CN105241845A - 一种实时监测g-四联体形成的单颗粒spr探针的制备和应用 - Google Patents

一种实时监测g-四联体形成的单颗粒spr探针的制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种实时监测G-四联体形成的单颗粒SPR探针的制备和应用。基于贵金属(金、银等)纳米颗粒的良好的生物相容性、大比表面积和SPR高灵敏性，采用可与钾离子特异结合的端粒Aptamer对贵金属纳米颗粒进行表面修饰，简单、方便的构建了可高灵敏检测钾离子并实时监测G-四联体形成过程的单颗粒生物探针。特异性结合的整个过程可以通过暗场显微镜(DFM)和散射光谱仪联用下的单个贵金属纳米颗粒的SPR光谱峰移动量来表征。此探针具有实时检测的功能，且检测速度快，灵敏度高，检测范围宽等优点。此外，可通过数据拟合分析得到形成G-四联体的解离常数Kd和吉布斯自由能ΔG，以及在形成过程中的两种结合位点形态。

Description

一种实时监测G-四联体形成的单颗粒SPR探针的制备和应用
本发明具体涉及一种可高灵敏检测钾离子、并实时监测G-四联体形成过程的方法，属于纳米材料生物应用领域。
背景技术
贵金属(金和银等)纳米颗粒在入射光照射下，界面的自由电子和光子发生共振运动形成等离子体共振效应。当金属纳米颗粒直径大于或近似于自由电子的平均自由程时，颗粒受激后将产生明显的散射现象，由于该现象主要发生在表面，因此被称为表面等离子共振(surfaceplasmonresonance,SPR)散射。研究发现，其散射光谱主要依赖于纳米颗粒的形状、大小以及颗粒和其周围环境的介电常数。纳米颗粒的形貌和尺寸的不同，将引起表面自由电子密度、电子震荡频率的变化，从而造成包括吸收和散射光学性质的变化。基于的SPR散射本身独特的光学性质，对基于SPR散射的纳米结构体系的研究已成为迅猛发展的热点研究领域之一，即表面等离子体光子学。表面等离子体光子学包含非常广泛的研究内容,例如表面电场增强光谱、表面增强拉曼光谱、表面等离子体纳米波导、表面等离子体光催化、表面增强的能量转移及选择性光吸收等，尤其是表面等离子共振生物传感已经成为重要的分支之一，该方法是在单颗粒上实现单分子水平检测的有效手段。目前基于纳米等离子体界面微环境的折射率变化、生物分子分布以及纳米颗粒间或复合物颗粒核-壳间强烈的耦合作用，并结合暗场显微镜与光谱仪的优势，可以在纳米尺度开发出具有极高灵敏度的单分子水平的生物探针、新型的生物成像试剂或治疗试剂。
G-四联体是一种特殊的核酸二级结构，广泛存在于人类基因组DNA以及RNA中，如DNA的端粒序列、基因的启动子序列、RNA的5'端非翻译区(5'UTR)序列等。许多研究发现，G-四联体结构在基因的稳定性、端粒合成过程、基因转录和翻译水平的表达调控、基因重组等生命过程中起着至关重要的作用。富含鸟苷酸的DNA或者RNA在单价阳离子，如Na+、K+、NH4 +、Rb+等存在的条件下，均能形成稳定的G-四联体二级结构。4个鸟嘌呤碱基通过氢键的配对方式形成G-4平面，适当的阳离子可以使多个G-4平面堆叠形成G-四联体结构。阳离子中体积最适合嵌入G-四联体结构的是K+，K+对G-四联体的稳定作用最为显著，而真核细胞内往往具有相对较高的钾离子浓度，因而提示在细胞内的钾离子作用下，有利于G-四联体的形成，并发挥生物学效应。
目前，检测钾离子的方法有很多，例如：荧光法、电化学法、比色法等，但是这些检测方法所依据的探针因为尺寸和灵敏度的问题，在应用中有很大的局限性。
发明内容
