KR20180023955A

KR20180023955A - 뇌척수액의 검출

Info

Publication number: KR20180023955A
Application number: KR1020187001245A
Authority: KR
Inventors: 석-준 권; 로베르트 제이. 린하르트; 조나단 에스. 도르딕; 윌리암 제이. 손스테인; 푸밍 장
Original assignee: 뉴로로지컬 서저리, 피.씨.; 렌슬러 폴리테크닉 인스티튜트
Priority date: 2015-06-18
Filing date: 2016-06-17
Publication date: 2018-03-07
Also published as: EP3311142A2; CA2988542A1; WO2016205637A3; EP3311142A4; CA2988542C; JP6808728B2; JP2018524611A; US20190004057A1; US11067581B2; WO2016205637A2; CN107850548A; EP3311142B1; HK1254628A1

Abstract

본 발명은 시알로-트랜스페린을 제거하고 생물학적 샘플에서 아시알로-트랜스페린을 선택적으로 검출하거나 또는 측정하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플에서 뇌척수액 (CSF)의 존재를 검출하기 위한 방법 및 시험 스트립을 포괄한다.

Description

뇌척수액의 검출

관련 출원

본원은 그 내용 전체가 본원에 참고로 포함된, 2015년 6월 18일 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/181,469의 이익을 주장한다.

척추 수술 동안 수반되는 경막절개로 인한 척수액 누출은 2-17%의 발생률로 일어나는 비교적 흔한 합병증이다 [1-6]. 일반적으로, 척수액 누출은 수술 시 인식되어 성공적으로 복구된다. 때때로, 예를 들어, 작은 경막절개가 수술 당시 인식되지 않거나 복구가 초기에 이상적이지 않은 경우, 복구는 지연된 방식으로 시행된다. 척추 외과의사는 종종 CSF (뇌척수액) 누출을 나타내거나 나타내지 않을 수 있는 수술후 체액 저류에 직면하게 된다. 이것은 보다 흔하게는 퇴행성 질환에 대한 요추 수술과 관련된 문제이다. 환자가 체위성 두통 또는 투명한 체액 누출을 보이면, 보다 쉽게 진단된다. 그러나, 수술후 기간에 환자의 증상이 항상 고전적으로 나타나는 것은 아니기 때문에, 때로는 CSF를 장액성 체액과 구분하는 것에 혼란을 겪게 된다. 환자는 부풀어오르는 체액의 피하 저류를 제시할 수 있고, 그 흡인 시에 체액의 특성은 확실하지 않다. 외과적 의사 결정에서, CSF 누출의 진단을 신속하게 확인하여 복구를 개시할 수 있는 것이 이상적일 것이고, 이것은 특히 수막염을 야기할 수 있는 피부 유출이 존재하는 경우에 외과적 조치를 필요로 한다. 장액종은 종종 수술할 필요 없이 보존적으로 치료될 수 있기 때문에, 저류가 장액종인지 아닌지 아는 것이 유리할 것이다. 현재 CSF를 장액성 체액으로부터 구분하기 위해, 체액 샘플을 전기영동을 이용하는 실험실로 보내야 하고, 결과를 얻기까지 3 내지 5일이 걸릴 수 있다.

전기영동 및 질량 분광법을 이용하는 단백질 분리와 검출의 조합은 CSF에서 단백질 바이오마커를 확인하기 위해 성공적으로 적용된 바 있다 [7]. CSF 내의 단백질 바이오마커 중 트랜스페린 (TF)는 이소형은 수액누출로부터 CSF 누출을 검출하기 위한 것 뿐만 아니라, 초기 구강암 [8], 만성 알콜 중독 [9], 및 당뇨병 신장 질환 [10]을 포함하는 여러 질환을 검출하기 위한 중요한 진단 마커로 사용된 바 있다.

CSF 누출을 신속하게 검출하는 방법에 대한 필요성이 관련 기술분야에서 여전히 존재한다.

