核苷酸探针阵列；应用该核酸芯片进行检测时是先将待测核酸样品的一端标记荧光猝灭基团，再将其分别与核酸传感器表面的多种寡核苷酸探针(QD1-P1、QD2-P2)进行杂交反应，如果待测核酸样品中含有与寡核苷酸探针互补的特定核酸序列(D1与P1互补、D2与P2互补)，则其与寡核苷酸探针的结合会使量子点和荧光猝灭基团彼此靠近并发生FRET，使量子点发出的荧光被荧光猝灭基团吸收而猝灭，且荧光猝灭程度与特定核酸序列浓度成正比，通过杂交前后各量子点荧光强度的变化可同时实现待测核酸样品中多种特定核酸序列的定性和/或定量检测。

第二种多靶标量子点标记核酸芯片的制备和检测示意图如图2所示，该核酸芯片的制备是先将多种含有自身互补序列的寡核苷酸(发卡型寡核苷酸)与多种发射不同波长荧光的量子点通过生物素-亲和素(亲和素或链霉亲和素)系统进行偶联(不同序列的寡核苷酸对应发射不同波长荧光的量子点)，制得多种一端量子点标记、另一端荧光猝灭基团标记的分子信标(QD1-MB1、QD2-MB2)；再将量子点与固相支持物(对于核酸传感器，可供选择的固相支持物包括硅片、玻片、瓷片、聚丙烯膜或尼龙膜等)通过生物素-亲和素(亲和素或链霉亲和素)系统进行偶联，从而将多种分子信标通过量子点固定在固相支持物的表面；采用相同方法将每种分子信标同时固定多个至形成寡核苷酸探针阵列；应用该核酸芯片进行检测时是将待测核酸样品分别与核酸芯片表面的多种分子信标进行杂交反应，杂交反应前，分子信标呈发卡式结构，量子点和荧光猝灭基团相距较近并发生FRET，使量子点发出的荧光几乎完全被荧光猝灭基团吸收而猝灭，荧光本底极低；杂交反应后，如果待测核酸样品中含有与分子信标互补的特定核酸序列(D1与MB1互补、D2与MB2互补)，则其与分子信标的结合会使量子点和荧光猝灭基团彼此远离而不发生FRET，从而使量子点的荧光恢复，且荧光强度与特定核酸序列浓度成正比，通过杂交前后各量子点荧光强度的变化可同时实现待测核酸样品中多种特定核酸序列的定性和/或定量检测。

本发明用发射不同波长荧光的量子点分别标记不同寡核苷酸探针或分子信标序列，这些量子点可被单一波长的激发光所激发，产生多种不同颜色的可被同时检测的光谱，故可同时对多种特定核酸序列进行检测。所采用的量子点主要包括单核量子点(如CdS、CdSe、CdTe等)和核壳结构的量子点(如CdS/ZnO、CdSe/ZnS、CdTe/CdS等)。核壳结构的量子点是在一种材料(如CdSe等)的外部包覆另一种具有较大能带隙的材料(如CdS、ZnS等)所构成的量子点，其光学特性由内核决定，外壳具有明显的提高量子产率和增强光化学稳定性的作用。此外，还包括掺杂过渡金属元素的量子点(如CdS:Mn、CdS:Cu等)和二氧化硅包被的量子点等，通过掺入一定比例的Mn、Cu等过渡金属元素可有效改善量子点的光谱性质，而二氧化硅壳层的构建除了可以提高量子点的荧光稳定性，便于量子点的表面功能化外，还有利于降低因量子点光分解所导致的细胞毒性问题。量子点的制备方法主要有两种：一种是在水相中制备，另一种是采用胶体化学方法在有机相中制备。在水溶液中加入稳定剂如巯基乙酸等，可以直接制得表面修饰有羧基的水溶性量子点，具有操作简单、所用材料价格低、毒性小等优点，但量子点的荧光产率相对较低，粒径分布范围相对较大。而采用胶体化学方法在有机相中可制得荧光产率较高和粒径分布范围较小的量子点，但其不溶于水，在应用于核酸标记时，必须用一定的双功能团对其表面进行修饰，使其在具备一定水溶性的同时又能与核酸发生偶联。目前已有多种制备水溶性量子点的方法，通常包括三种方法：(1)配体交换法，用亲水性的双功能化配体替代原量子点表面的三正辛基氧化膦/三正辛基膦(TOPO/TOP)配体，这种双功能化配体主要由两部分构成，一端能固定在量子点的表面(如-SH)，另一端为亲水性基团(如-OH、-COOH)；(2)装入法，如通过聚合的硅壳将量子点装入，在聚合的硅壳中内层是-SH，外层是亲水性基团；(3)新配体制备法，保留原量子点表面的TOPO/TOP配体，使用二嵌段或三嵌段聚合物的两亲分子的变体通过疏水作用插入和相互交叉来获得亲水性。

