CN105699497A - 应用伴刀豆凝集素材料富集糖蛋白或糖肽中聚糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及凝集素亲和材料的应用领域，以改性的硅胶为基质，以伴刀豆Con A为配基，制备出SG Con A材料，根据凝集素和聚糖化合物的可逆性结合作用富集糖蛋白/糖肽，将富集得到的糖蛋白/糖肽经过酶解释放聚糖，经过富集得到聚糖，结合质谱的方法鉴定聚糖的结构和构型。本发明应用亲和固定相富集聚糖化合物，可在高效液相色谱模式和固定相萃取两种模式下分别富集糖蛋白或者糖肽，并且可将此方法应用于实际样品中聚糖化合物的分离和鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及凝集素亲和材料应用技术领域，涉及到以硅胶为基质，伴刀豆凝集素concanavalinA(ConA)为配基的亲和材料SGConA的制备，以标准糖蛋白和糖肽为富集对象，评价SGConA的基本性质，应用SGConA制备ovalbumin糖蛋白或者糖蛋白经过胰蛋白酶(trypsin)酶解得到的糖肽，并用内切糖苷酶PNGaseF(切除与天冬酰胺Asn相连的聚糖和糖蛋白/糖肽)，酶解糖蛋白/糖肽，释放糖链，经过富集得到聚糖，结合质谱表征的方法鉴定聚糖的结构，并将此评价方法应用于富集实际样品中的糖蛋白或者糖肽。
背景技术
凝集素(Lectin)是指一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，可以特异性的识别聚糖或者含有聚糖的糖蛋白或者糖肽，并被认为是破译聚糖构型的密码子(L.Albert,N.Miyako,H.Marina,H.WilliamS.,TheLectinRiddle:GlycoproteinsFractionatedfromComplexMixturesHaveSimilarGlycomicProfiles，AJournalofIntegrativeBiology,14(2010)487-499.)。因此凝集素亲和色谱广泛应用于糖蛋白糖肽的富集中，在蛋白质组学的分析中，多种凝集素连用的技术在复杂样品的分析中发挥着卓越的功能(P.Tatiana,W.Eric,H.WilliamS.,H.Marina,Combinationofabundantproteindepletionandmulti-lectinaffinitychromatography(M-LAC)forplasmaproteinbiomarkerdiscovery,J.ProteomeRes.,6(2007)662–671.；G.FranciscaO.,H.BrianB.,P.Katie,G.Carolina,H.Marina,H,WilliamS.,CharacterizationofGlycoproteinsinPancreaticCystFluidUsingaHigh-PerformanceMultipleLectinAffinityChromatographyPlatform，J.ProteomeRes.,13(2014)289–299.)。
在蛋白质的富集策略中，存在自上而下(从蛋白质水平)和自下而上(糖肽水平)两种富集策略，即使富集后的糖蛋白经过酶解后仍然存在着大量的非糖肽，使得应用自下而上的富集策略更为广泛(S.Bingyun,R.JeffreyA.,U.AngelitaG.,W.JamesT.,Y.Xiaowei,L.Biaoyang,H.Leroy,ShotgunGlycopeptideCaptureApproachCoupledwithMassSpectrometryforComprehensiveGlycoproteomics，MolCellProteomics，6(2007)141-149.)。
在糖肽的质谱鉴定中，由于高强度非糖肽信号峰的存在，严重抑制了糖肽的分子离子峰的强度，从而衍生出很多的富集材料和富集方法以提高糖肽的检测效率。除了凝集素亲和色谱方法外，广为流行的富集方法有肼化学法(Z.Lijuan,J.Hucong,Y.Jun,W.Yali,F.Caiyun,Y.Pengyuan,L.Haojie,HighlyspecificenrichmentofN-linkedglycopeptidesbasedonhydrazidefunctionalizedsolublenanopolymers,chem.commun.,50(2014)1027-1029.)。硼酸亲和色谱法(Boronateaffinitychromatography.2000.119-128.)