CN107014781A - 利用插层剂的基于局域表面等离子体共振的高灵敏度适体传感器 - Google Patents

利用插层剂的基于局域表面等离子体共振的高灵敏度适体传感器 Download PDF

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Abstract

本发明一实施例的适体传感器包括：基板，形成有金属纳米粒子；适体，附着于上述金属纳米粒子的表面，与待检测的目标物质选择性地进行反应来形成结构体；以及插层剂，当上述适体与目标物质进行反应时，向上述适体与目标物质之间插入并凝聚到上述金属纳米粒子侧，从而使基于局域表面等离子体共振现象的吸收光谱的移动增加。根据本发明的适体传感器，可通过增加目标物质的感应范围来大大增加灵敏度和探测范围。

Description

利用插层剂的基于局域表面等离子体共振的高灵敏度适体传 感器
技术领域
本发明涉及适体生物传感器，更详细地，涉及利用灵敏度得到提高的局域表面等离子体共振现象的适体传感器。
背景技术
快速测定活体分子的技术与生物传感器的开发的基础研究一同被认识为在医疗现场也不可缺少的技术。目前，通过人类基因组的分析更加鲜明地显示出基因组和疾病的关系，在医疗现场需要既简单又更加清楚的基因诊断，正进行着基于上述基因诊断的技术开发。众所周知，分析活体分子自身的相互作用是非常重要，但是，观察纳米级别的活体分子是很困难的。因此，最近，为了观察在纳米级别的空间所产生的现象，对通过结合如金属纳米粒子的表面等离子体光子学(plasmonics)纳米材料与活体分子来观察的光学生物传感器的研究逐渐增加。这是因为，随着纳米技术的发展，可抑制如金属纳米粒子的表面等离子体光子学纳米材料。表面等离子体光子学纳米材料不仅作为单纯的光学材料来使用，而且还被期待作为生物传感器分析的工具来使用。
若向如金属纳米粒子等存在于局部表面的材料照射具有多种波长的光，则与块状金属不同地，在金属纳米粒子的表面产生极化现象，呈现增大电磁场的强度的特异性质。通过极化形成的电子形成集体(等离子，plasmon)，在金属纳米粒子的表面进行局部性振动，将这种现象称为局域表面等离子体共振(localized surface plasmon resonance：LSPR)。针对这种现象，很久以前就开始由Mie等进行了理论性计算和预测，但最近，随着纳米加工技术的发展，发表了与多种传感器进行结合的有用的研究结果。
与表面等离子共振(surface plasmon resonance：SPR)同样地，局部表面等离子体共振光学特性对在纳米粒子附近所产生的电容率变化，即，折射率变化的应答灵敏，因此能够以比较高的灵敏度对活体分子的相互作用进行简单的分析。
因此，以局域表面等离子体共振光学特性作为检测原理，在单生物芯片上固定多种配体，相比于以往的生物芯片，可同时分析多重检测对象，因此，也可以进行在非标识生物芯片中所需要的现场监测(on-site monitoring)。
另一方面，光学表面等离子共振(SPR)现象产生在富含电子的金属膜，相反地，局域表面等离子体共振现象产生在电子量比较受限制的纳米级别的金属粒子的表面，因此金属内电子的振动弱，且因电子的振动而产生的电磁场的大小也小。因小的电磁场而导致可感应物质的范围减小，最终，导致可感应目标物质的灵敏度下降。尤其，当测定分子量小的低分子物质时，电磁场所受的影响小，从而在灵敏度方面明显受到限制。因此，当测定低分子物质时，需要提高灵敏度的技术。
上述作为背景技术来说明的内容用于更加理解本发明的背景，不应认定为，属于本发明所属技术领域的普通技术人员已知的现有技术。
发明内容
发明要解决的问题
本发明为了解决上述问题而提出，本发明的目的在于，提供如下的适体传感器，即，通过使基于借助适体和目标物质的结合发生变化的金属纳米粒子的局域表面等离子体共振现象的吸收光谱的变化量增加，来使灵敏度得到提高。
用于解决问题的方案
为了实现上述目的，本发明一实施例的适体传感器包括：基板，形成有金属纳米粒子；适体，附着于上述金属纳米粒子的表面，与待检测的目标物质选择性地进行反应来形成结构体；以及插层剂(intercalation agent)，当上述适体与目标物质进行反应时，向上述适体与目标物质之间插入并凝聚到上述金属纳米粒子侧，从而使基于局域表面等离子体共振现象的吸收光谱的移动增加