量子点与寡核苷酸的偶联，以及量子点与固相支持物的偶联除了采用生物素-亲和素(亲和素或链霉亲和素)系统以外，还可以通过抗体-抗原或配体-受体等特异性结合系统进行，同样可发到本发明目的。

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1

一、多靶标量子点标记核酸芯片的制备

1、多种发射不同波长荧光且链霉亲和素标记的量子点的制备

(1)发射不同波长荧光的量子点的制备

Na₂SeSO₃溶液的制备：在250mL三颈瓶中，加入Na₂SO₃ 6.302g(0.05mol)和Se粉1.579g(0.02mol)，加高纯水100mL使溶解，在搅拌、N₂保护条件下升温至90℃回流反应，随反应时间延长，含灰黑色沉淀的溶液渐变清澈透明，反应6小时后停止加热，抽滤，得无色透明滤液，即浓度约为0.2mol/L的Na₂SeSO₃溶液，置温度70℃(防止氧化)保存，备用。

NaHSe溶液的制备：在20mL小烧瓶中，加入Se粉0.1895g(0.0024mol)，加高纯水6mL使溶解，再加入新制的NaBH₄溶液[将NaBH₄ 0.1903g(0.005mol)溶于高纯水6mL中即得]，搅拌5分钟后，黑色Se粉消失，反应产物立即用冰浴冷却，在温度1℃、转速5000r/min条件下离心10分钟，取上清液，即浓度约为0.2mol/L的NaHSe溶液，备用。

CdSe量子点的制备：在250mL三颈瓶中，加入CdCl₂·2.5H₂O 1.1418g(0.005mol)，加高纯水50mL使溶解，再加入巯基乙酸稀释液[将巯基乙酸0.84mL(0.012mol)用高纯水60mL稀释即得]，用浓度为1mol/L的NaOH 24mL(0.024mol)调节溶液pH值至10，在搅拌条件下加入Na₂SeSO₃溶液(或NaHSe溶液)12mL(0.024mol)，回流反应，每隔一段时间取样检测其荧光，通过控制回流反应的时间，分别制得发射不同波长荧光且表面修饰有羧基的4种CdSe量子点。

分别以Na₂SeSO₃和NaHSe为前驱体制得的CdSe量子点随回流反应时间的最大吸收波长变化趋势图和粒径变化趋势图分别如图3和图4所示。

(2)量子点的链霉亲和素标记

在浓度为0.1mol/L、pH为8.5的磷酸盐缓冲液(PBS)中，加入表面修饰有羧基的CdSe量子点和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚(EDC)(EDC用量为量子点的50～100倍)，混匀，再加入链霉亲和素，室温下搅拌反应3小时后，上SephadexG100层析柱，用浓度为0.1mol/L、pH为7.4的PBS洗脱，得纯化的链霉亲和素标记的CdSe量子点溶液；采用竞争抑制反应法检测链霉亲和素标记后的生物活性。按照上述方法，对发射不同波长荧光的4种CdSe量子点进行链霉亲和素标记，分别制得链霉亲和素标记的4种CdSe量子点溶液。

2、多种不含自身互补序列且一端生物素标记的寡核苷酸探针的制备

根据细胞色素P4503A4(CYP3A4)基因第五号外显子第14026位点的单核苷酸多态性分别设计不含自身互补序列的寡核苷酸探针P1～P4，并委托上海英俊生物技术公司进行制备和5’端生物素标记，寡核苷酸探针序列如下：P1：5’-生物素-agattacaatcattgc-3’；P2：5’-生物素-agattactatcattgc-3’；P3：5’-生物素-agattaccatcattgc-3’；P4：5’-生物素-agatt acgatcattgc-3’。

3、多种一端量子点标记的寡核苷酸探针的制备

在浓度为0.1mol/L、pH为8.0的PBS中，将链霉亲和素标记的CdSe量子点溶液与5’端生物素标记的寡核苷酸探针溶液通过生物素-链霉亲和素的特异性结合进行偶联，室温下避光反应24小时，制得5’端CdSe量子点标记的寡核苷酸探针溶液，采用层析柱进行分离纯化。按照上述方法，将寡核苷酸探针P1～P4与发射不同波长荧光的4种CdSe量子点进行偶联(不同序列的寡核苷酸探针对应发射不同波长荧光的量子点)，制得4种5’端CdSe量子点标记的寡核苷酸探针溶液。

