CN111965226B - 用于检测刀豆蛋白a的生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

用于检测刀豆蛋白a的生物传感器及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测刀豆蛋白A的生物传感器及其制备方法和应用，所述生物传感器采用MoS2场效应晶体管，MoS2场效应晶体管包括设置于基底上的MoS2半导体层，金纳米颗粒通过物理吸附于MoS2半导体层表面，β‑巯基乙胺通过Au‑S键连接于金纳米颗粒表面，甘露糖与β‑巯基乙胺的氨基共价键合构成甘露糖探针，甘露糖探针用于与刀豆蛋白A特异性结合。本发明的生物传感器可以免标记检测ConA，对ConA具有高的特异性，检测灵敏度高，为生物检测的大量、快速、准确重复检测奠定了一定的基础。

Description

用于检测刀豆蛋白A的生物传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，尤其涉及一种基于MoS2场效应晶体管的用于检测刀豆蛋白A的免标记生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
刀豆蛋白A(Concanavalin A，缩写ConA)是一种糖类结合蛋白质，又叫刀豆球蛋白A、伴刀豆球蛋白、刀豆素、刀豆凝集素，是一种植物血凝素，具有强力的促有丝分裂作用，有较好的促淋巴细胞转化反应的作用，其促淋巴细胞转化最适浓度为40-100μg/ml，能沉淀肝糖原，凝集羊、马、狗、兔、猪、大鼠、小鼠、豚鼠等动物及人红细胞。还能选择性激活抑制性T细胞(Ts)细胞，对调节机体免疫反应具有重要作用。
无机纳米场效应管(FET)生物传感器是一种基于无机半导体材料作为沟道的新型电子生物传感器装置，与传统的检测装置相比，该装置具有灵敏度高、选择性好、超快检测、极简单操作等特点。MoS2的高体表比、低噪声、良好的生物相容性等特点使其被广泛运用于构建FET生物传感器的生物分子检测。同时，由于MoS2存在直接带隙，基于MoS2的能带调控性更好，便于生物检测传感信息的提取。
但采用现有技术检测刀豆蛋白A需要标记，并且检测特异性不理想，检测灵敏度不高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种用于检测刀豆蛋白A的免标记生物传感器及其制备方法和应用，对豆蛋白A具有高的特异性，检测灵敏度高。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种用于检测刀豆蛋白A的生物传感器，所述生物传感器采用MoS2场效应晶体管，MoS2场效应晶体管包括设置于基底上的MoS2半导体层，金纳米颗粒通过物理吸附于MoS2半导体层表面，β-巯基乙胺通过Au-S键连接于金纳米颗粒表面，甘露糖与β-巯基乙胺的氨基共价键合构成甘露糖探针，甘露糖探针用于与刀豆蛋白A特异性结合。
进一步的，所述基底为表面有二氧化硅层的硅基底，所述MoS2半导体层上设置源、漏电极。
本发明提供的用于检测刀豆蛋白A的生物传感器的制备方法，包括下述的步骤：
S1.将金纳米颗粒溶液浸泡于MoS2场效应晶体管MoS2半导体层表面，使金纳米颗粒通过物理吸附于MoS2半导体层表面；
S2.将β-巯基乙胺溶液浸泡于MoS2半导体层表面，使β-巯基乙胺通过Au-S键连接于金纳米颗粒表面；
S3.将甘露糖溶液浸泡于MoS2半导体层表面，使甘露糖的醛基与β-巯基乙胺的氨基反应生成的席夫碱，形成甘露糖探针。
进一步的，S1是将金纳米颗粒溶液浸泡于MoS2半导体层表面静置0.8～1.2小时，然后用水冲洗并干燥。
进一步的，S2是将β-巯基乙胺溶液浸泡于MoS2半导体层表面6～12小时，然后用水冲洗并干燥。
进一步的，S3是将甘露糖溶液浸泡于MoS2半导体层表面静置2～4小时。
本发明提供的所述生物传感器在检测刀豆蛋白A中的应用，是将刀豆蛋白A溶液浸泡于MoS2半导体层表面进行反应，使刀豆蛋白A与甘露糖特异性结合，通过转移特性曲线的左移测量刀豆蛋白A的浓度。