上述金属纳米粒子可为金、铂或银。
上述插层剂可为小檗碱。
由上述目标物质和上述适体形成的结合体可为G-四链体结构(G-quadruplexstructure)。
上述目标物质可为赭曲霉素A(OTA)或黄曲霉毒素B1(AFB1)。
可检测上述目标物质的范围可为1pM～10μM。
发明的效果
根据本发明的适体传感器，可通过增加目标物质的感应范围来大大增加灵敏度和探测范围。尤其，在将小檗碱作为插层剂来使用的情况下，以往的1nM～1μM的感应范围增加至1pM～10μM的范围，在灵敏度方面，增加了约1000倍。
附图说明
图1为简单示出本发明一实施例的适体传感器的示意图。
图2为示出基于插层剂的种类的适体传感器的局域表面等离子体共振吸收光谱的红移量的曲线图。
图3为示出基于本发明一实施例的适体传感器的小檗碱的存在与否的局域表面等离子体共振吸收光谱的红移量的曲线图。
具体实施方式
在此所使用的专业术语仅用于提及特定实施例，并不意图限定本发明。若文句不是表示与其明显相反的意思，则在此所使用的单数形式也包括复数形式。在说明书中所使用的“包括”意味着对特定特性、区域、整数、步骤、动作、要素和/或成分进行具体化，并不排除存在或附加其他特定特性、区域、整数、步骤、动作、要素、成分和/或组。
若没有其他定义，则包括在此所使用的技术术语及科技术语的所有术语的意思与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的意思相同。还被解释为，通常所使用的词典中定义的术语具有符合相关技术文献和目前所公开的内容的意思，若没有定义，则不被解释为理想的或非常原则性的意思。
以下，参照附图对本发明的优选实施例的适体传感器进行说明。
表面等离子体共振现象产生在富含电子的金属膜，相反地，局域表面等离子体共振现象产生在电子量比较受限制的纳米级别的金属，因此金属内电子的振动弱，且因电子的振动而产生的电磁场的大小也小。因小的电磁场而导致可感应目标分子的探测范围减小，最终，导致可感应目标物质的灵敏度下降。尤其，在测定分子量小的物质的情况下，电磁场所受的影响小，从而在灵敏度方面有所限制。
本发明人为了提高如上所述的灵敏度而反复进行实验得知，在由形成在金属纳米粒子的表面的适体和目标物质形成的G-四链体结构的结合体以更接近金属纳米粒子侧的方式凝聚的情况下，基于金属纳米粒子的局域表面等离子体共振现象的吸收光谱的移动量增加，由此，适体传感器的灵敏度得到提高。因此，考虑到这种现象，当通过结合适体与目标物质来形成G-四链体结构的结合体时，为了增大金属纳米粒子的表面的折射率变化而导入插层剂，以使上述结合体还可与额外的分子相结合，从而完成本发明。
图1为简单示出本发明一实施例的适体传感器的示意图。如图1所示，本发明一实施例的适体传感器可包括基板、适体、插层剂。基本上，金属纳米粒子形成于基板。作为如上所述的金属纳米粒子，可使用可引起局域表面等离子体共振现象的金属粒子，可使用金、银或铂粒子。在本实施例中，将金纳米粒子形成为小棒形态(金纳米棒，GNR)并导入玻璃基板。在金纳米棒的表面固定有可通过与待检测的目标物质(target)选择性地进行反应来形成结构体的适体。适体相当于其本身具有稳定的三级结构且具有对目标物质呈现高亲和性和可与目标物质特异性结合的特征的单链核酸(DNA、RNA或修饰的核酸)。可在适体之间形成Poly-T3链，以可在适体之间形成规定的空间。当由适体和目标物质形成结合体时，这些Poly-T3链起到维持规定的空间的作用。作为在本实施例中使用的适体，使用赭曲霉素A适体(5’-SH-TTTTTGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA，SEQ ID NO:1)和黄曲霉毒素B1适体(5’-SH-TTTTTGTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA，SEQ ID NO:2)，但根据待检测的目标物质，可进行多种变化。并且，当适体与目标物质相结合来形成结合体时，使用插层剂，以使更多的分子可凝聚到上述结合体。优选地，作为如上所述的插层剂，使用小檗碱(berberine)。当借助目标物质固定在金纳米棒的表面的适体形成G-四链体结构的结合体时，插层剂附着于上述金纳米棒的表面，因此金纳米棒周围的电磁场受到影响，从而导致吸光度波长变化的幅度增大。