4、多种一端量子点标记的寡核苷酸探针在固相支持物表面的固定

先将玻片表面标记上生物素，充分洗涤玻片去除未结合的生物素后，再在玻片表面每间隔一定距离分别滴加4种5’端CdSe量子点标记的寡核苷酸探针溶液形成点阵(本实施例共设16个点，每种寡核苷酸探针溶液各4个点)，室温下避光反应3小时，利用生物素-链霉亲合素的特异性结合将寡核苷酸探针通过量子点固定在玻片表面，用pH为8.0的PBS洗涤玻片3次，晾干，即得多靶标量子点标记核酸芯片，置温度4℃保存，备用。

二、多靶标量子点标记核酸芯片的检测

1、一端荧光猝灭基团标记的待测核酸样品的制备

根据CYP3A4基因第五号外显子第14026位点及其侧翼序列设计如下通用引物：F：5’-cacattttctacaaccatggagacc-3’；R：5’-tttatacctgtccccaccagattc-3’，委托上海英俊生物技术公司进行制备。

以5’-gttggagacagcaatgatc(t)gtaatctcttccattct-Cy3-3’为模板(其对应于CYP3A4基因第五号外显子第14026位点及其侧翼序列，序列中间碱基分别为C或T，对应于该位点处的野生型或突变型碱基)，以引物F和R为上、下游引物进行不对称PCR扩增，反应体系为：由浓度为100μmol/L的dNTP、浓度为0.1μmol/L的引物F、浓度为1μmol/L的引物R、10ng模板、1U Taq DNA聚合酶和1×PCR缓冲液组成，总体积为20μL；反应条件为：94℃预变性5分钟，然后94℃变性30秒、60℃退火30秒、72℃延伸30秒，共30个循环，最后72℃延伸5分钟；调整反应体系中Cy3-dCTP与dCTP的比例和用量，得3’端Cy3标记的PCR产物(野生型或突变型)。

2、一端荧光猝灭基团标记的待测核酸样品与寡核苷酸探针的杂交

将3’端Cy3标记的PCR产物(野生型或突变型)与杂交液(由5×SSC、质量百分浓度为0.1％的SDS、1×Denhardt试剂和0.1μg/μL的鲑精DNA组成)按体积比为1∶5混合，取混合液各10μL滴加至多靶标量子点标记核酸芯片表面的4种寡核苷酸探针点，每种寡核苷酸探针同时设2个复点，再将该核酸芯片置杂交盒中，温度60℃反应10小时，杂交反应后的核酸芯片依次置洗液A(由1×SSC和质量百分浓度为0.2％的SDS组成)、洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中各洗涤数次，再置温度37℃干燥，避光保存。

3、FRET信号的检测

用激光共聚焦扫描仪GenePix 4000扫描杂交反应后的多靶标量子点标记核酸芯片，获得分析精度为10μm的16位TIFF图像，扣除背景后，荧光强度以每种寡核苷酸探针2个复点的均值表示，并绘制荧光猝灭程度与特定核酸序列浓度的关系曲线。结果显示，寡核苷酸探针P3与野生型PCR产物中的特定核酸序列杂交或寡核苷酸探针P2与突变型PCR产物中的特定核酸序列杂交后，量子点与荧光猝灭基团之间彼此靠近并发生FRET，使量子点的荧光猝灭，且荧光猝灭程度与PCR产物中的特定核酸序列浓度呈正比；而寡核苷酸探针P1、P2或P4与野生型PCR产物以及寡核苷酸探针P1、P3或P4与突变型PCR产物之间不发生杂交，杂交前后各量子点的荧光强度无变化。

实施例2

一、多靶标量子点标记核酸芯片的制备

1、多种发射不同波长荧光且链霉亲和素标记的量子点的制备

(1)多种发射不同波长荧光的量子点的制备

在250mL三颈瓶中，加入高纯水100mL，再加入CdCl₂·2.5H₂O 0.2864g和巯基乙酸222μL，用浓度为1mol/L的NaOH调节溶液pH值至11.2，通氮气30分钟后，在搅拌条件下加入新制的无氧NaHTe溶液(由Te粉80mg和NaBH450mg反应制得)，回流反应56小时；取反应液20mL，加高纯水稀释至100mL，加入CdCl₂·2.5H₂O 0.0576g和巯基乙酸32mL，用浓度为1mol/L的NaOH调节溶液pH值至11.2，通氮气30分钟后，将NaHSe溶液(将Se粉0.0195g和NaBH₄0.0184g充分混合后，加水1mL密封，即得)注射到浓度为0.5mol/L的稀硫酸中产生HxSe气体并随氮气通入反应液中，回流反应，每隔一段时间取样检测其荧光，通过控制反应时间，分别制得发射荧光波长为500nm、518nm、565nm、610nm、655nm且表面修饰有羧基的5种CdTe/CdSe量子点溶液。

