CN104237174A

CN104237174A - 一种基于单颗粒Au@Ag核壳结构的检测刀豆蛋白的方法

Info

Publication number: CN104237174A
Application number: CN201410349017.8A
Authority: CN
Inventors: 张磊; 范曲立; 王斌; 卢晓梅; 黄维
Original assignee: Nanjing Post and Telecommunication University
Current assignee: Nanjing Post and Telecommunication University; Nanjing University of Posts and Telecommunications
Priority date: 2014-07-21
Filing date: 2014-07-21
Publication date: 2014-12-24

Abstract

本发明提供了一种基于单颗粒AuAg核壳结构的检测刀豆蛋白的方法，将Au、Ag、Cu等金属纳米颗粒和蛋白质检测结合，利用Au、Ag、Cu等金属纳米颗粒的良好的生物相容性、大比表面积和高灵敏性，经过可以和刀豆蛋白特异性识别的甘露糖衍生物对纳米颗粒的生物相容性修饰，经过修饰的Au、Ag、Cd等金属及半导体纳米Au、Ag、Cu等金属纳米颗粒就成为了一个可以检测微量刀豆蛋白（ConA）的特异性生物探针，表面裸露甘露糖基就可以对溶液中存在的微量刀豆蛋白（ConA）进行特异性检测；甘露糖和刀豆蛋白的特异性识别、结合的整个过程可以通过暗场显微镜（DFM）下单颗粒Au、Ag、Cu等金属及半导体纳米颗粒的SPR光谱的变化表征出来。此方法具有速度快，灵敏度高，检测范围大，可实时检测等优点。

Description

一种基于单颗粒AuAg核壳结构的检测刀豆蛋白的方法

技术领域

本发明具体涉及一种溶液中微量刀豆蛋白的检测方法，属于纳米材料生物应用领域。

背景技术

金和银等贵金属纳米晶在入射光照射下，界面的导带电子和光子发生共振形成等离子体共振激元，大量等离子体激元的共振形成共振电磁场的现象被称为LSPR现象；当Au或Ag纳米颗粒表面的环境介质发生变化，会引起界面的折射率的变化，这种变化会改变Au或Ag纳米颗粒对入射光共振频率选择；基于本身的这种特殊的LSPR光谱性质，Au、Ag纳米颗粒受到了相当多的关注，国内外多个研究课题组已经可以用多种方法制备出纳米球，纳米棒，纳米圈，纳米立方体等拥有不同SPR性质的Au、Ag纳米粒子，并将它们广泛的应用于和光电子、催化、信息存储、化学生物传感和表面增强拉曼散射等相关的化学、生物、物理、医药和治疗学等多个领域内。由于Au、Ag纳米粒子自身良好的大比表面积、光谱性质、良好的生物相容性和受介质影响易发生改变的高灵敏性，已经被用来作为发展超灵敏度传感器和成像等方面的主要基础材料。Au或Ag纳米颗粒和生物分子的连接用于进行生物检测更是近十年来研究的热点；用MUA包覆的Au Nanorods吸附了streptavidin生物素之后LSPR吸收峰的位置发生变化实现了对这种特异性吸附的识别；用表面包裹抗体的Au纳米棒特异性连接抗原使Au纳米棒表面的折射率改变而引起LSPR吸收峰的移动，实现了对抗体-抗原体系的选择性吸附的观测；用S-mRNA包裹的Au 纳米颗粒特异性连接DNA可以在DFM（暗场显微镜）下观测到Au纳米颗粒的LSPR的移动，实现对细胞内遗传信息表达的监测；等等。Au、Ag纳米颗粒应用于SPR传感器的优势已经得到了广泛的认可。

糖蛋白（glycoprotein）是由寡糖和多肽链共价修饰连接而形成的一类重要生理活性物质,它广泛存在于细胞膜、细胞间质、血浆以及粘液中。糖蛋白中的糖链在维持蛋白质稳定、抵抗蛋白酶水解、防止抗体识别及参与肽链在内质网的折叠启动等方面发挥着重要作用,具有开关和调谐功能、激素功能、胞内转运功能、保护和促进物质吸收、参与血液凝固与细胞识别等,对于增殖的调控、受精、发生、分化以及免疫等生命现象,起着十分重要的作用。将Au、Ag纳米颗粒应用于生物体内糖蛋白的检测，对于研究人体的多种新陈代谢和生理机能的过程都有着十分积极的意义。