。亲水色谱法(Y.Long,L.Xiuling,G.Zhimou,Z.Xiuli,L.Xinmiao,Hydrophilicinteractionchromatographybasedenrichmentofglycopeptidesbyusingclickmaltose:Amatrixwithhighselectivityandglycosylationheterogeneitycoverage.Chemistry-AEuropeanJournal,15(2009)12618-12626.)。肼化学法是利用固定于基质上的肼官能团和经高碘酸钠氧化聚糖得到的醛基反应生成Shiff-base的方法,将聚糖化合物(糖蛋白或者糖肽)固定于基质上，与非聚糖化合物分离，并再次通过PNGaseF酶切聚糖，从基质上释放出蛋白质或者肽；此方法的优点是可以快速的鉴定出糖蛋白或者糖肽的糖基化位点，缺点是聚糖被氧化，从而破坏了其构型，不能实现对聚糖构型的解析；
硼亲和色谱富集糖蛋白是应用硼酸在酸性条件下和聚糖化合物的邻二醇可逆性结合，在碱性条件下与聚糖化合物分离的原理实现对糖蛋白糖肽的捕获，该方法的缺点在于硼酸和聚糖化合物中的邻二醇的结合力十分弱，在富集过程中遗漏部分糖蛋白和糖肽；亲水色谱由于其对糖化合物的亲水作用，被广泛应用于糖肽的富集中，但此种方法的批次重复性不高；虽然凝集素亲和色谱和聚糖的结合力不是十分强，由于凝集素对特定构型的聚糖化合物的特异性识别能力仍备受青睐，并被广泛应用于蛋白质组学的研究中。
硅胶基质本身具有亲水性，机械强度高和易于修饰的优点，我们选取硅胶基质的凝集素亲和材料，评价其基本性质，优化富集条件，在高效液相色谱(HPLC)模式下选择性的富集糖蛋白和糖肽，其优点是操作简单快捷，所用试剂为环境友好型试剂，经济且环保，并能够高通量的应用于含有糖蛋白的药物纯化制备中；而对于微量的糖肽，也可以在SPE模式下应用此方法富集糖肽，结合质谱表征，鉴定出肽段异常糖基化的聚糖结构，半个小时以内即可得到结果，此检测方法方便快捷有效。
发明内容
为了更有效的富集糖肽，我们应用凝集素亲和材料分别采用自上而下(糖蛋白质水平)和自下而上(糖肽水平)的两种富集策略富集糖蛋白或者糖肽；在自上而下(糖蛋白质水平)的富集过程中，将富集得到的糖蛋白分别经过PNGaseF酶切或者胰蛋白酶(trypsin)酶解并PNGaseF酶切释放糖链；在自下而上(糖肽水平)的富集过程中，糖蛋白首先经过胰蛋白酶(trypsin)酶解得到糖肽，经过凝集素亲和材料富集糖肽后再用PNGaseF酶酶切释放糖链；通过亲水材料富集两种策略中释放的糖链，并结合质谱QTOF-ESI-MS的方法鉴定聚糖的结构；此种方法依据凝集素和聚糖的特异性识别作用，用于富集实际样品中的糖蛋白或者糖肽，丰富了凝集素亲和色谱在蛋白质组学研究中的应用。应用方法如下：
以经过化学改性的硅胶为基质，伴刀豆凝集素concanavalinA(ConA)为配基，制备硅胶凝集素亲和材料SGConA；
其制备特征为：
a.硅胶预处理：用酸溶液处理硅胶，活化硅胶表面的羟基；
b.含有双官能团间隔臂的制备:在惰气气氛保护下，室温，将氨丙基烷氧基硅烷溶于非质子极性溶剂中，加入双官能团试剂，电磁搅拌4～6小时，得到一端含有烷氧官能团，另一端含有羧基的硅烷试剂中间体；
非质子极性溶剂包括:二氯甲烷、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、二噁烷、二甲亚砜、乙腈中的一种或二种以上；
双官能团试剂中的两个官能团可以相同也可以不同，如丁二酸酐、戊二酸酐、苯甲酸酐中的一种或二种以上；
c.双官能团硅烷化试剂修饰硅胶的制备：在惰气气氛保护下，将步骤a处理好的硅胶溶于有机溶剂中，加入步骤b所得到的产物溶液，加热回流，反应16～48小时；反应体系冷却至室温，减压过滤，依次用甲苯、四氢呋喃、甲醇、水、甲醇洗涤，固体产品在60～100℃下干燥12～24小时，得到间隔臂末端含有可活化官能团的硅胶固定相；
氨丙基烷氧基硅烷的使用量与所修饰的硅胶用量的对应关系为0.03～3mmol氨丙基烷氧基硅烷/g硅胶；
d.凝集素ConA键合硅胶亲和材料的制备：在惰气气氛保护下，将上述经过合成的烷氧基硅烷化试剂修饰后的硅胶SG固定相加入无水有机溶剂或者不含有一级氨基的缓冲盐溶液中，加入活化官能团试剂，室温反应2～4小时，减压抽滤，用不含有一级氨基的缓冲盐溶液洗涤并将所得固定相重溶于不含有一级氨基的缓冲盐溶液置于玻璃容器中；