为了得到高灵敏的小尺寸钾离子探针，本发明设计了基于单个贵金属纳米颗粒的SPR探针，实现了高灵敏检测钾离子并实时监测G-四联体形成过程的功能，此SPR探针的测定过程的实现了无标记，检测速度快，灵敏度高，检测范围宽等优点。
制备过程如下：
1、一种实时监测G-四联体形成的单颗粒SPR探针的制备
首先，用种子生长法合成≈50nm的金纳米颗粒，采用如下方法制备:
步骤1.合成颗粒
(1)种子合成
在反应瓶中加入100mMCTAB(aq)和10mMHAuCl4(aq)，在磁力搅拌器上搅拌使其混合均匀，将冰水浴过的现配10mM的NaBH4(aq)快速加到CTAB和HAuCl4的混合溶液中，溶液瞬间由黄色变成棕色；将得到的种子溶液在28℃水浴中保温3h。
(2)30nm金球的合成
在反应瓶中加入200mMCTAC(aq)和0.01M的HAuCl4(aq)混合之后用磁力搅拌使溶液均匀；100mM新配制的抗坏血酸溶液迅速加进混合溶液，之后黄绿色的溶液瞬间变成无色透明溶液；搅拌均匀后快速加入步骤1的棕色的金种子溶液，整个溶液慢慢变为亮红色透明胶体；在36℃水浴中保温1h。
(3)合成AuAg核壳纳米立方体
在反应瓶中加入3mL的30nm金纳米颗粒的溶液和0.2MCTAC溶液，混合均匀后加入抗坏血酸溶液，然后将反应瓶中在60℃恒温水浴中保温，10mM的硝酸银溶液以0.5mL/10min速度在加液泵辅助下滴加到恒温60℃反应瓶中，在水浴中恒温静置4h之后离心处理。
步骤2.制备纳米探针:
将ITO玻璃浸泡在大小约50nmAuAg核壳纳米颗粒溶液中，通过物理吸附作用将AuAg核壳纳米立方体固定在ITO基底上；然后将200μL的Aptamer(5’-TTTTTTTTTTGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTTTTTTTTT-3’-(CH2)6–SH)滴在ITO玻璃上，放在37℃的摇床中；分别固定不同时间，用超纯水冲洗掉表面多余的Aptamer。如图1所示是1nM的Aptamer修饰AuAg纳米颗粒2.5h的实时SPR光谱峰值移动图。结果得到Aptamer的最佳修饰浓度0.5-10nM，最佳修饰时间1-4h。
2、一种实时监测G-四联体形成的单颗粒SPR探针的应用，对钾离子的检测：
1)在制备的探针上分别滴加180μL不同浓度的钾离子溶液，通过采集SPR散射光谱数据，得到1h时探针在不同浓度的钾离子作用下的SPR光谱的峰值与时间之间的关系曲线如图2所示，钾离子10-7-10-2M不同浓度的作用下在1h动态平衡时的SPR光谱的峰值，分别是15.3nm，14.748nm，13.98nm，10.747nm，6.67nm，2.81nm。以及SPR光谱的峰移动量与钾离子浓度之间的关系如图3所示。钾离子溶液的浓度为10-9-10-2M是S型曲线；其中在10-7-10-4M范围内具有良好的线性关系，最低检测限达到1nM。
2)数据分析
用公式(1)：拟合该探针在不同浓度的钾离子的影响下的SPR光谱的峰值与时间之间的关系曲线，得到25℃时G-四联体解离常数Kd；钾离子的浓度0.1μM–0.1mM，分别对应的n值分别是0.89，1.27，1.37，1.49，1.87，2.01，G-四联体形成过程中可分为两种结合位点形态；用公式(2):(3)：(4)：ΔG＝-RTlnKep，分析SPR光谱的峰移动量与钾离子浓度之间的关系，得到不同浓度的钾离子与ΔG的线性关系如图4所示，钾离子浓度与ΔG具有良好的线性关系。用公式(5)ΔG＝ΔGH2O-mCK+拟合图4得到在形成稳定G-四联体结构时候的吉布斯自由能ΔG。
有益效果