进一步的，根据|△G|/G0和刀豆蛋白A浓度之间的线性关系进行刀豆蛋白A的定量检测，其中△G为与刀豆蛋白A反应前后源极和漏极之间的电导的变化量，G0为与刀豆蛋白A反应前VG＝5V的情况下源极和漏极之间的电导。
进一步的，|△G|/G0和刀豆蛋白A浓度CConA之间的线性关系为：|△G/G0|＝0.944logCConA+0.0934。
本发明原理为：在场效应晶体管MoS2沟道材料表面修饰金纳米颗粒，将金纳米颗粒溶液滴涂于MoS2半导体层，通过静电吸附作用吸附于沟道表面。滴涂β-巯基乙胺溶液于MoS2半导体层，通过Au-S键结合作为连接分子固定于金纳米颗粒表面，随后甘露糖通过C＝N双键与-NH2共价键合，在生物传感器沟道表面原位固定甘露糖探针。检测ConA时，滴加靶标ConA溶液于场效应晶体管生物传感器MoS2半导体层表面与甘露糖探针特异性结合，通过检测FET生物传感器的电信号变化来测定目标分子的含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的生物传感器可以免标记检测ConA，对ConA具有高的特异性，检测灵敏度高，为生物检测的大量、快速、准确重复检测奠定了一定的基础。
(2)本发明基于MoS2场效应晶体管的生物传感器中Au-S键和固定甘露糖探针的席夫碱化学性质相对稳定，器件电性能稳定，器件检测可重复性极高。
(3)本发明每一步修饰过程简便快捷，整个修饰、检测过程只需要几个小时而且其每一步修饰前后信号差异明显，测试结果显示，在100nM浓度下20分钟便有明显的信号差异。这便于检测修饰是否成功。
(4)由于大肠杆菌表面存在刀豆蛋白A，所以本发明可以用于大肠杆菌的检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明生物传感器的结构示意图；其中：1、ConA；2、甘露糖探针；3、金纳米颗粒；4、MoS2半导体层；5、源、漏电极；6、二氧化硅层；7、高掺杂硅；
图2为本发明生物传感器的表面修饰检测原理图；
图3为未修饰甘露糖的MoS2场效应晶体管器件的IDS-VG转移特性曲线(VDS＝0.1V)以及LogIDS-VG曲线；
图4为本发明不同栅压下场效应晶体管的IDS-VDS输出特性曲线；
图5为本发明每步修饰结束后场效应晶体管生物传感器的转移特性曲线(插图为修饰探针之后的晶体管转移特性曲线)；
图6为本发明每步修饰结束后场效应晶体管生物传感器的输出特性曲线(VG:5V)；
图7为本发明场效应晶体管生物传感器靶标检测结果转移特性曲线；
图8为本发明MoS2场效应晶体管生物传感器工作曲线；
图9为本发明甘露糖修饰的MoS2场效应晶体管生物传感器在人血清蛋白和BSA干扰下的ConA特异性测试。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
如图1，本发明采用的基于MoS2场效应晶体管器件包括MoS2半导体层4、源、漏电极5、二氧化硅层6、高掺杂硅7。高掺杂硅7作为基底，高掺杂硅7表面有氧化层，即二氧化硅层6，基底上设置MoS2半导体层4，MoS2半导体层4两侧设置源、漏电极5。基于MoS2场效应晶体管器件的制备可以采用现有技术，例如采用下述方法：
(1)根据实验条件绘制特定的光刻版图，进行掩膜版制作；
(2)使用传统机械剥离技术将MoS2片(使用金相显微镜选择相对较薄的MoS2片)转移在表面有SiO2层(厚度300nm)的硅片表面；
(3)以3000r/min旋涂正性光刻胶并烘干操作，通过紫外曝光将MoS2纳米片定位至电极处，利用先前制备的光刻掩膜版刻蚀电极图案，电极间距为8～10μm，刻蚀完成使用显影液进行显影处理45秒；
(4)随后将器件放置于蒸镀仪中蒸镀厚度为20nm的Cr电极作为粘附层，在Cr电极表面蒸镀厚度为100nm的金电极作为源漏电极；蒸镀结束后的器件使用丙酮和超纯水反复冲洗并用惰性气体干燥处理。
实施例1：用于检测刀豆蛋白A的生物传感器的制备