活化官能团的试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺(EDCI)、EDCI/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)中的一种或二种以上；
不含有一级氨基的缓冲盐溶液为磷酸盐(PBS)缓冲溶液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液、N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙基磺酸(HEPES)缓冲溶液中的一种；
在惰气气氛保护下，将凝集素与和凝集素有特异性结合的糖溶解于不含有一级氨基的缓冲盐溶液中，加入上述的硅胶缓冲盐溶液中，4～25℃搅拌4～24小时，然后加入含有一级氨基的试剂，对未反应完全的活化基团封尾2～4小时，离心，收集固体，得到键合有凝集素的硅胶亲和材料；
一级氨基试剂可以为三羟甲基氨基甲烷、氨基乙醇和BSA缓冲溶液中的一种或两种以上。
步骤a：硅胶加入体积浓度为1～36％的盐酸或硝酸溶液中，硅胶与溶液的体积比1/2～1/20，加热回流搅拌1～48小时，过滤，水洗至中性，在100～160℃干燥6～10小时，后在40～80℃干燥6～10小时至恒重。
步骤b：氨丙基烷氧基硅烷是氨丙基三甲氧基硅烷或者氨丙基三乙氧基硅烷中的一种或二种，以非质子极性溶剂为溶剂，氨丙基烷氧基硅烷试剂在非质子极性溶剂中的浓度为0.5-5M，氨丙基烷氧基硅烷试剂和双官能团试剂的物质的量比为1/1～1/3,控制溶液体系的pH值为4～8，搅拌，用液相色谱或者质谱检测反应，至反应完全。
控制溶液体系的pH值为4～8的方法是加入三乙胺、吡啶、乙二胺、异丙基胺或者盐酸、柠檬酸、乙酸中的一种或二种以上。
步骤c中：所述有机溶剂为苯、甲苯、或者N,N-二甲基酰胺中的一种或二种以上；
步骤a处理好的硅胶在有机溶剂中的质量浓度为0.02～0.2g/ml；60-120℃反应。
所述凝集素为伴刀豆蛋白凝集素(ConA)、麦胚凝集素(WGA)、大豆凝集素(SBA)、蓖麻凝集素(RCA)、荆豆凝集素(UEA)或唾液酸凝集素(SNA)，与凝集素有特异性结合的糖一一对应的为甲基-α-D-吡喃甘露糖，N-乙酰葡糖胺，N-乙酰乳糖胺，半乳糖，L-岩藻糖，N-乙酰神经氨酸。
将1克上述含有可活化官能团的硅胶固定相加入5～50ml无水有机溶剂或者5～50ml不含有一级氨基的缓冲盐溶液中；
加入活化官能团的试剂，其用量与步骤c所得硅胶固定相的对应关系为0.02～2mmol/g，活化硅胶2～4小时，减压抽滤；用不含有一级氨基的缓冲盐溶液多次洗涤并重溶于不含有一级氨基的缓冲盐溶液中；
在惰气气氛保护下，将凝集素与和凝集素有特异性结合的糖溶解于不含有一级氨基的缓冲盐溶液，加入上述经过官能团活化的硅胶缓冲盐溶液；
体系中凝集素的浓度为0.1～1M、与凝集素有特异性结合的糖的浓度为0.05～0.5M、体系总体积为50～100ml，于4～25℃搅拌4～24小时，然后加入终体积浓度为1％～10％的一级氨基试剂，对未反应完全的活化基团封尾2～4小时，离心，收集亲和材料，得到键合有凝集素的硅胶亲和固定相。
步骤d中加入含活化官能团的试剂为EDCI和NHS时，对间隔臂末端为羧基官能团的硅胶材料进行活化，EDCI/NHS的物质的量之比为1/1.5～1/5,EDCI与待活化的硅胶的比例关系为0.02～2mmol/g。
步骤d中加入糖并在4～25℃低温搅拌是为了保护凝集素的特异性结合位点，在键合的过程避免影响凝集素特异性，而凝集素的浓度过高会使得凝集素聚集沉降；
反应完成后，离心，收集上层清液，下层固定相再用不含有一级氨基的缓冲盐溶液洗涤1次以上至上层清液中无蛋白质的吸收，收集上层清液，应用二喹啉甲酸(BCA)的方法检测所有收集得到的上层清液中蛋白质的浓度，计算硅胶亲和固定相中键合的凝集素的含量70～97％；收集固体，得到键合有凝集素的硅胶亲和固定相，最终存放在加入体积浓度2％NaN3(抑制生菌)的磷酸盐缓冲溶液中，4～25℃低温保存。
具体为：
1.制备亲和材料SGConA：氮气气氛下，室温，取实验室自制的硅胶1.0g(其间隔臂含有3-12个碳原子，末端含有活性官能团N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))溶于磷酸盐缓冲溶液中(20-100mL,pH值4-7),加入凝集素ConA20-120mg,搅拌2小时，加入终体积浓度为0.01-5％的乙醇胺，继续搅拌1小时，离心，多次洗涤，用BCA的方法测定凝集素的键合量；