不同回流反应时间制得的CdTe/CdSe量子点的荧光光谱图如图5所示，通过控制回流反应时间，可以制备发射不同波长荧光的CdTe/CdSe量子点。

CdTe核和CdTe/CdSe核壳结构的紫外-可见吸收光谱图如图6所示，与CdTe核比较，CdTe/CdSe核壳结构的紫外吸收光谱有明显不同，峰位移动方向和峰形与文献报道一致，在加入硒源后无长波缺陷发射峰，说明CdTe核经表面修饰后表面缺陷减少。

CdTe核和CdTe/CdSe核壳结构的XRD图如图7所示，CdTe/CdSe核壳结构的3个最强衍射峰位置分别是2θ＝26.0°、44.0°、51.5°，与CdTe核的3个最强衍射峰位置(2θ＝24.5°、40.8°、47.4°)基本一致，与CdTe标准XRD图和文献报道一致，说明CdTe/CdSe量子点制备成功。

(2)量子点的链霉亲和素标记

在浓度为0.1mol/L、pH为8.5的PBS中，加入表面修饰有羧基的CdTe/CdSe量子点和EDC(EDC用量为量子点的50～100倍)，混匀，再加入链霉亲和素，室温下搅拌反应3小时后，上Sephadex G100层析柱，用浓度为0.1mol/L、pH为7.4的PBS洗脱，得纯化的链霉亲和素标记的CdTe/CdSe量子点溶液；采用竞争抑制反应法检测链霉亲和素标记后的生物活性。按照上述方法，对发射不同波长荧光的5种CdTe/CdSe量子点进行链霉亲和素标记，分别制得链霉亲和素标记的5种CdTe/CdSe量子点溶液。

2、多种不含自身互补序列且一端生物素标记的寡核苷酸探针的制备

设计不含自身互补序列且能识别细菌特定核酸序列的寡核苷酸探针P1～P5，委托上海英俊生物技术公司进行制备和5’端生物素标记，寡核苷酸探针序列如下：P1：5’-生物素-cgaacgtataca ggaagaagc-3’(大肠杆菌)；P2：5’-生物素-atcttcggcagctatacgctatc-3’(绿脓杆菌)；P3：5’-生物素-cttctctgatgttagcaaggcg-3’(金黄色葡萄球菌)；P4：5’-生物素-taacaggacat gccgcatgg-3’(结核杆菌)；P5：5’-生物素-gttgatagcgcaggacattaag-3’(肺炎链球菌)。

3、多种一端量子点标记的寡核苷酸探针的制备

在浓度为0.1mol/L、pH为8.0的PBS中，将链霉亲和素标记的CdTe/CdSe量子点溶液与5’端生物素标记的寡核苷酸探针溶液通过生物素-链霉亲和素的特异性结合进行偶联，室温下避光反应24小时，制得5’端CdTe/CdSe量子点标记的寡核苷酸探针溶液，采用层析柱进行分离纯化。按照上述方法，将寡核苷酸探针P1～P5与发射不同波长荧光的5种CdTe/CdSe量子点进行偶联(不同序列的寡核苷酸探针对应发射不同波长荧光的量子点)，制得5种5’端CdTe/CdSe量子点标记的寡核苷酸探针溶液。

4、多种一端量子点标记的寡核苷酸探针在固相支持物表面的固定

先将玻片表面标记上生物素，充分洗涤玻片去除未结合的生物素后，再在玻片表面每间隔一定距离分别滴加5种5’端CdTe/CdSe量子点标记的寡核苷酸探针溶液形成点阵(本实施例共设50个点，每种寡核苷酸探针溶液各10个点)，室温下避光反应3小时，利用生物素-链霉亲合素的特异性结合将寡核苷酸探针通过量子点固定在玻片表面，用pH为8.0的PBS洗涤玻片3次，晾干，即得多靶标量子点标记核酸芯片，置温度4℃保存，备用。