金纳米颗粒制备：500mL带回流冷凝搅拌装置的三口瓶，用王水(浓盐酸(HCl)和浓硝酸(HNO3)按体积比为3:1组成的混合物)反复冲洗三次，然后使用蒸馏水和超纯水分别进行冲洗；在烧瓶中加入50mL超纯水，再加入0.5mL且浓度为1％的HAuCl4(四氯金酸)溶液，加热至沸腾之后将温度控制在93度左右，快速搅拌下加入3mL且浓度为1％的Sodium Citrate(柠檬酸钠)，继续搅拌三十分钟，移去热源，自然冷却搅拌至室温，所得金纳米颗粒溶液为鲜艳的酒红色，贮存于棕色试剂瓶并放入冷藏保存。
甘露糖储备液配制：用0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(Na2HPO4-NaH2PO4，PBS，含0.1mol/L的NaCl，pH 7.40)配制甘露糖储备液，4℃环境中静置24小时后即可使用。
将基于MoS2场效应晶体管器件进行表面修饰制成用于检测刀豆蛋白A的生物传感器，反应原理如图2，制备过程按以下步骤进行：
(1)在场效应晶体管MoS2半导体层表面滴加制备好的20nm的金纳米颗粒(AuNPs)溶液，在室温下浸泡于MoS2半导体层表面静置1小时后用去离子水反复冲洗，使用惰性气体干燥，AuNPs通过静电吸附作用吸附于MoS2表面。
(2)使用10mM的β-巯基乙胺溶液浸泡于MoS2半导体层表面静置过夜，实现Au-S键的自组装结合并衍生出另一端的-NH，反应结束后使用去离子水反复冲洗并使用惰性气体干燥。
(3)使用5mM的甘露糖溶液浸泡于MoS2半导体层表面静置3小时，实现甘露糖的醛基与-NH反应生成的席夫碱进行自组装修饰，探针被成功固定于器件MoS2半导体层表面。
经上述反应形成如图1的结构，金纳米颗粒3物理吸附于MoS2半导体层表面，甘露糖探针2通过β-巯基乙胺与金纳米颗粒3相连接。本发明将大量甘露糖探针分子固定在场效应晶体管表面，与ConA样品分子杂交，将难于检测到的化学信号转变为可感应的电信号，做到免标记检测ConA。
图3上方曲线显示该器件电流范围跨越5个数量级，证明其具有良好的Ion/Ioff特性。图3下方曲线表明MoS2器件具有典型的N型半导体特征，Vth(取栅压对应的最小电导，门电压)左移，表明器件沟道处的MoS2表面吸附了杂质使其发生了P型掺杂。
图4VG增大，IDS也随之增大，说明该器件对栅压的变化存在极其灵敏的特性，证明该器件对测试分析物同样具有极其灵敏的特性。
图5N型MoS2 FET修饰AuNPs之后Vth向右移，所以表明AuNPs的修饰对MoS2进行了N型掺杂。同理，β-巯基乙胺的修饰进行了N掺杂，而修饰过D-Mannose后Vth相对于MoS2/AuNPs/β-巯基乙胺向左移，说明D-Mannose修饰对器件沟道进行P掺杂。插图为修饰完D-Mannose之后的转移特性曲线，曲线表明修饰之后的器件性能符合晶体管特性。
图6为每步修饰之后所测得输出特性曲线，表现不同修饰物对探针的掺杂。
实施例2：用实施例1制备的生物传感器检测刀豆蛋白A
ConA的活化：使用1.0mmol/L的Ca2+(CaCl2)，Mn2+(MnCl2)活化6小时，保存于4℃环境中备用。
ConA储备液：使用0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液(Na2HPO4-NaH2PO4，PBS，含0.1mol/L的NaCl，pH 7.40)配制ConA储备液。
滴加ConA溶液于实施例1制备的生物传感器MoS2半导体层表面与甘露糖结合位点进行特异性反应，对FET进行电信号检测。靶ConA与甘露糖探针特异性结合会对MoS2起P掺杂作用。当MoS2发生P掺杂时，测得的特征曲线会发生左移，ConA的检测就可以通过检测装置的IDS-VG曲线的左移进行测量。
实施例3：将实施例1制备的生物传感器进行灵敏度测试实验
冲洗液：使用含有0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液(Na2HPO4-NaH2PO4，PBS，含0.1％(v/v)Tween20，pH 7.40)作为冲洗液。