2.评价SGConA的亲和性能：淋洗液A相为磷酸盐(PBS)缓冲溶液，含有0.01M-1.0M的NaCl，1-10mMCaCl2,1-10mMMgCl2,1-10mMMnCl2,pH5-8，洗脱液B为含有0.01M-1.0M竞争性糖的磷酸盐缓冲溶液,竞争性糖为甲基-α-吡喃甘露糖或者甲基-α-吡喃葡萄糖；再生缓冲溶液C相为1-100mM乙酸钠缓冲溶液，pH4-6，优化色谱富集的条件，具体包括pH值，盐浓度，温度；
3.在优化的色谱条件下应用前沿亲和色谱评价凝集素材料的基本性质，包括吸附糖蛋白的量，亲和常数和非特异性吸附的测定；
4.高效亲和色谱富集得到的糖蛋白，经过反相色谱或者透析的方法除盐，浓缩
得到糖蛋白分别通过胰蛋白酶trypsin酶解和PNGaseF酶解，在SPE模式下，应用反相和亲水材料分别去盐和富集聚糖；
5.糖蛋白不经过高效亲和色谱富集，直接用trypsin酶解得到非糖肽和糖肽的混
合物，在SPE模式下，将凝集素材料装填为Zip-tip小柱，经过上样、淋洗和洗脱的步骤，直接富集糖肽，将糖肽再次经过PNGaseF酶解，应用反相和亲水材料分别去盐和富集聚糖；
6.应用QTOF-ESI-MS和MS/MS技术鉴定聚糖的结构。采用质谱鉴定QTOF-ESI-MS(四级杆飞行质谱)确认聚糖构型将富集后的聚糖进样至Q-TOF质谱仪，通过碎片及二级质谱裂解确认糖肽的结构。
本发明的优点
本发明与现有技术相比具有以下特点：
基于硅胶基质的凝集素亲和材料可以在高效亲和色谱和固定相萃取两种模式下富集糖蛋白和糖肽，实现了高通量聚糖化合物的制备；
依据凝集素和聚糖的特异性识别作用，在糖蛋白/糖肽水平上提供了一种富集聚糖的方法；
采用反相和亲水两种材料富集聚糖，步骤简捷，富集效率高。
附图说明
图1实施例3SGConA富集RNaseB；
图2实施例3AgaroseConA富集RNaseB。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明做详细描述。
实施例1：取5g硅胶，置于100mL玻璃圆底烧瓶中，加入50mL6M的盐酸加热回流4小时，水洗至中性，在150℃下干燥5小时；
氮气气氛保护，取氨丙基三乙氧基硅烷试剂1.66g，溶于10mL无水处理的四氢呋喃溶液中，电磁搅拌，加入戊二酸酐1.027g，三乙胺调节pH值为6，室温搅拌，液相色谱检测得到末端含有羧基基团的硅烷试剂。氮气保护，将干燥好的硅胶(2.00g),溶于20mL无水甲苯中，加入含有羧基官能团的硅烷试剂，并滴加吡啶(1mmol,80μL)，加热回流，反应48小时，停止反应，冷却抽滤，依次用无水甲苯，四氢呋喃，甲醇，水，甲醇洗涤，80℃下干燥固化12小时；
称量上述干燥的硅胶1.0g,氮气气氛保护，溶于10mL无水N，N-二甲基酰胺(DMF)中，加入100mMEDCI,200mMNHS,室温搅拌4小时，减压抽滤，并依次用30mLN，N-二甲基酰胺和20mL(pH7.2)HEPES缓冲盐溶液洗涤，所得硅胶置于100mL圆底烧瓶，加入20mL的缓冲盐溶液，取100mg伴刀豆凝集素WGA加入0.2MN-乙酰葡糖胺的HEPES缓冲盐溶液中，搅拌均匀，将其加入活化的硅胶中，4℃搅拌48小时；反应完成后，加入2％的乙醇胺封闭活化基团，搅拌1小时,将键合有ConA的硅胶离心，移除上层清液(保存，用BCA的方法测定蛋白质的键合浓度70mg/g，多次用缓冲溶液洗涤硅胶，紫外检测至上层清液中无蛋白质的吸收峰，将所制备的硅胶储存于0.02％NaN3的HEPES缓冲溶液中，放在4℃冰箱中保存。
氮气气氛下，室温，取实验室自制的硅胶1.0g，其间隔臂含有12个碳原子，末端含有活性官能团N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶于磷酸盐缓冲溶液中(100mL,pH值7),加入凝集素ConA120mg,搅拌2小时，加入终体积浓度为5％的乙醇胺，继续搅拌1小时，离心，多次洗涤得到亲和材料SGConA，用BCA的方法测定凝集素的键合量为99mg/g(ConA/硅胶)；
将SGConA装填于3.0×150mm色谱柱中，分别用非糖蛋白人血清蛋白(HSA),高甘露糖型的糖蛋白牛胰蛋白核糖核苷酶(RNaseB),混合型的糖蛋白鸡卵清蛋白(OVA)评价色谱柱的亲和能力。其中样品浓度为1mg/mL,进样体积为10uL,流速为0.2mL/min,淋洗液A相为磷酸盐(PBS)缓冲溶液(pH6),含有0.05MNaCl，1mMCaCl2,1mMMgCl2,1mMMnCl2,洗脱液B相为含有0.5M甲基-α-吡喃甘露糖的磷酸盐缓冲盐溶液,再生缓冲溶液C相为乙酸钠缓冲溶液(100mM,pH4.0)并再次用流动相A平衡；色谱条件为0-10min,100％A,10-12min，0-100％B，12-22min100％B,22-25min,0-100％C,25-35min,100％C,35-37min,0-100％A,37-45min,100％A，温度25℃；。
