CN102576026A - 利用生物芯片检测和量化目标物质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用生物芯片检测和量化目标物质的方法，所述生物芯片包括固定有探针分子的基板，更具体地，涉及一种利用生物芯片以肉眼检测目标物质的方法和量化目标物质的方法，所述方法包括下列步骤：准备包括固定有探针分子的基板的生物芯片；使生物芯片接触包括具有电荷的目标物质的样品；使所述目标物质与具有与其电荷相反的电荷的纳米粒子进行反应；及与金属增强溶液进行反应，以放大所述纳米粒子的尺寸。

Description

利用生物芯片检测和量化目标物质的方法
技术领域
本发明涉及一种利用生物芯片检测和量化目标物质的方法，该生物芯片包括固定有探针分子的基板，更具体地，涉及一种利用生物芯片以肉眼检测目标物质的方法以及量化目标物质的方法，其包括以下步骤：准备包括固定有探针分子的基板的生物芯片；使所述生物芯片接触包括具有电荷的目标物质的样品；使所述目标物质与具有与其电荷相反的电荷的纳米粒子进行反应；以及，与金属增强溶液(enhancing solution)进行反应，以放大所述纳米粒子的尺寸。
背景技术
生物芯片为，通过组合从生物中分离的生物有机物(例如，酶、蛋白质、抗体、DNA(脱氧核糖核酸)、微生物或动植物细胞及器官、神经细胞及器官)和无机物(例如，半导体或玻璃)，以现有的半导体芯片的形式制成的混合器件(Hybrid device)。所述生物芯片的特征在于，通过活用生物分子的固有功能并模仿生物的功能，诊断传染性疾病或分析基因，起到用于处理新信息的新功能器件的作用。
根据与生物分子的系统化程度，生物芯片可以分为DNA芯片、RNA(核糖核酸)芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和神经元芯片。而且，作为一种广泛的定义，生物芯片包括如同芯片上的实验室(Lab on a chip)一样具有对各种生化物质的检测及分析功能的生物传感器(biosensor)，所述芯片上的实验室小型化集成了样品预处理、生化反应、检测和数据分析，因此具有自动分析功能。
此外，根据生物分子的检测方式，生物芯片可大致分为两种类型，第一种为微阵列类型，其利用捕获探针(capturing probe)探索包含于样品中的特定的生化物质。具体地，将能够用作捕获探针(capturing probe)的物质固定在芯片的表面，然后，与需要分析的生化物质进行反应后，通过检测及分析有无反应，可以获得生化物质的信息。第二种为利用微流体的生物芯片，在芯片上设置微通道、微室和混合阀，以控制微流体，将生化物质固定在检测单元后，利用微流体使需要检测的生化物质与固定在检测单元的生化物质进行反应，以检测有无反应。从长远来看，且根据最近的小型化趋势，这是研究最活跃的领域。
制造和利用生物芯片需要能够与反应物质反应的探针的固定技术、能够检测有无反应的检测技术、及能够处理检测到的信息的信息处理技术。
其中，能够检测有无反应的检测技术一般使用诸如荧光、比色和同位素等特定方式的标记。这种标记技术对提高检测灵敏度非常重要。但是，存在的问题是，标记可能会使生物分子变形，或低分子物质无法被标记。还存在的问题是，标记过程消耗大量的样品，并且需要进行2-3个更多的步骤，对于蛋白质而言，各种蛋白质之间的标记差异增加了量化误差。目前，具有代表性的标记方式是激光诱导荧光检测方法。激光诱导荧光检测方法是目前最流行的光学方法，其中，利用荧光物质标记样品，利用标记的荧光物质检测与固定在基板上的探针间有无反应。然而，这种方法还存在的问题是，为了检测有无反应，需要光学测量系统，这造成需要很多时间和成本，而且，这种检测方法还在基于生物芯片的分析系统的小型化方面具有一定的局限性。此外，需要附加利用荧光物质标记样品中的目标分子的步骤，相比非标记方式的检测方法具有较繁琐的缺点。
因此，在生物芯片技术领域对非标记方式的检测技术的需求日益增加。一种非标记方式的检测方法为电化学检测方法，其在某个探针和样品结合的电极上，利用其它的化学物质的电化学反应，检测有无反应，但是，相比荧光检测方法，这种方法具有相对较低的测量能力。