本次研究将AuAg核壳结构纳米颗粒和Aptamer组装成可高灵敏检测钾离子的生物探针，并实时监测G-四联体形成过程。此探针对钾离子的特异性结合的整个过程可以通过暗场显微镜(DFM)和散射光谱仪联用下的单个贵金属纳米颗粒的SPR光谱峰移动量来表征。此探针具有实时检测的功能，且检测速度快，灵敏度高，检测范围宽等优点。此外，可通过数据拟合分析得到形成G-四联体的解离常数Kd和吉布斯自由能ΔG，以及在形成过程中的两种结合位点形态。
附图说明
图1是本发明中本发明中Aptamer修饰AuAg纳米颗粒的实时SPR光谱峰值移动图。
图2是本发明中不同浓度的钾离子作用下的SPR光谱的峰值与时间之间的关系曲线图。
图3是本发明中SPR光谱的峰移动量与钾离子浓度之间的关系图。
图4是本发明中不同浓度的钾离子与ΔG的线性关系图,钾离子浓度与ΔG具有良好的线性关系。
具体实施方式
一、制备性能优异的SPR生物光学探针：
实施例1
将ITO玻璃浸泡在约50nm大小的AuAg核壳纳米颗粒溶液中，通过物理吸附作用将AuAg核壳纳米颗粒固定在ITO基底上；然后将200μL的1nM的Aptamer滴在ITO玻璃上，放在37℃的摇床中；1h后用超纯水冲洗掉表面多余的表面修饰剂，制备成检测钾离子的生物探针。
实施例2
制备性能优异的SPR生物光学探针：
将ITO玻璃浸泡在约50nm大小的AuAg核壳纳米颗粒溶液中，通过物理吸附作用将AuAg核壳纳米颗粒固定在ITO基底上；然后将200μL的1nM的Aptamer滴在ITO玻璃上，放在37℃的摇床中；2h后用超纯水冲洗掉表面多余的表面修饰剂，制备成检测钾离子的生物探针。
实施例3
制备性能优异的SPR生物光学探针：
将ITO玻璃浸泡在约50nm大小的AuAg核壳纳米颗粒溶液中，通过物理吸附作用将AuAg核壳纳米颗粒固定在ITO基底上；然后将200μL的1nM的Aptamer滴在ITO玻璃上，放在37℃的摇床中；4h后用超纯水冲洗掉表面多余的表面修饰剂，制备成检测钾离子的生物探针。
实施例4
制备性能优异的SPR生物光学探针：
将ITO玻璃浸泡在约50nm大小的AuAg核壳纳米颗粒溶液中，通过物理吸附作用将AuAg核壳纳米颗粒固定在ITO基底上；然后将200μL的1nM的Aptamer滴在ITO玻璃上，放在37℃的摇床中；8h后用超纯水冲洗掉表面多余的表面修饰剂，制备成检测钾离子的生物探针。
二、SPR生物光学探针对钾离子的高灵敏检测，并应用于实际样品的分析测定；
实施例1
对钾离子的检测及实时监测G-四联体形成过程的应用：
在制备的探针上分别滴加180μL的10-4μM钾离子的溶液，置于暗场显微镜下，调整显微镜，观察1h时Aptamer和钾离子的结合过程引发AuAg纳米颗粒的SPR光谱峰实时移动图如图2中10-4所示，以及移动量λ＝13.98nm。用公式(1)：拟合如图2中10-4所示的曲线，得到n＝1.49，以及Kd值。作图3中S型曲线的两条切线，λ1，λ2分别是14.8和1.15，λ＝13.98nm带入公式(2):得到fu＝0.07018。公式(3)：得到，Kep＝13.248，带入公式(4)：ΔG＝-RTlnKep，ΔG＝6.402kcalM-1。
实施例2
在制备的探针上分别滴加180μL的10-5μM钾离子的溶液，置于暗场显微镜下，调整显微镜，观察1h时Aptamer和钾离子的结合过程引发AuAg纳米颗粒的SPR光谱峰实时移动图如图2中10-4所示，以及移动量λ＝10.747nm。用公式(1)：拟合如图2中10-5所示的曲线，得到n＝1.37以及Kd值。作图3中S型曲线的两条切线，λ1，λ2分别是14.8和1.15，λ＝10.747nm带入公式(2):得到fu＝0.2963。公式(3)：得到，Kep＝2.368，带入公式(4)：ΔG＝-RTlnKep，ΔG＝2.137kcalM-1。