二、多靶标量子点标记核酸芯片的检测

1、一端荧光猝灭基团标记的待测核酸样品的制备

(1)待测核酸样品的制备

采用酚-氯仿抽提法提纯细菌(大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、结核杆菌或肺炎链球菌)基因组DNA：取菌液1mL，3500r/min离心弃上清，细菌沉淀用TE缓冲液(pH8.0)200μL重悬，再加入质量百分浓度为10％的十二烷基硫酸钠120μL，轻轻混匀，置温度60℃水浴30分钟后，加入等体积的酚-氯仿(1∶1)，轻轻混匀，12000r/min离心10分钟，取上清，加入无水乙醇0.25体积和浓度为5mol/L的醋酸钾0.1体积，12000r/min离心10分钟，取上清，加入冰冷的无水乙醇2体积，20℃静置30分钟后，12000r/min离心10分钟，弃上清，沉淀用70％乙醇洗2次，无水乙醇洗1次，干燥后加入适量TE(pH8.0)溶解，备用。

设计并合成如下通用引物：F：5’-aaactcaaaggaattgacgg-3’；R：5’-gacgggcggtgtgtacaa-3’。

以细菌基因组DNA为模板，引物F和R为上、下游引物进行PCR扩增，反应体系为：10×buffer 2.5μL、25mmol/L的MgCl₂ 3μL、10mmol/L的dNTP0.5μL、74μmol/L的引物F和R各0.085μL、5U/μL的Taq酶0.1μL、模板1μL、双蒸水补足体积至25μL；反应条件为：94℃预变性5分钟，然后94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，70℃延伸1分钟，共40个循环；将所得PCR产物作为待测核酸样品。

(2)待测核酸样品的一端荧光猝灭基团标记

用TDT酶(末端转移酶)催化Cy5-dCTP在待测核酸样品突出的3′端进行非模板依赖性的加尾反应，反应体系为：5×反应缓冲液2μL，待测核酸样品6μL，TDT酶终浓度为0.5U/μL，Cy5-dCTP终浓度为40μmol/L，总体积为10μL；温度37℃反应2小时，即制得3′端Cy5标记的待测核酸样品。

此外，待测核酸样品的荧光猝灭基团标记也可以进行无需PCR的直接标记法，但该法对DNA含量的要求较高。无需PCR的直接标记法为：将细菌裂解后采用消化酶消化，再按上述(2)所述方法进行标记。

2、一端荧光猝灭基团标记的待测核酸样品与寡核苷酸探针的杂交

将3’端Cy5标记的待测核酸样品与杂交液(由5×SSC、质量百分浓度为0.1％的SDS、1×Denhardt试剂和0.1μg/μL的鲑精DNA组成)按体积比为1∶5混合，取混合液各10μL分别滴加至多靶标量子点标记核酸芯片表面的5种寡核苷酸探针点，每种寡核苷酸探针同时设2个复点，再将该核酸芯片置杂交盒中，温度60℃反应10小时，杂交反应后的核酸芯片依次置洗液A(由1×SSC和质量百分浓度为0.2％的SDS组成)、洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中各洗涤数次，再置温度37℃干燥，避光保存。

3、FRET信号的检测

用激光共聚焦扫描仪GenePix 4000扫描杂交反应后的多靶标量子点标记核酸芯片，获得分析精度为10μm的16位TIFF图像，扣除背景后，荧光强度以每种寡核苷酸探针2个复点的均值表示，并绘制荧光猝灭程度与特定核酸序列浓度的关系曲线。结果显示，当寡核苷酸探针P1～P5和其对应核酸序列杂交后，量子点与荧光猝灭基团之间彼此靠近并发生FRET，使量子点的荧光猝灭，且荧光猝灭程度与特定核酸序列浓度呈正比。

实施例3

一、多靶标量子点标记核酸芯片的制备

1、多种发射不同波长荧光且链霉亲和素标记的量子点的制备

(1)多种发射不同波长荧光的量子点的制备

将CdCl₂·2.5H₂O溶于高纯水中，加入巯基乙酸，用浓度为1mol/L的NaOH溶液调节pH至10.2，通氮气30分钟后，在搅拌条件下加入新制的无氧NaHTe溶液(由Te粉与NaBH₄反应制得)，回流反应，通过控制回流反应时间，分别制得发射荧光波长为510nm、525nm、545nm、565nm、585nm、605nm且表面修饰有羧基的6种CdTe量子点溶液；在CdTe量子点溶液中加入适量异丙醇以降低CdTe量子点的溶解度，再于10000r/min离心30分钟，弃上清，得纯化的CdTe量子点。

运用双光束紫外可见分光光度计和荧光光度计检测所得CdTe量子点的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱；运用透射电子显微镜和电子衍射图判断所得CdTe量子点的径力分布和衍射环的情况；根据上述检测结果对量子点的制备反应条件(PH值、摩尔比、回流反应时间等)进行优化。