通过实验例更详细地说明本发明。
1.金纳米棒的合成
通过种子生长法来合成可在本发明中使用的金纳米棒。简单说，为了制备种子溶液，在0.1M的溴化十六烷基三甲铵(CTAB，cetyltrimethylammonium bromide)溶液中混合0.125mL的0.01M的HAuCl4、0.3mL的0.01M的NaBH4，在30℃的温度下维持2小时。另一方面，混合33.04ml的0.1M的溴化十六烷基三甲铵、1.4ml的0.01M的HAuCl4、0.21ml的0.01M的AgNO3及0.21ml的0.1M的抗坏血酸来制备生长溶液。向生长溶液中投入0.14ml的种子溶液后，在30℃的温度下反应3小时。通过96孔板酶标仪(96well plate reader，Infinite M200pro，TECAN Group，Ltd.，Switzerland)来获取金纳米棒溶液的紫外可见吸收光谱(UV/vis)。通过高分辨透射电子显微镜(HR-TEM，JEM-2100，JEOL Ltd.，Japan)来测定大小和长宽比(aspect ratio)。确认到金纳米棒的长度为35.85±3.27nm，宽度为11.17±1.03nm，显示出3.21的平均长宽比和均匀的分布。
2.金纳米棒基板的制作
通过如下所述的方法来制作附着有在本发明中使用的金纳米棒的基板。在65℃的温度下，在食人鱼洗液(H2SO4：H2O2＝3：1)中清洗载玻片(10mm×25mm×0.7mm)30分钟。为了形成胺表面，利用去离子水(DI water)和乙醇来清洗上述载玻片，在室温条件下，在乙醇2％的3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS，(3-aminopropyl)trimethoxysilane)溶液中浸渍1小时。在37℃的温度下，在N，N-二甲基甲酰胺(DMF，N，N-dimethylformamide)中利用1M的琥珀酰酐处理形成有胺的载玻片8小时，利用去离子水清洗。利用50mN的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和25mM的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)来处理经琥珀酰酐处理的载玻片10分钟，从而执行酰胺键形成反应，在去离子水中利用0.1M的盐酸半胱胺(cyteaminehydrochloride)溶液来进行浸渍处理。最终，使经硫醇(thiol)处理的载玻片暴露于分散有金纳米棒的溶液20小时后，为了去除金纳米棒的溴化十六烷基三甲铵，以10000rpm的速度离心分离15分钟，并进行3次。
3.适体结合过程
以1：1或1：2的体积比混合分别对赭曲霉素A(ochratoxin A)和黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1)具有反应性的两种适体和相同浓度的PolyT3。各个低聚核苷酸的初始浓度为10μM，低聚核苷酸混合物的最终体积维持20μL。为了分离在低聚核苷酸的5’末端结合的硫醇基的二硫键，使低聚核苷酸混合物与5mM的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP，tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride)进行反应。通过一同处理低聚核苷酸的被激活的硫醇基和0.1M的甘氨酸缓冲(pH：3.0)溶液，使上述低聚核苷酸的被激活的硫醇基固定于金纳米棒基板的表面。利用去离子水清洗后，在25℃的温度下，通过在固定有适体的金纳米棒基板的表面一同处理赭曲霉素A、黄曲霉毒素B1、小檗碱和150μl的结合缓冲溶液(20mM的tris-HCl、100mM的NaCl、10mM的KCl、10mM的MgCl2，pH：7.2)30分钟，并以能够使目标物质与适体相结合的方式培养。在没有小檗碱的情况下，也同样执行如上所述的方法。
4.局域表面等离子体共振(LSPR)信号检测