由于具有免标记性质和定量测定能力，基于贵金属纳米颗粒的表面等离子体共振传感方法对于检测蛋白质样品是很有效果的。大部分检测方法都面临着干扰精确度和测定过程中收集到的光学信号确定的定量结果这样的挑战。作为对比，表面等离子体共振传感方法可以实现定量和更加经得起检验来直接得到可以解释的数据结果。表面等离子体共振传感方法的测定过程的实现不需要依靠任何的标记，并且可以直接从贵金属纳米颗粒的表面等离子体共振光谱表征出来。再结合他们在小型化，可芯片化操作等优势，表面等离子体共振传感方法方法可以成为荧光标记，放射性标记等观测方法的更合适的替代品。

发明内容

将AuAg 核壳纳米立方体修饰在ITO基底上，在其表面修饰上2,2′-二硫二乙醇甘露糖衍生物，此时AuAg NC表面裸露的甘露糖端基可以用来和刀豆蛋白结合；AuAg-mannose就可以作为检测溶液中微量刀豆蛋白的生物探针。

本发明技术方案如下：

1、用种子生长法合成30nm的Au纳米颗粒，采用如下方法制备得到：

步骤1. 种子合成

在反应瓶中加入100 mM CTAB（aq）和10 mM HAuCl4（aq），在磁力搅拌器上中速搅拌使其混合均匀，将冰浴过的现配10 mM的NaBH4（aq）一次性迅速加入到CTAB和HAuCl4 的混合溶液中，溶液瞬间由黄色变成棕色；将得到的种子溶液在28℃水浴中保温3 h。

步骤2. 大粒径金球的合成

在反应瓶中加入200 mM CTAC（aq）和0.01 M 的HAuCl4（aq）混合之后用磁力搅拌使溶液均匀； 100 mM 的新配制的抗坏血酸溶液迅速加入到混合溶液，之后黄绿色的溶液瞬间变成无色透明溶液；搅拌均匀后一次性快速加入步骤1的棕色金种子溶液，整个溶液慢慢变为亮红色透明胶体；在36 ℃水浴中保温1 h后大粒径的金纳米颗粒。

2. 合成生物相容性好、形貌可控的AuAg 核壳纳米立方体，其采用如下方法制备得到：

在反应瓶中加入步骤2得到的金纳米颗粒的溶液和0.2 M CTAC溶液，混合均匀后加入抗坏血酸溶液，然后将反应瓶中在60℃恒温水浴中保温， 10 mM的硝酸银溶液以0.5 mL/20 min速度在加液泵辅助下滴加到恒温60 ℃反应瓶中，在水浴中恒温静置4 h之后离心处理。得到生物相容性好，形貌、粒径可控的AuAg 核壳纳米立方体。

3. 实现对AuAg 核壳纳米立方体的修饰和改性，采用如下方法实现：

AuAg 核壳纳米立方体溶液浸泡ITO玻璃将AuAg 核壳纳米立方体固定在ITO基底上；然后将ITO玻璃浸没于表面修饰剂溶液中进行对AuAg 核壳纳米立方体的修饰；一定时间后用超纯水冲洗掉表面多余的表面修饰剂。此次使用的表面修饰剂是2,2′-二硫二乙醇甘露糖衍生物。

4. 对刀豆蛋白的检测；其特征在于采用如下方法实现：

经过修饰的AuAg 核壳纳米立方体的ITO基底固定在暗场显微镜下，在基底上滴加刀豆蛋白的溶液，调整显微镜，观察甘露糖和刀豆蛋白的结合过程引发AuAg 核壳纳米立方体的LSPR性质发生改变，共振峰发生移动，这种变化可以在DFM（暗场显微镜）和光谱仪下表征出来。

5. 以上步骤3、4中使用的AuAg 核壳纳米立方体粒径从30-80 nm不等，都是通过2合成得到的。

6．以上步骤3中的甘露糖衍生物溶液的浓度从10^-10-10^-2 M。

7. 以上步骤4中的2,2′-二硫二乙醇甘露糖衍生物和刀豆蛋白的结合过程是通过暗场显微镜（DFM）帮助下采集AuAg NC的是SPR光谱实时变化表征出来的；观测的时间长度从1 min到4 h不等；光谱移动量从1 nm到100 nm。

有益效果

本发明将AuAg 核壳结构的纳米颗粒和蛋白质检测结合， AuAg纳米颗粒具有良好的生物相容性、大比表面积和高灵敏性，经过修饰的AuAg纳米颗粒就成为了一个可以检测微量刀豆蛋白（ConA）的特异性生物探针；此探针对刀豆蛋白的特异性识别、结合的整个过程可以通过暗场显微镜（DFM）下单颗粒AuAg 核壳结构的SPR光谱的变化表征出来。此探针具有速度快，灵敏度高，检测范围大，可实时检测等优点。