将亲和色谱柱连接在高效液相色谱系统中(Alliance2695,PDA2998),配制一系列浓度(0.001-0.5M)的糖蛋白ovalbumin缓冲盐溶液，持续不断的进样至色谱柱中，紫外检测进样浓度和流出色谱柱的样品浓度，当两者的浓度相同时，认为色谱柱已经达到吸收饱和，将流动相替换为含有糖的竞争性洗脱溶剂，将糖蛋白洗脱，并用再生缓冲液淋洗和平衡色谱柱，计算不同浓度下的载样量，做出浓度和载样量之间的关系曲线，绘制Scatchardplot曲线，计算出该凝集素亲和色谱柱的载样量qm,和亲和常数Kd,应用BCA检测色谱柱分离HSA进样前后样品浓度的差异,计算该凝集素材料的非特异性吸附。实验结果表明该凝集素材料的载样量qm为63.3mg/mL,理论载样量为83.59mg/mL,亲和常数Kd为3.15×10-7。
经过高效液相色谱富集，非糖蛋白HSA在色谱柱上不保留，上样后，在死时间内出峰，而高甘露糖型的糖蛋白RNaseB在色谱柱上有强保留，经过竞争性的糖溶液洗脱时出峰；混合型的糖蛋白ovabumin在色谱柱上出现两个峰，第一个峰Fraction1为不和凝集素结合或者与凝集素结合较弱的糖蛋白，第二个峰Fraction2是和凝集素有强结合的糖蛋白，制备两个馏分，通过反相色谱和透析的方式脱盐，计算回收率88.3％，高效液相色谱富集结果证明了SGConA材料对特异性糖蛋白的富集能力；
将所得到的每种糖蛋白分别用trypsin酶解和PNGaseF酶解后，再次用反相和亲水材料分别脱盐和富集聚糖。以ovalbumin为例，将两个馏分Fraction1，Fraction2分别制备出来，并通过反相色谱脱盐，其反相条件为：4.6×150mm的C8色谱柱(5μm)，A相为H2O(0.1％FA),B相ACN(0.1％FA),0-10min,100％A,10-12min,0-80％B，12-20min,80％B,收集12-20min内的馏分,旋干,称重,计算回收率92％；然后将脱盐之后得到的糖蛋白Fraction1，Fraction2分别用胰蛋白酶酶解,具体为分别将Fraction1,Fraction2溶于8M尿素50mMNH4HCO3溶液中,室温下温育变性3小时，向变性后的蛋白溶液中加入50mMDTT溶液,37℃温育2小时，还原二硫键,向各蛋白溶液中加入50mMIAA溶液，避光室温温育30min，取胰蛋白酶酶(每瓶加入200μL缓冲溶液)，与用50mMNH4HCO3溶液稀释10倍后的蛋白溶液混合,37℃温育16小时，蛋白和胰蛋白酶的比例为30/1(W/W),酶解结束时需要加入0.1％FA终止反应，并将酶解液放于低温冰箱中冻存；取trypsin酶解液,旋干，重溶于20μL10mM的NH4HCO3溶液中，加入PNGaseF酶解，PNGaseF和糖肽的比例为1/20,3737℃温育24小时；
取1-2mgC18材料(实验室自制,5μm)溶于乙腈(ACN,0.1％FA)溶液中摇匀搅拌，装填于Zip-tip小柱中，并用ACN/H2O/FA(50/50/0.1％,90μL)溶液活化，ACN/H2O/FA(5/95/0.1％,90μL)溶液平衡，取PNGaseF酶解液10μL上样，ACN/H2O/FA(5/95/0.1％,90μL)溶液淋洗，收集馏分，旋干，并标记为1号样品，ACN/H2O/FA(50/50/0.1％,90μL)洗脱蛋白，收集馏分，旋干，并标记为2号样品；取1-2mg亲水材料(ClickMaltose 5μm)溶于乙腈(ACN,0.1％FA)溶液中摇匀搅拌，装填于Zip-tip小柱中，并用ACN/H2O/FA(50/50/0.1％,90μL)活化，ACN/H2O/FA(80/20/0.1％,90μL)溶液平衡，将1号样品上样，ACN/H2O/FA(80/20/0.1％,120μL)淋洗除盐，ACN/H2O/FA(50/50/0.1％,90μL)洗脱聚糖，收集馏分，进样于QTOF-ESI-MS仪器中，设置电压2.1Kv,m/z的范围为1000-2000,并借助于MS及MS/MS二级质谱确定聚糖的结构。上述实验均平行三次。