适体经处理的金纳米棒基板固定在透明的96孔板。将包含目标分子和5μM的小檗碱的150μl的结合缓冲溶液涂敷于所固定的基板上。在25℃的温度下进行反应30分钟后，在650nm至900nm的波长范围内测定吸收光谱。
首先，通过如上所述的方法来测定吸收光谱，为了确认基于对G-四链体结构的结合亲和度的信号增强效果，使用小檗碱(berberrine：BB)、硫磺素T(thioflavin T：TFT)、结晶紫(crystal violet：CV)、噻唑橙(thiazole orange：TO)、孔雀绿(malachite green，MG)及锌原卟啉(Zn-PPix)等共6种插层剂。将插层剂与目标物质及结合缓冲溶液一同涂敷于固定有适体的金纳米棒基板，并进行反应30分钟，测定基于追加的局域表面等离子体共振的吸收光谱的红移。在本实验例中使用的插层剂的分子结构如下。(参照表1)
表1
图2为示出基于插层剂的种类的适体传感器的局域表面等离子体共振吸收光谱的红移量的曲线图。如图2所示，可确认由各插层剂产生了局域表面等离子体共振移动(LSPRshift)。其中，可知由小檗碱产生了约5.5nm的局域表面等离子体共振移动，是产生了最多量的吸收光谱的红移，并且，可知小檗碱更加凝聚到通过适体和目标物质的结合来形成的G-四链体结构的结合体，从而灵敏度的提高最为优秀。
并且，改变作为目标物质的赭曲霉素A和黄曲霉毒素B1的浓度后，对存在作为插层剂的小檗碱的情况下的适体传感器的局域表面等离子体共振移动和不存在作为插层剂的小檗碱的情况下的适体传感器的局域表面等离子体共振移动进行比较。图3为示出基于本发明一实施例的适体传感器的小檗碱的存在与否的局域表面等离子体共振吸收光谱的红移量的曲线图。如图3所示，可确认在存在小檗碱的情况下，可检测到的最小浓度为0.001nM，并且，可知整体检测区域扩张至为0.001nM～10μM的浓度范围。
如上所述，本发明的适体传感器具有如下的优点，即，通过导入插层剂来使基于金属纳米粒子的局域表面等离子体共振现象的吸收光谱的红移量增加，从而也可以检测非常少量的目标物质。
以上，参照附图说明了本发明的实施例，但可理解为，在不变更本发明的技术思想或必要特征的情况下，本发明所属技术领域的普通技术人员能够以其他具体的形式来实施。
因此，应理解为，在以上记述的实施例在所有方面上为例示本发明而不是限定本发明。本发明的范围是通过后述的发明要求范围来表现，而不是通过上述详细说明来表现，应解释为，从发明要求范围的意义、范围以及其等同概念导出的所有变更和被变更的形式包括在本发明的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 光州科学技术院
<120> 利用插层剂的基于局域表面等离子体共振的高灵敏度适体传感器
<130> I43659GIL
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tttttgatcg ggtgtgggtg gcgtaaaggg agcatcggac a 41
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tttttgttgg gcacgtgttg tctctctgtg tctcgtgccc ttcgctaggc ccaca 55

Claims (6)

1.一种适体传感器，其特征在于，包括：
基板，形成有金属纳米粒子；
适体，附着于上述金属纳米粒子的表面，与待检测的目标物质选择性地进行反应来形成结构体；以及
插层剂，当上述适体与目标物质进行反应时，向上述适体与目标物质之间插入并凝聚到上述金属纳米粒子侧，从而使基于局域表面等离子体共振现象的吸收光谱的移动增加。
2.根据权利要求1所述的适体传感器，其特征在于，上述金属纳米粒子为金、铂或银。
3.根据权利要求1所述的适体传感器，其特征在于，上述插层剂为小檗碱。
4.根据权利要求1所述的适体传感器，其特征在于，由上述目标物质和上述适体形成的结合体为G-四链体结构。
5.根据权利要求1所述的适体传感器，其特征在于，上述目标物质为赭曲霉素A或黄曲霉毒素B1。
6.根据权利要求1所述的适体传感器，其特征在于，能够检测上述目标物质的范围为1pM～10μM。
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