如上所述，传统的检测方法在效率方面有一定程度的限度，因此总是涉及在生化实践的应用中其可靠性和满意度极低的问题。
发明内容
本发明人为克服传统生物芯片需要昂贵的附加设备以及效率低的问题已做出很多努力。结果发现，当使与探针结合的目标DNA和金属纳米粒子进行结合，并且使其与金属增强溶液(enhancing solution)进行反应时，金属纳米粒子通过金属增强溶液被放大到肉眼可检测的程度，因此，无需附加设备，就可以进行非标记方式的检测，并且可以使用一般的扫描仪量化目标物质，从而完成了本发明。
本发明的一个目的为提供一种利用生物芯片检测目标物质的方法，所述方法包括下列步骤：(a)将探针分子固定在基板上；(b)使包括具有电荷的目标物质的样品接触固定有所述探针分子的基板；(c)使目标物质与具有与其电荷相反的电荷的纳米粒子进行反应；及(d)使其与金属增强溶液(enhancingsolution)进行反应。
本发明的另一个目的为提供一种利用生物芯片量化目标物质的方法，所述方法包括下列步骤：(a)将探针分子固定在基板上；(b)使包括具有电荷的目标物质的样品接触固定有所述探针分子的基板；(c)使目标物质与具有与其电荷相反的电荷的纳米粒子进行反应；(d)使其与金属增强溶液(enhancingsolution)进行反应；及(e)测量与金属增强溶液发生反应的区域的反应强度。
利用本发明的生物芯片检测目标物质的方法，无需传统的荧光检测方法所需要的荧光标记过程和昂贵的设备，允许通过肉眼直接观察及使用简单的扫描仪量化分析。
附图说明
图1示出根据本发明的生物芯片的制作和分析原理的示意图；
图2示出利用一般的荧光测量杂交的DNA的示意图；
图3示出利用光学扫描仪的根据本发明的杂交后的DNA的测量的示意图，其中，(a)为100nM H5DNA的反应，(b)为100nM HM DNA的反应；及
图4示出利用根据本发明的金属增强方法，灰度值根据DNA浓度变化的示意图。
具体实施方式
为了实现上述目的，在一种实施方式中，本发明涉及一种利用生物芯片检测目标物质的方法，所述方法包括下列步骤：(a)将探针分子固定在基板上；(b)使包括具有电荷的目标物质的样品接触固定有所述探针分子的基板；(c)使目标物质与具有与其电荷相反的电荷的纳米粒子进行反应；及(d)使其与金属增强溶液(enhancing solution)进行反应。
在本发明中，术语“生物芯片”一般是指在表面改性的各种固体(包括表面改性的高分子基板，例如：玻璃、硅、聚丙烯)的表面的指定位置上高密度附着生物材料(例如DNA、蛋白质和细胞)以形成的微阵列。
在所述步骤(a)，将探针分子固定在基板上的步骤中，对于基板类型的采用，只要是所属技术领域中通常使用的用于制造生物芯片的固体基板，就没有特别限制。优选地，所述固体基板可以为玻璃、氧化铝、陶瓷、碳、金、银、铜、铝、化合物半导体及硅，最优选地，可以使用玻璃基板。对所述基板进行表面改性是为了便于附着及固定探针分子。此外，可以进行表面改性以便包括用于将生物分子固定在生物芯片的基板表面的官能基。例如，所述基板可以利用醛基、羧基或胺基进行表面改性。至于玻璃基板或半导体基板的情况，可以利用硅烷进行处理以形成胺基(-NH3，-NH2等)。此外，为了有效地进行硅烷处理，在硅烷处理前，也可以进行用于制备羟基(-OH)的处理。鉴于本发明的目的，对将探针分子固定在基板上的方法没有特别的限制，可以使用化学或物理方法。
本发明中，术语“探针”指的是可以与样品中需要检测的目标物质特异性结合的物质，并且指的是通过上述结合可以特别地确认样品中目标物质的存在的物质。可以使用本领域内通常使用的任何探针作为探针分子，而没有限制，优选地，可以为PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)、肽、多肽、蛋白质、RNA或DNA，最优选地，为PNA。更具体地，所述探针可以包括从生物体衍生的生物分子或其类似物，或在生物体外制造的生物分子，例如，酶、蛋白质、抗体、微生物、动/植物细胞和器官、神经细胞、DNA及RNA，其中，DNA包括cDNA(互补DNA)、基因组DNA和寡核苷酸，RNA包括基因组RNA、mRNA(信使RNA)和寡核苷酸，蛋白质包括抗体、抗原、酶和肽。