实施例2材料为实施例1中制备的亲和材料SGConA，将商品化的糖蛋白ovabumin直接用trypsin酶解，在SPE模式下，取5mLSGConA(2-3mg)材料装填到Zip-tip小柱中，用磷酸盐(PBS)缓冲溶液(10mM,pH7.0)平衡色谱柱，上样并收集馏分，PBS缓冲液淋洗(90μL)收集馏分，含有1.0M甲基-α-吡喃甘露糖的PBS缓冲盐溶液洗脱(90μL)收集馏分；将上样、淋洗和洗脱得到的三个馏分旋干，重溶于30μL水，待上样去盐；取1-2mgC18材料(5μm)溶于乙腈(ACN,0.1％FA)溶液中搅拌，装填于Zip-tip小柱中，并用ACN/H2O/FA(50/50/0.1％,90μL)溶液活化，ACN/H2O/FA(5/95/0.1％,90μL)溶液平衡，上样，ACN/H2O/FA(5/95/0.1％,90μL)溶液淋洗并收集馏分，旋干，标记为1号样品，ACN/H2O/FA(50/50/0.1％,90μL)洗脱，收集馏分，旋干，标记为2号样品；将三个馏分中的2号样品重溶于20μL10mM的NH4HCO3，加入PNGaseF酶解，PNGaseF和糖肽的比例为1/50,37℃温育24小时；
取1-2mgC18材料(实验室自制,5μm)溶于乙腈(ACN,0.1％FA)溶液中摇匀搅拌，装填于Zip-tip小柱中，并用ACN/H2O/FA(50/50/0.1％,90μL)溶液活化，ACN/H2O/FA(5/95/0.1％,90μL)溶液平衡，取PNGaseF酶解液10μL上样，ACN/H2O/FA(5/95/0.1％,90μL)溶液淋洗，收集馏分，旋干，并标记为1号样品，ACN/H2O/FA(50/50/0.1％,90μL)洗脱蛋白，收集馏分，旋干，并标记为2号样品；取1-2mgClickMaltose亲水材料(实验室自制,5μm)溶于乙腈(ACN,0.1％FA)溶液中摇匀搅拌，装填于Zip-tip小柱中，并用ACN/H2O/FA(50/50/0.1％,90μL)活化，ACN/H2O/FA(80/20/0.1％,90μL)溶液平衡，将标记为1号的糖肽馏分上样，ACN/H2O/FA(80/20/0.1％,120μL)淋洗去除非糖肽，ACN/H2O/FA(50/50/0.1％,90μL)洗脱聚糖，收集馏分，进样于QTOF-ESI-MS仪器中，设置电压2.1Kv,m/z的范围为1000-2000,并借助于MS及MS/MS二级质谱确定糖肽的结构。上述实验均平行三次。
实施例3：以亲和材料SGConA富集高甘露糖型的糖蛋白RNaseB为例。具体为，在高效液相色谱模式下，由于高甘露糖和ConA有特异性的亲和作用，淋洗峰Fraction1所占的比例非常小，高甘露糖型的糖蛋白RNaseB仅出现一个色谱峰Fraction1所占的比例非常小，而大部分的高甘露糖型的糖蛋白RNaseB出现在洗脱峰Fraction2中，制备两个馏分。其中样品浓度为1mg/mL,进样体积为10uL,流速为0.2mL/min,淋洗液A相为磷酸盐(PBS)缓冲溶液(10mM,pH6.0),含有0.15MNaCl，10mMCaCl2,10mMMgCl2,10mMMnCl2,洗脱液B相为含有0.5M甲基-α-吡喃甘露糖的PBS缓冲盐溶液,再生缓冲溶液C相为乙酸钠缓冲溶液(10mM,pH6)并再次用流动相A平衡；色谱条件为0-10min,100％A,10-12min，0-100％B，12-22min100％B,22-25min,0-100％C,25-35min,100％C,35-37min,0-100％A,37-45min,100％A。
用截留分子量小于10,000的透析袋透析，除盐，旋干，计算蛋白质的回收率87％。蛋白质经过用胰蛋白酶酶解(trypsin/RNaseB为1/30)和PNGaseF酶解(PNGaseF/RNaseB为1/50)；将酶解液旋干，重溶于20μL水，待上样；
取1-2mgC18材料(实验室自制,5μm)溶于乙腈(ACN,0.1％FA)溶液中摇匀搅拌，装填于Zip-tip小柱中，并用ACN/H2O/FA(50/50/0.1％,90μL)溶液活化，ACN/H2O/FA(5/95/0.1％,90μL)溶液平衡，上样，ACN/H2O/FA(5/95/0.1％,90μL)溶液淋洗并收集馏分标记为1号样品，ACN/H2O/FA(50/50/0.1％,90μL)洗脱糖肽，收集馏分标记为2号样品；取1-2mgclickTE-Cys亲水材料(实验室自制,5μm)溶于乙腈(ACN,0.1％FA)溶液中摇匀搅拌，装填于Zip-tip小柱中，并用ACN/H2O/FA(80/20/0.1％,90μL)活化，ACN/H2O/FA(80/20/0.1％,90μL)溶液平衡，取1号样品上样，ACN/H2O/FA(90/10/0.1％,120μL)淋洗除盐，ACN/H2O/FA(80/20/0.1％,90μL)洗脱糖肽，收集馏分，进样于QTOF-ESI-MS仪器中，设置电压2.1Kv,m/z的范围为1000-2000,并借助于MS/MS二级质谱确定糖肽的结构。上述实验均平行三次。