(2)多种量子点的链霉亲和素标记

在浓度为0.1mol/L、pH为8.5的PBS中，加入表面修饰有羧基的CdTe量子点0.6mg和浓度为8.7g/L的EDC 250μL，混匀，再加入链霉亲和素0.12mg，室温下搅拌反应3小时后，上Sephadex G100层析柱，用浓度为0.1mol/L、pH为7.4的PBS洗脱，得纯化的链霉亲和素标记的CdTe量子点溶液；采用竞争抑制反应法检测链霉亲和素标记后的生物活性。按照上述方法，对发射不同波长荧光的6种CdTe量子点进行链霉亲和素标记，分别制得链霉亲和素标记的6种CdTe量子点溶液。

2、多种一端生物素标记、另一端荧光猝灭基团标记的分子信标的制备

针对6种耐药结核杆菌(TB)的基因突变位点：耐利福平(RFP)TB核糖核酸聚合酶亚单位(rpoB)基因的第506～534位；耐链霉素(SM)TB核糖体蛋白S12编码基因(rpsl)的第43、88位、16S rRNA编码基因(rrs)；耐异烟肼(INH)TB katG基因的第315、463位；耐乙胺丁醇(EMB)TB embB的第285、303、306、330位；耐吡嗪酰胺(PZA)TB吡嗪酰胺酶(pncA)基因；耐氟喹诺酮(FQ)TB DNA促旋酶A亚单位编码基因(gyrA)；采用软件Beacon Designer、DNAstar等分别设计分子信标P1～P6，并采用软件Insight进行分子信标的分子模拟，判断茎环结构中5’、3’端两个分子间的最小距离和最大距离，分析FRET效率；设计的分子信标委托生物技术公司进行制备和5’端生物素标记、3’端DABCYL标记。

3、多种一端量子点标记、另一端荧光猝灭基团标记的分子信标的制备

在浓度为0.1mol/L、pH为8.0的PBS中，将链霉亲和素标记的CdTe量子点溶液与5’端生物素标记、3’端DABCYL标记的分子信标溶液通过生物素-链霉亲和素的特异性结合进行偶联，室温下避光反应24小时，制得5’端CdTe量子点标记、3’端DABCYL标记的分子信标溶液，采用层析柱进行分离纯化。按照上述方法，将分子信标P1～P6与发射不同波长荧光的6种CdTe量子点进行偶联(不同序列的分子信标对应发射不同波长荧光的量子点)，制得6种5’端CdTe量子点标记、3’端DABCYL标记的分子信标溶液。

4、多种一端量子点标记、另一端荧光猝灭基团标记的分子信标在固相支持物表面的固定

先将玻片表面标记上生物素，充分洗涤玻片去除未结合的生物素后，再在玻片表面每间隔一定距离分别滴加6种5’端CdTe量子点标记、3’端DABCYL标记的分子信标溶液形成点阵(本实施例共设36个点，每种分子信标溶液各6个点)，室温下避光反应3小时，利用生物素-链霉亲和素的特异性结合将寡核苷酸探针通过量子点固定在玻片表面，用pH为8.0的PBS洗涤玻片3次，晾干，即得多靶标量子点标记核酸芯片，置温度4℃保存，备用。

二、核酸芯片的检测

1、待测核酸样品的制备

从痰液或血清标本中分离出结核杆菌(H37RV或耐RFP/SM/INH/EMB/PZA/FQ菌株)，采用蛋白酶K加表面活性剂法进行裂解，再采用Chaotrop-silica法提取结核杆菌基因组DNA：用二氧化硅吸附裂解菌体释放出的DNA，吸附DNA后的二氧化硅用70％乙醇洗涤、干燥、温度55℃双蒸水洗脱，得结核杆菌基因组DNA。

针对结核杆菌的插入序列IS6110，采用Beacon Designer软件设计引物F和R，设计原则是在保证能检出所有结核杆菌的前提下尽量避免其他分子杆菌属的DNA分子的干扰，设计结果经blast比对。

以结核杆菌基因组DNA为模板，以引物F和R为上、下游引物进行多重PCR扩增，反应体系为：PCR缓冲液5μL、0.4mmol/L的dNTP 0.5μL、MgCl₂ 10μL、1OD/20μL的引物F0.5μL、1OD/20μL的引物R0.5μL、100mmol/L的模板2μL、TaqE1μL、双蒸水补足体积至50μL；反应条件为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒、65℃退火1分钟、72℃延长1分钟，共35个循环；最后94℃变性30秒，72℃延伸1分钟，将所得PCR产物作为待测核酸样品。