在本发明的一种具体实施方式中，利用O2等离子处理玻璃基板的表面，以在玻璃基板的表面暴露-OH基，以及进行表面的胺基官能化，用羧基取代胺处理后的表面后，通过共价的肽键，将具有胺基(-NH2)的探针PNA固定在所述基板上。未与PNA结合的基板通过与具有胺基的PEG(聚乙二醇)反应被挡住，以防止背景染色(实施例1及2)。
所述步骤(b)，使包括具有电荷的目标物质的样品接触固定有所述探针分子的基板的步骤为，为检测能够与探针分子特异性结合的目标物质而进行接触的步骤。
本发明中，术语“目标物质”是指需要使用生物芯片检测在样品中的存在与否的物质，可以使用本领域内通常使用的任何物质，而没有限制，优选地，可以为PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)、肽、多肽、蛋白质、RNA或DNA，最优选地，为DNA。更具体地，所述目标物质可以包括从生物体衍生的生物分子或其类似物，或在生物体外制造的生物分子，例如，酶、蛋白质、抗体、微生物、动植物细胞和器官、神经细胞、DNA及RNA，其中，DNA包括cDNA、基因组DNA和寡核苷酸，RNA包括基因组RNA、mRNA和寡核苷酸，蛋白质包括抗体、抗原、酶和肽。
目标物质具有负电荷或正电荷，并且具有与发生反应的纳米粒子相反的电荷。因此，可以通过静电吸引与纳米粒子结合。
本发明中，术语“样本”包括具有需要检测的目标物质的组织、细胞、全血、血清、血浆、唾液、痰、脑脊液和尿液，但并不仅限于此。
当使包括目标物质的样品与固定有探针分子的基板接触时，样品中的目标物质与探针分子发生特异性结合反应。如果目标是PNA、LNA、RNA或DNA，互补序列之间发生特异性杂交。如果目标是蛋白质，发生通过样品蛋白质和探针之间的直接结合生成复合物的反应，或者，通过样品蛋白质的酶促反应，可能会发生包括探针的变形和改性的反应的结合。因此，目标物质蛋白质和探针分子的结合反应可以包括蛋白质和生物分子之间的结合反应(例如：抗原-抗体反应和配体-受体反应)或蛋白质和生物分子之间的底物-酶反应。
在本发明的一种具体实施方式中，通过使固定在基板上的PNA与包括具有互补序列的目标DNA的样品接触，进行特异性杂交(实施例3)。
所述步骤(c)，使目标物质与具有与其电荷相反的电荷的纳米粒子发生反应的步骤为，使与探针特异性结合的目标物质与纳米粒子反应并结合的步骤。
所述纳米粒子为具有与目标物质的电荷相反的电荷的纳米粒子，可以使用本领域内通常使用的任何纳米粒子，而没有限制。优选地，所述纳米粒子可以为金、银或铂，最优选地，为金纳米粒子。
在一种较佳的实施方式中，可以通过静电结合进行目标物质与具有相反电荷的纳米粒子的反应。
在本发明的一种具体实施方式中，在基板上固定能够检测目标DNA的探针PNA，并且使用阻断分子封闭不与探针PNA反应的区域，以减少非特异性反应。当使需要分析的目标DNA进行反应时，其与具有互补序列的探针PNA发生特异性反应，并且通过DNA的磷酸基具有的负电荷使芯片的表面带负电荷。此时，未与DNA发生反应的PNA不具有负电荷，因此表面不具有任何电荷。在使目标DNA进行反应后，当使其与具有正电荷的金属纳米粒子反应时，通过静电结合，纳米粒子结合至和PNA特异性结合的DNA，纳米粒子不会结合到未发生DNA杂交的区域。
在本发明的一种优选实施方式中，可以通过生物结合进行具有与目标物质的电荷相反的电荷的纳米粒子的反应。
在本发明的一种优选实施方式中，可以通过化学结合进行具有与目标物质的电荷相反的电荷的纳米粒子的反应。
所述步骤(d)，与金属增强溶液发生反应的步骤为放大与目标物质结合的纳米粒子的尺寸，以便用肉眼检测目标物质，其中，所述目标物质与探针特异性结合。
本发明中，术语“金属增强溶液”指的是包括金属离子的溶液，其通过还原作为催化剂的金属纳米粒子周围的金属离子，放大纳米粒子的尺寸。只要可以放大纳米粒子的尺寸，可以使用本领域中通常使用的任何金属增强溶液，而没有限制。优选地，可以为包括金(Au)、银(Ag)、铜(Cu)、铂(Pt)或钯(Pd)离子的溶液，最优选地，可以使用含有金离子的溶液。