取AgaroseConA富集RNaseB，在SPE模式下，AgaroseConA同样能够富集RNaseB，但出现样品流失的现象，不适合样品的定量分析。
实施例4：用凝集素亲和材料SGConA富集实际样品酵母中的糖蛋白。具体为，样品浓度为1mg/mL,进样体积为10uL,流速为0.2mL/min,淋洗液A相为淋洗液A相为磷酸盐(PBS)缓冲溶液(50mM,pH6.0),含有0.3MNaCl，10mMCaCl2,10mMMgCl2,10mMMnCl2,洗脱液B相为含有0.5M甲基-α-吡喃甘露糖的PBS缓冲盐溶液,再生缓冲溶液C相为乙酸钠缓冲溶液(50mM,pH7)并再次用流动相A平衡；色谱条件为0-10min,100％A,10-12min，0-100％B，12-22min100％B,22-25min,0-100％C,25-35min,100％C,35-37min,0-100％A,37-45min,100％A。
用截留分子量小于10,000的透析袋透析，除盐，旋干，计算蛋白质的回收率87％。蛋白质过用胰蛋白酶(trypsin/酵母比例为1/20)酶解，PNGaseF酶解(PNGaseF/酵母比例为1/50)；旋干样品，重溶于20μL水，待上样；；
取1-2mgC18材料(实验室自制,5μm)溶于乙腈(ACN,0.1％FA)溶液中摇匀搅拌，装填于Zip-tip小柱中，并用ACN/H2O/FA(50/50/0.1％,90μL)溶液活化，ACN/H2O/FA(5/95/0.1％,90μL)溶液平衡，取20μL样品上样，ACN/H2O/FA(5/95/0.1％,90μL)溶液淋洗并收集馏分标记为1号样品，ACN/H2O/FA(50/50/0.1％,90μL)洗脱糖肽，收集馏分标记为2号样品；取1-2mgTE-Cys亲水材料(实验室自制,5μm)溶于乙腈(ACN,0.1％FA)溶液中摇匀搅拌，装填于Zip-tip小柱中，并用ACN/H2O/FA(80/20/0.1％,90μL)活化，ACN/H2O/FA(80/20/0.1％,90μL)溶液平衡，取2号样品上样，ACN/H2O/FA(80/20/0.1％,120μL)淋洗除盐，ACN/H2O/FA(50/50/0.1％,90μL)洗脱糖肽，收集馏分，进样于QTOF-ESI-MS仪器中，设置电压2.1Kv,m/z的范围为1000-2000,并借助于MS/MS二级质谱确定糖肽的结构。上述实验均平行三次。
Claims (9)
1.应用伴刀豆凝集素材料富集糖蛋白或糖肽中聚糖的方法，步骤如下：
a.以经过化学改性的硅胶为基质，伴刀豆凝集素concanavalinA(ConA)为配基，制备硅胶凝集素亲和材料SGConA；
b.将凝集素亲和材料SGConA装填为色谱柱，在高效液相色谱模式下，样品中的糖蛋白或糖肽的色谱富集条件，淋洗液和洗脱液pH值5-8，盐浓度0.01-1.0M，温度4-60℃；
c.制备糖蛋白/糖肽：将所得糖蛋白或糖肽馏分经过脱盐，PNGaseF酶解、或trypsin酶解脱盐后再经过PNGaseF酶解释放出糖链，并再次脱盐，应用亲水性材料富集聚糖。
2.按照权利要求书1所述的方法制备SGConA材料，其特征在于：步骤a：经过化学改性的硅胶含有一定碳链长度的间隔臂，间隔臂含有3～12个碳原子，其一端和硅胶相连，末端为含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的官能团。
3.按照权利要求书1所述的方法，其特征在于：在高效液相色谱模式下富集样品中的糖蛋白或糖肽，
步骤b为:淋洗液为A相，洗脱液为B相，高效液相色谱条件为：温度为4-60℃，0-10min,100％A,10-12min,0-100％B,12-22min,100％B,22-25min,0-100％C,25-35min,100％C,35-37min,0-100％A,37-45min,100％A；
淋洗液A相为磷酸盐(PBS)缓冲溶液，并含有0.01M-1M的NaCl，0.01-50mMCaCl2,0.01-50mMMgCl2,0.01-50mMMnCl2,pH5-8；洗脱液B为含有0.01M-1.0M竞争性糖的缓冲溶液，竞争性洗脱试剂为甲基-α-吡喃甘露糖或者甲基-α-吡喃葡萄糖，糖的浓度0.01-1.0M，并含有0.01M-1M的NaCl，0.01-50mMCaCl2,0.01-50mMMgCl2,0.01-50mMMnCl2,pH值5-8；