2、待测核酸样品与分子信标的杂交

将待测核酸样品与杂交液(由5×SSC、质量百分浓度为0.1％的SDS、1×Denhardt试剂和0.1μg/μL的鲑精DNA组成)按体积比为1∶5混合，取混合液各10μL滴加至多靶标量子点标记核酸芯片表面的6种分子信标点，每种分子信标同时设2个复点，再将该核酸芯片置杂交盒中，温度60℃反应10小时，杂交反应后的核酸芯片依次置洗液A(由1×SSC和质量百分浓度为0.2％的SDS组成)、洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中各洗涤数次，温度37℃干燥，避光保存。

3、FRET信号的检测

将杂交反应后的多靶标量子点标记核酸芯片正面朝上置于荧光显微镜载物台上，以可见光找到点样点并聚焦清晰，预热荧光管后转换荧光观察，选择适宜激发波长观察点样点荧光，打开光路通道开关，打开显微镜图像记录软件spot，选择相应参数，预览图像后照像保存并进行数据分析。结果显示，当分子信标和其特定核酸序列杂交后，分子信标的茎环结构打开，量子点与荧光猝灭基团之间彼此远离而不发生FRET，使量子点的荧光恢复，且荧光恢复程度与特定核酸序列浓度呈正比。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110>中国人民解放军第三军医大学第一附属医院

<120>多靶标量子点标记核酸芯片及其制备方法和检测方法

<160>15

<210>1

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸探针序列P1

<400>1

agattacaat cattgc                                  16

<210>2

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸探针序列P2

<400>2

agattactat cattgc                                  16

<210>3

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸探针序列P3

<400>3

agattaccat cattgc                                      16

<210>4

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸探针序列P4

<400>4

agattacgat cattgc                                      16

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物序列F1

<400>5

cacattttct acaaccatgg agacc                           25

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物序列R1

<400>6

tttatacctg tccccaccag attc                         24

<210>7

<211>36

<212>DNA

<213>智人(homo sapiens)

<220>

<223>序列的描述：核酸序列D1

<400>7

gttggagaca gcaatgatcg taatctcttc cattct                     36

<210>8

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：核酸序列D2

<400>8

gttggagaca gcaatgattg taatctcttc cattct                     36

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸探针序列P5

<400>9

cgaacgtata caggaagaag c                                     21

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸探针序列P6

<400>10

atcttcggca gctatacgct atc                                   23

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸探针序列P7

<400>11

cttctctgat gttagcaagg cg                                    22

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸探针序列P8

<400>12

taacaggaca tgccgcatgg                                       20

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸探针序列P9

<400>13

gttgatagcg caggacatta ag                                    22

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物序列F2

<400>14

aaactcaaag gaattgacgg                            20

<210>15

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物序列R2

<400>15

gacgggcggt gtgtacaa                              18

Claims (10)

1、多靶标量子点标记核酸芯片，其特征在于：包括固相支持物和固定在固相支持物表面的寡核苷酸探针阵列，所述寡核苷酸探针阵列由至少两种不含自身互补序列的寡核苷酸探针组成，所述寡核苷酸探针的一端标记量子点并通过量子点固定在固相支持物的表面，不同序列的寡核苷酸探针用发射不同波长荧光的量子点标记。

2、根据权利要求1所述的多靶标量子点标记核酸芯片，其特征在于：所述量子点选自MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、ZnO、ZnS、ZnSe、ZnTe、SrS、SrSe、SeTe、CdS、CdSe、CdTe、BaS、BaSe、BaTe、HgS、HgSe、HgTe、PbSe、CaAs、InP、InAs、InCaAs、ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdS/ZnS、CdS/Ag₂S、CdS/HgS、CdS/HgS/CdS、CdS/PbS、CdS/Cd(OH)₂、CdSe/CuSe、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdSe/CdS、CdSe/HgSe、CdSe/HgSe/CdSe、CdSe/HgTe、CdTe/HgS、CdTe/HgTe、InAs/ZnSe、InAs/CdSe、InAs/InP、ZnS:Mn、ZnS:Cu、CdS:Mn和CdS:Cu中的任一种，以及以上述任一种为核、二氧化硅为壳的核壳型量子点。

3、权利要求1所述的多靶标量子点标记核酸芯片的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、制备至少两种发射不同波长荧光且链霉亲和素标记的量子点；

b、制备至少两种不含自身互补序列且一端生物素标记的寡核苷酸探针；

c、将步骤b所得一端生物素标记的寡核苷酸探针与步骤a所得链霉亲和素标记的量子点通过生物素-链霉亲和素的特异性结合进行偶联，不同序列的寡核苷酸探针对应发射不同波长荧光的量子点，制备至少两种一端量子点标记的寡核苷酸探针；

d、将固相支持物的表面用生物素标记，再利用生物素-链霉亲和素的特异性结合将步骤c所得至少两种一端量子点标记的寡核苷酸探针通过量子点固定至固相支持物的表面，且每种寡核苷酸探针同时固定多个至形成阵列，即得核酸芯片。