在本发明的一种具体实施方式中，使具有正电荷的5nm金纳米粒子进行反应，并且使金属增强溶液进行反应1分钟。因此，由于金离子的还原，金纳米粒子被金属包围，上述粒子的尺寸增加。因此，与DNA结合的区域显示灰色，并且用肉眼可以观察到。具体地，与PNA特异性反应的区域显示深灰色，并且非特异性反应的区域显示浅灰色或没有颜色(如图3所示)。因此，根据本发明的方法，在没有利用荧光物质标记目标物质或探针分子，或没有附加的光学设备或荧光扫描仪的情况下，可以通过肉眼利用生物芯片检测目标物质。
在另一种实施方式中，本发明涉及一种利用生物芯片量化目标物质的方法，所述方法包括下列步骤：(a)将探针分子固定在基板上；(b)使包括具有电荷的目标物质的样品接触固定有所述探针分子的基板；(c)使目标物质与具有与其电荷相反的电荷的纳米粒子进行反应；(d)使其与金属增强溶液进行反应；及(e)测量与金属增强溶液发生反应的区域的反应强度。
所述步骤(a)至(d)与上述方法相同。
所述步骤(e)，测量与金属增强溶液发生反应的区域的反应强度的步骤为用于量化存在于样品中的目标物质的步骤。
因为随着样品中存在的目标物质的浓度增加，金属增强溶液中反应区域的反应强度增加，因此，可以量化目标物质，并且可以利用一般的光学扫描仪进行分析。
在本发明的一种具体实施方式中，确认到随着目标DNA的浓度从1pM增加至100nM，灰点变得更深、更大。用一般扫描仪拍照后，利用Adobe Photoshop软件以灰度级分析得到的结果为，随着目标DNA的浓度的增加，灰度值也增加。反之，确认到在未与目标DNA结合的周围基板上，与浓度无关，显示恒定值(如图4所示)。因此，可以使用一般扫描仪和软件进行目标DNA的量化分析。
实施例
下文，通过实施例将更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明性的目的，不应解释为本发明的范围受限于这些实施例。
实施例1：玻璃基板的处理
使用食人鱼洗液(piranha solution)清洗玻璃基板，并且用O2等离子处理，以在玻璃基板的表面暴露-OH基。所述玻璃基板与在乙醇溶液中准备的2％APTES(氨丙基三乙氧基硅烷)反应2小时。反应2小时后，用乙醇清洗表面，且干燥后，在120℃的热板上烘烤1小时，以利用胺对玻璃基板的表面进行官能化。使所述基板浸入在DMF(二甲基甲酰胺)溶剂中的1M丁二酸酐(succinicanhydride)溶液中一晚上而对基板进行进一步改性，接着清洗所述基板，以利用羧基(-COOH)取代玻璃基板的胺基。
实施例2：生物芯片的制作
以图1所示的顺序制作芯片。首先，使EDC/NHS反应15分钟后，使50μM的由NH2-O-AATGGTTTATTCTGCTCA(下文称为“H5”)组成的PNA(肽核酸，Panagene，韩国)和50μM的由NH2-O-GACATCAAGCAGCCATC(下文称为“HM”)组成的对照组PNA反应1小时，以将探针PNA固定在实施例1中准备的玻璃基板上。为了封闭没有固定PNA的区域，使在末端具有胺的1mMPEG(聚乙二醇)反应1小时，以制作附着有探针的生物芯片。
实施例3：与目标DNA的特异性杂交反应
为了确认实施例2中制作的附着有探针的生物芯片和目标DNA之间的特异性杂交反应，在PBST中稀释具有与探针H5PNA互补的SEQ ID No.1序列TGAGCA GAA TAA ACC ATT的目标DNA(Bioneer，韩国)及具有SEQ ID No.2序列GAT GGC TGC TTGATG TC的对照物，以在各浓度分别进行杂交反应。
实施例4：与目标DNA的特异性杂交反应的放大及测量
为了放大及测量与目标DNA的特异性杂交反应，利用PBST和PBS缓冲液清洗实施例3中发生杂交反应的生物芯片，以去除未反应的DNA。此后，使具有正电荷的5nm金纳米粒子反应30分钟后，利用PBST和PBS缓冲液清洗，然后，与金属增强溶液(Nanoprobes，USA)反应1分钟。此后，利用水清洗进行杂交反应后的生物芯片，分析特异性杂交反应。