或步骤b为:取亲和材料SGConA1-2mg，装填于Zip-tip小柱中，淋洗液为A；洗脱液为B，取糖肽1-10μg，经过上样、淋洗(A溶液)和洗脱(B溶液),分别收集上样液、淋洗液和洗脱液；
淋洗液A相为磷酸盐(PBS)缓冲溶液，并含有0.01M-1.0M的NaCl，1-10mMCaCl2,1-10mMMgCl2,1-10mMMnCl2,pH5-8；洗脱液B为含有0.01M-1.0M竞争性糖的磷酸盐缓冲溶液,竞争性糖为甲基-α-吡喃甘露糖或者甲基-α-吡喃葡萄糖。
4.按照权利要求书1所述的方法，其特征在于：步骤b:凝集素为伴刀豆蛋白凝集素(ConA)，其中ConA特异性结合甘露糖型和葡萄糖型的聚糖，不结合复杂型的聚糖，同时对高甘露糖型有特异性强结合，以不含有糖的人血清蛋白(HSA),含有高甘露糖型的核糖胰蛋白酶B(RNaseB)和含有复合糖型的鸡卵清糖蛋白(ovalbumin)作为色谱评价对象，评价凝集素亲和材料的富集性能；再生缓冲溶液C相为乙酸钠缓冲溶液浓度为1-100mM，pH值为4-6。
5.按照权利要求书1所述的方法，其特征在于:
步骤b:将SGConA材料装填于2.1×100mm的色谱柱中，在高效液相色谱模式下，将系列浓度(0.001-0.01M)的糖蛋白连续进样，紫外检测至进样浓度与流出凝集素色谱柱的浓度相同，即色谱柱达到吸附饱和，用优化好的洗脱条件洗脱糖蛋白，通过测量系列浓度下糖蛋白的饱和吸附量，做出糖蛋白浓度和载样量之间Scatchardplot曲线，根据方程计算凝集素的载样量，凝集素与糖蛋白/糖肽的亲和解离常数Kd，应用BCA的方法测定富集前后溶液中蛋白质浓度的差异，评价此种凝集素亲和材料的非特异性吸附性质。
6.按照权利要求书1所述的方法，其特征在于：
步骤c中脱盐过程为：
a.用透析袋透析脱盐，透析袋截留糖蛋白的分子量1000-20000Da；
或b.应用反相色谱柱脱盐，流动相条件:反相C18色谱柱(5-50μm)，A相为水含有0.1％甲酸(FA)，B相为乙腈含有0.1％甲酸(FA),洗脱梯度为1-10min,100％A,10-20min,80％B体积浓度,接收10min以后的馏分，将所接馏分离心浓缩后，低温保存。
7.按照权利要求书1所述的方法，其特征在于：将亲和材料SGConA富集得到的糖蛋白或者糖肽进行PNGaseF酶解、或trypsin酶解脱盐后PNGaseF酶解并脱盐，释放糖链，trypsin酶解过程参照试剂使用说明书进行，trypsin酶和糖蛋白/糖肽的使用量为1：5-1:100；
脱盐：取反相材料C18(5-20μm)1-2mg，溶于乙腈(ACN,0.1％FA)溶液中摇匀搅拌，装填于Zip-tip小柱中，并用ACN/H2O/FA(ACN体积浓度1-60％,10-100μL)溶液活化和平衡，上样，ACN/H2O/FA溶液淋洗(ACN体积浓度1-30％,10-100μL)，ACN/H2O/FA(ACN体积浓度1-90％,10-100μL)洗脱，收集馏分；PNGaseF酶解，释放糖链，将PNGaseF酶溶解于1-50mMNH4HCO3溶液中,PNGaseF酶和糖蛋白/糖肽的使用量为1：5-1:100。
8.按照权利要求书1或7所述的方法，其特征在于：
应用反相材料对所得PNGaseF酶解液再次脱盐，取反相材料C18(5-20μm)1-2mg，溶于乙腈(ACN,0.1％FA)溶液中摇匀搅拌，装填于Zip-tip小柱中，并用ACN/H2O/FA(ACN体积浓度1-60％,10-100μL)溶液活化和平衡，上样，ACN/H2O/FA溶液淋洗(ACN体积浓度1-30％,10-100μL)并收集馏分标记1，用于富集聚糖；ACN/H2O/FA(ACN体积浓度1-90％,10-100μL)洗脱并收集馏分标记2。
9.按照权利要求书8所述的方法，其特征在于：步骤c:应用亲水材料富集聚糖，取1-2mg亲水材料(clickmaltose,clickTE-Cys,石墨化碳或者X-amide)溶于乙腈(ACN,0.1％FA)溶液中摇匀搅拌，装填于Zip-tip小柱中，并用ACN/H2O/FA(ACN体积浓度1-80％,10-100μL)活化，ACN/H2O/FA(ACN体积浓度1-80％,10-100μL)溶液平衡，将权利要求8中得到的1号馏分上样，ACN/H2O/FA(ACN体积浓度95-70％,10-100μL)淋洗除盐，ACN/H2O/FA(ACN体积浓度70-30％,10-100μL)洗脱，收集聚糖。
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