生物传感器灵敏度测试按照以下步骤进行：将不同浓度的靶ConA浸泡于已修饰探针的MoS2场效应晶体管半导体层表面反应20min；ConA反应结束使用冲洗液和去离子水冲洗除去未反应的ConA，并且使用惰性气体干燥。
结合图7，可以看到传感器的Vth随着ConA溶液浓度从100nM到1mM逐渐向上偏移；通过标准化的计算方法，得到|△G|/G0，△G即不同浓度ConA反应前后对于G源极和漏极之间的电导的变化量，G0被定义为与ConA反应前在栅电压VG＝5V的情况下源极和漏极之间的电导。
结合图8，可以看到G的变化率随ConA浓度的变化关系。线性关系为：|△G/G0|(％)＝0.944logCConA(nM)+0.0934。
由此本发明的生物传感器被成功制备，且该生物传感器电导会随ConA浓度的增加而增加，该变化呈现良好的线性(R2＝0.9902)；代入线性方程，得到MoS2晶体管生物传感器检测ConA的最低检测限为105nM。
实施例4：将实施例1制备的生物传感器进行特异性测试实验
为了研究该MoS2场效应晶体管生物传感器对ConA的选择性，选择了75mg/mL人血清蛋白、670mg/mL(10mM)牛血清蛋白(BSA)以及255μg/mL(10μM)的ConA溶液分别进行转移特性曲线测试分析。
研究分析电压选择5V作为栅极电压，如图9，结果分析表明人血清蛋白和BSA的|△G|/G0的变化量远小于ConA的|△G|/G0变化量。
结果证明只有ConA可以进行反应并产生对MoS2表面发生掺杂从而改变|△G|/G0，人血清蛋白和BSA并不能通过加入干扰物来改变|△G|/G0。
实验证明该传感器可以特异性捕获ConA，表明甘露糖修饰的MoS2场效应晶体管生物传感器对ConA具有很高的特异性。
上述只是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应落在本发明技术方案保护的范围内。

Claims (7)

1.一种用于检测刀豆蛋白A的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括下述的步骤：
S1. 将金纳米颗粒溶液浸泡于MoS2场效应晶体管MoS2半导体层表面，使金纳米颗粒通过物理吸附于MoS2半导体层表面；
S2. 将β-巯基乙胺溶液浸泡于MoS2半导体层表面，使β-巯基乙胺通过Au-S键连接于金纳米颗粒表面；
S3. 将甘露糖溶液浸泡于MoS2半导体层表面，使甘露糖的醛基与β-巯基乙胺的氨基反应生成的席夫碱，形成甘露糖探针。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S1是将金纳米颗粒溶液浸泡于MoS2半导体层表面静置0.8~1.2小时，然后用水冲洗并干燥。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2是将β-巯基乙胺溶液浸泡于MoS2半导体层表面6~12小时，然后用水冲洗并干燥。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S3是将甘露糖溶液浸泡于MoS2半导体层表面静置2~4小时。
5.一种权利要求1~4任一项所述方法制备的生物传感器在检测刀豆蛋白A中的应用，其特征在于，将刀豆蛋白A溶液浸泡于MoS2半导体层表面进行反应，使刀豆蛋白A与甘露糖特异性结合，通过转移特性曲线的左移测量刀豆蛋白A的浓度。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，根据|△G|/G0和刀豆蛋白A浓度之间的线性关系进行刀豆蛋白A的定量检测，其中△G为与刀豆蛋白A反应前后源极和漏极之间的电导的变化量，G0为与刀豆蛋白A反应前VG=5V的情况下源极和漏极之间的电导。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，|△G|/G0和刀豆蛋白A浓度CConA之间的线性关系为：|△G/G0|=0.944logCConA+0.0934。
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