实施例3
在制备的探针上分别滴加180μL的10-6M钾离子的溶液，置于暗场显微镜下，调整显微镜，观察1h时Aptamer和钾离子的结合过程引发AuAg纳米颗粒的SPR光谱峰实时移动图如图2中10-6所示，以及移动量λ＝6.67nm。用公式(1)：拟合如图2中10-4所示的曲线，得到n＝1.27，以及Kd值。作图3中S型曲线的两条切线，λ1，λ2分别是14.8和1.15，λ＝6.67nm带入公式(2):得到fu＝0.6495。公式(3)：得到，Kep＝0.54，带入公式(4)：ΔG＝-RTlnKep，ΔG＝1.528kcalM-1。
实施例4
在制备的探针上分别滴加180μL的10-7M钾离子的溶液，置于暗场显微镜下，调整显微镜，观察1h时Aptamer和钾离子的结合过程引发AuAg纳米颗粒的SPR光谱峰实时移动图如图2中10-4所示，以及移动量λ＝2.81nm。用公式(1)：拟合如图2中10-7所示的曲线，得到n＝0.89，以及Kd值。作图3中S型曲线的两条切线，λ1，λ2分别是14.8和1.15，λ＝2.81nm带入公式(2):得到fu＝0.9045。公式(3)：得到，Kep＝0.1056，带入公式(4)：ΔG＝-RTlnKep，ΔG＝-5.57kcalM-1。

Claims (2)

1.一种实时监测G-四联体形成的单颗粒SPR探针的制备,包括合成颗粒(1)种子合成；(2)30nm金球的合成；(3)合成AuAg核壳纳米立方体，其特征在于，还包括制备纳米探针，具体为：
将ITO玻璃浸泡在大小约50nmAuAg核壳纳米颗粒溶液中，通过物理吸附作用将AuAg核壳纳米立方体固定在ITO基底上；然后将200μL的Aptamer(5’-TTTTTTTTTTGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTTTTTTTTT-3-(CH2)6–SH)滴在ITO玻璃上，放在37℃的摇床中；分别固定不同时间，用超纯水冲洗掉表面多余的Aptamer；在不同浓度的钾离子溶液中检测探针，测得不同移动量的SPR光谱峰值，结果得到Aptamer的最佳修饰浓度0.5-10nM，最佳修饰时间1-4h。
2.如权利要求1所述的一种实时监测G-四联体形成的单颗粒SPR探针的应用，其特征在于，对钾离子的检测：
1)在制备的探针上分别滴加180μL不同浓度的钾离子溶液，通过采集SPR散射光谱数据，得到探针在不同浓度的钾离子作用下的SPR光谱的峰值与时间之间的关系曲线，以及SPR光谱的峰移动量与钾离子浓度之间的关系图，钾离子溶液的浓度为10-9-10-2M是S型曲线；其中在10-7-10-4M范围内具有良好的线性关系，最低检测限达到1nM；
2)数据分析：
用公式(1)：拟合该探针在不同浓度的钾离子的影响下的SPR光谱的峰值与时间之间的关系曲线，得到25℃时G-四联体解离常数Kd；钾离子的浓度0.1μM–0.1mM，分别对应的n值分别是0.89，1.27，1.37，1.49，1.87，2.01，G-四联体形成过程中可分为两种结合位点形态；用公式(2):(3)：(4)：ΔG＝-RTlnKep，分析SPR光谱的峰移动量与钾离子浓度之间的关系，得到不同浓度的钾离子与ΔG的线性关系图，以及用公式(5)得到在形成稳定G-四联体结构的吉布斯自由能ΔG。
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