结果，可以用肉眼确认到仅在与目标DNA发生特异性杂交反应的区域生成灰点(如图3所示)。图3示出利用一般扫描仪获取的在玻璃基板上形成的点。在图3(a)中，通过将目标DNA与探针H5特异性结合形成灰点。在图3(b)中，通过将对照DNA与对照HN特异性结合形成灰点。在不互补的探针PNA和目标DNA中没有观察到点或者点不明显。因此，此结果示出，特异性地发生本发明的杂交反应，通过静电吸引力，金纳米粒子结合到发生杂交反应后的探针PNA和目标DNA的结合，并利用引起还原反应的金属增强溶液进行处理的情况下，通过使用作为催化剂的金纳米粒子还原金属离子，增加粒子尺寸，从而在没有附加光学设备的条件下，可以用肉眼检测所述点。
利用Adobe Photoshop软件，以灰度值量化分析在目标DNA的各浓度获得的点(如图4所示)。如图所示，可以确认随着浓度从1pM增加至100nM，灰度值增加。相反，可以确认未与目标物质结合的周围基板上，与浓度无关地，为背景染色。
Figure IPA00001530293400011

Claims (12)

1.一种利用生物芯片检测目标物质的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)将探针分子固定在基板上；
(b)使包括具有电荷的目标物质的样品接触固定有所述探针分子的基板；
(c)使所述目标物质与具有与所述目标物质的电荷相反的电荷的纳米粒子进行反应；及
(d)与金属增强溶液进行反应。
2.一种利用生物芯片量化目标物质的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)将探针分子固定在基板上；
(b)使包括具有电荷的目标物质的样品接触固定有所述探针分子的基板；
(c)使所述目标物质与具有与所述目标物质的电荷相反的电荷的纳米粒子进行反应；
(d)与金属增强溶液进行反应；及
(e)测量与所述金属增强溶液发生反应的区域的反应强度。
3.如权利要求1所述的方法，其中，检测目标物质的所述方法是利用肉眼进行的。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述步骤(a)中的所述基板为选自由玻璃、氧化铝、陶瓷、碳、金、银、铜、铝、及硅所构成的组中的任意一种基板。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述步骤(a)中的所述探针分子为选自由PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)、肽、多肽、蛋白质、RNA及DNA所构成的组中的任意一种分子。
6.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述步骤(b)中的所述目标物质是选自由PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)、肽、多肽、蛋白质、RNA及DNA所构成的组中的任意一种物质。
7.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述步骤(c)中的所述纳米粒子为金(Au)、银(Ag)或铂(Pt)。
8.如权利要求1或2所述的方法，其中，通过静电结合进行所述步骤(c)中的所述纳米粒子的反应。
9.如权利要求1或2所述的方法，其中，通过生物结合进行所述步骤(c)中的所述纳米粒子的反应。
10.如权利要求1或2所述的方法，其中，通过化学结合进行所述步骤(c)中的所述纳米粒子的反应。
11.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述步骤(d)中的所述金属增强溶液通过还原金属离子，放大所述步骤(c)中反应后的纳米粒子的尺寸。
12.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述步骤(d)中的所述金属增强溶液包括金(Au)、银(Ag)、铜(Cu)、铂(Pt)或钯(Pd)离子。
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