4、权利要求1所述的多靶标量子点标记核酸芯片的检测方法，包括以下步骤：

a、制备一端荧光淬灭基团标记的待测核酸样品；

b、将步骤a所得一端荧光淬灭基团标记的待测核酸样品分别与核酸芯片表面的至少两种寡核苷酸探针进行杂交反应，当寡核苷酸探针和待测核酸样品中的特定核酸序列杂交后，量子点和荧光猝灭基团彼此靠近并发生FRET；

c、以一定波长的激发光照射杂交反应后的核酸芯片，通过杂交前后各量子点荧光强度的变化同时进行待测核酸样品中至少两种特定核酸序列的检测。

5、根据权利要求4所述的多靶标量子点标记核酸芯片的检测方法，其特征在于：所述荧光淬灭基团选自5-FAM、6-FAM、FITC、罗丹明B、罗丹明101、罗丹明123、罗丹明640、罗丹明6G、RRX、TAMRA、TRITC、Alexa350、Alexa488、Alexa555、Alexa568、Alexa594、Alexa647、Alexa680、Cy2、Cy3、Cy5、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、LC-Red640、LC-Red705、TR、AMCA、DABCYL、SYBR Green和纳米金中的任一种。

6、多靶标量子点标记核酸芯片，其特征在于：包括固相支持物和固定在固相支持物表面的寡核苷酸探针阵列，所述寡核苷酸探针阵列由至少两种分子信标组成，所述分子信标的一端标记量子点并通过量子点固定在固相支持物的表面，不同序列的分子信标用发射不同波长荧光的的量子点标记，另一端标记荧光猝灭基团。

7、根据权利要求6所述的多靶标量子点标记核酸芯片，其特征在于：所述量子点选自MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、ZnO、ZnS、ZnSe、ZnTe、SrS、SrSe、SeTe、CdS、CdSe、CdTe、BaS、BaSe、BaTe、HgS、HgSe、HgTe、PbSe、CaAs、InP、InAs、InCaAs、ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdS/ZnS、CdS/Ag₂S、CdS/HgS、CdS/HgS/CdS、CdS/PbS、CdS/Cd(OH)₂、CdSe/CuSe、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdSe/CdS、CdSe/HgSe、CdSe/HgSe/CdSe、CdSe/HgTe、CdTe/HgS、CdTe/HgTe、InAs/ZnSe、InAs/CdSe、InAs/InP、ZnS:Mn、ZnS:Cu、CdS:Mn和CdS:Cu中的任一种，以及以上述任一种为核、二氧化硅为壳的核壳型量子点。

8、根据权利要求6所述的多靶标量子点标记核酸芯片，其特征在于：所述荧光淬灭基团选自5-FAM、6-FAM、FITC、罗丹明B、罗丹明101、罗丹明123、罗丹明640、罗丹明6G、RRX、TAMRA、TRITC、Alexa350、Alexa488、Alexa555、Alexa568、Alexa594、Alexa647、Alexa680、Cy2、Cy3、Cy5、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、LC-Red640、LC-Red705、TR、AMCA、DABCYL、SYBR Green和纳米金中的任一种。

9、权利要求6所述的多靶标量子点标记核酸芯片的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、制备至少两种发射不同波长荧光且链霉亲和素标记的量子点；

b、制备至少两种一端生物素标记、另一端荧光猝灭基团标记的分子信标；

c、将步骤b所得一端生物素标记、另一端荧光猝灭基团标记的分子信标与步骤a所得链霉亲和素标记的量子点进行偶联，不同序列的分子信标对应发射不同波长荧光的量子点，制备至少两种一端量子点标记、另一端荧光猝灭基团标记的分子信标；

d、将固相支持物的表面用生物素标记，再利用生物素-链霉亲和素的特异性结合将步骤c所得至少两种一端量子点标记、另一端荧光猝灭基团标记的分子信标通过量子点固定至固相支持物的表面，且每种分子信标同时固定多个至形成阵列，即得核酸芯片。

10、权利要求6所述的多靶标量子点标记核酸芯片的检测方法，包括以下步骤：

a、将待测核酸样品分别与核酸芯片表面的至少两种分子信标进行杂交反应，当分子信标和待测核酸样品中的特定核酸序列杂交后，量子点和荧光猝灭基团彼此远离而不发生FRET；

b、以一定波长的激发光照射杂交反应后的核酸芯片，通过杂交前后各量子点荧光强度的变化同时进行待测核酸样品中至少两种特定核酸序列的检测。

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