附图说明

图1是本发明在固定在ITO表面的单颗粒55 nm AuAg NC表面修饰2,2′-二硫二乙醇甘露糖衍生物时，AuAg NC的SPR光谱变化图。

图2是本发明中55 nm AuAg NC -2,2′-二硫二乙醇甘露糖衍生物和10^-8 M刀豆蛋白的结合过程是通过暗场显微镜（DFM）帮助下采集AuAg NC的是SPR光谱实时变化图。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细说明本发明。

实施例1

获得性能优异的SPR生物光学探针，实现对微量Con A的高灵敏检测，并应用于实际样品的分析测定；

步骤1：实现对AuAg 核壳纳米立方体的修饰和改性；

对刀豆蛋白的检测；经过修饰的AuAg 核壳纳米立方体的ITO基底固定在暗场显微镜下，在基底上滴加刀豆蛋白的溶液，调整显微镜，观察甘露糖和刀豆蛋白的结合过程引发AuAg 核壳纳米立方体的LSPR性质发生改变，共振峰发生移动，这种变化可以在DFM（暗场显微镜）和光谱仪下表征出来。

步骤2：步骤1中使用的AuAg 核壳纳米立方体粒径从55 nm左右。

步骤3：步骤1中甘露糖衍生物溶液的浓度从10^-2 M，修饰时间是0.5 h。如附图2中方形点线。

步骤4：步骤1中2,2′-二硫二乙醇甘露糖衍生物和刀豆蛋白的结合过程是通过暗场显微镜（DFM）帮助下采集AuAg NC的是SPR光谱实时变化表征出来的。观测的时间长度为1 h。

实施例2

步骤1：实现对AuAg 核壳纳米立方体的修饰和改性；

步骤2：步骤1中使用的AuAg 核壳纳米立方体粒径从55 nm左右。

步骤3：步骤1中甘露糖衍生物溶液的浓度从10^-2 M，修饰时间是1 h。如附图2中圆点线。

实施例3

步骤1：实现对AuAg 核壳纳米立方体的修饰和改性；

步骤2：步骤1中使用的AuAg 核壳纳米立方体粒径从55 nm左右；

步骤3：步骤1中甘露糖衍生物溶液的浓度从10^-2 M，修饰时间是1.5 h。如附图2中正三角线；

实施例4

步骤1：实现对AuAg 核壳纳米立方体的修饰和改性；

步骤2：步骤1中使用的AuAg 核壳纳米立方体粒径从55 nm左右。

步骤3：步骤1中甘露糖衍生物溶液的浓度从10^-2 M，修饰时间是2 h。如附图2中倒三角线。

Claims

1.一种基于单颗粒AuAg核壳结构检测刀豆蛋白的方法，其特征在于有以下步骤：

步骤1：合成一种用种子生长法合成30nm的Au纳米颗粒；

先合成3nm的金种子溶液，然后开始不断加入生长液直至粒径达到目标要求，在TEM下表征得到Au 纳米颗粒的形貌信息，粒径大小从5 nm-50 nm；

步骤2：合成生物相容性好、形貌可控的AuAg 核壳纳米立方体：

在Au胶溶液里不断加入硝酸银和抗坏血酸溶液为主的银生长液，得到Ag单质不断吸附在Au球表面，在表面活性剂的作用下形成粒径可控的AuAg 核壳纳米立方体，用Uv-vis、TEM等仪器进行表征测试；得到Au表面厚度从1 nm到30 nm Ag不等的粒径分布均匀的AuAg 核壳纳米立方体；

步骤3：将AuAg 核壳纳米立方体固定在ITO玻璃基基底上，通过浸泡实现对AuAg 核壳纳米立方体的修饰和改性；使用的表面修饰剂是2,2′-二硫二乙醇甘露糖衍生物；

步骤4：用步骤3处理过的AuAg 核壳纳米立方体，对在显微镜下对刀豆蛋白溶液进行检测。

2.根据权利要求1所述的一种基于单颗粒AuAg核壳结构的检测刀豆蛋白的方法，其特征在于，AuAg 核壳纳米立方体粒径从30-80 nm，通过步骤1、2、合成得到。

3.根据权利要求1所述的一种基于单颗粒AuAg核壳结构的检测刀豆蛋白的方法，其特征在于，甘露糖衍生物溶液的浓度为：10^-10-10^-2 M。

4.根据权利要求1所述的一种基于单颗粒AuAg核壳结构的检测刀豆蛋白的方法，其特征在于，刀豆蛋白溶液的溶液的浓度为：10^-10-10^-4 M。

5.根据权利要求1所述的一种基于单颗粒AuAg核壳结构的检测刀豆蛋白的方法，其特征在于，2,2′-二硫二乙醇甘露糖衍生物和刀豆蛋白的结合过程是通过暗场显微镜（DFM）帮助下采集AuAg NC的是SPR光谱实时变化表征出来；观测的时间长度从1 min到4 h；光谱移动量从1 nm到100 nm。