본 발명은 아시알로-트랜스페린 (aTF) 바이오마커인 CSF β2-트랜스페린을 선택적으로 결정하는 새로운 접근법의 개발에 기초한다. 구체적으로, CSF-유래 aTF의 검출을 가능하게 하는, 혈청 및 다른 샘플로부터 시알로-트랜스페린 (sTF)을 선택적으로 제거하는 방법이 개발된 바 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 뇌척수액 (CSF)의 존재를 검출하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은

a. 생물학적 샘플을 얻는 단계;

b. 산화된 시알로-트랜스페린 (sTF)을 생성하기에 충분한 양으로 산화제를 샘플에 첨가하며, 여기서 산화된 sTF는 말단 잔기에 알데히드 기를 포함하는 것인 단계;

c. 단계 b로부터 얻은 샘플을 히드라지드 반응성 기를 포함하는 시약과 접촉시키며, 여기서 산화된 sTF는 히드라지드 반응성 기에 결합하여 복합체를 형성하는 것인 단계;

d. 샘플로부터 복합체를 제거하여 잔류 샘플을 형성하는 단계; 및

e. 잔류 샘플에서 잔류 트랜스페린의 존재를 검출하는 단계

를 포함하며, 여기서 생물학적 샘플에서 잔류 트랜스페린의 검출은 CSF의 존재를 나타낸다.

추가의 측면에서, 본 발명은 생물학적 샘플로부터 시알로-트랜스페린 (sTF)을 제거하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은

a. 생물학적 샘플을 얻는 단계;

b. 산화된 sTF를 생성하기에 충분한 양으로 산화제를 샘플에 첨가하며, 여기서 산화된 sTF는 말단 잔기에 알데히드 기를 포함하는 것인 단계;

c. 단계 b로부터 얻은 샘플을 히드라지드 반응성 기를 포함하는 시약과 접촉시키며, 여기서 산화된 sTF는 반응성 기에 결합하여 복합체를 형성하는 것인 단계; 및

d. 샘플로부터 복합체를 제거하는 단계

를 포함한다.

또 다른 추가의 실시양태에서, 본 발명은 수술 동안 또는 수술 후에 대상체에서 CSF 누출을 검출하는 방법을 포괄하며, 상기 방법은

a. 수술 전에 대상체로부터 제1 생물학적 샘플을 얻고, 제1 샘플에 존재하는 트랜스페린을 측정하는 단계; 및

b. 수술 동안 또는 수술 후에 대상체로부터 제2 생물학적 샘플을 얻고, 제2 샘플에 존재하는 트랜스페린을 측정하는 단계

를 포함하며, 여기서 제1 샘플에 존재하는 트랜스페린과 비교하여 제2 샘플에 존재하는 트랜스페린의 보다 많은 양은 CSF 누출을 나타낸다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은 샘플에서 트랜스페린을 검출 또는 측정하기 위한 시험 스트립에 관한 것으로, 상기 시험 스트립은

a. 샘플 로딩 영역;

b. sTF에 결합하는 고정된 시약을 포함하는, 샘플 로딩 영역의 하류의 여과 영역; 및

c. 항-트랜스페린 항체를 포함하는, 여과 영역의 하류의 결합 영역

을 포함한다.

본 발명의 상기 및 다른 목적, 특징 및 이점은 동일한 참조 부호가 상이한 도면 전체에 걸쳐 동일한 부분을 나타내는 첨부 도면에 도시된 바와 같이, 아래에서 제시되는 본 발명의 바람직한 실시양태의 보다 구체적인 기재로부터 명백해질 것이다. 도면은 반드시 일정한 비율로 제시되는 것은 아니고, 대신에 발명의 원리를 기재하는 것에 중점을 두어야 한다.
도 1a 및 1b는 트랜스페린 당형태에 존재하는 글리칸의 구조를 제시한다. 도 1은 혈청 sTF의 구조를 제시하고, 도 1b는 CSF sTF 및 aTF, β2TF의 구조를 제시한다.
도 2a, 도 2b 및 도 2c는 TF 당형태의 결정을 위한 전기영동 기반 검정을 제시한다. 도 2a는 NHS-로다민을 사용한 TF 당형태 sTF 및 aTF의 형광 표지를 제시하고; 도 2b는 로다민-표지된 sTF로부터 로다민-표지된 aTF의 분리를 제시한다. 도 2c는 로다민-표지된 TF에 대한 검출 한계를 제시한다.
도 3a 및 3b는 버퍼 글리칸으로부터 TF 당형태의 분리를 위한 단일-단계 퍼아이오데이트 글리칸 산화를 제시한다. 도 3a는 말단 시알산의 퍼아이오데이트 산화 및 SiMAG-히드라지드를 사용한 포획을 제시한다. 도 3b는 포획된 TF 당형태를 제거하고 상청액을 회수하기 위해 사용되는 자기 분리기를 제시한다. 도 3c는 전기영동에 의한 버퍼 내의 aTF 및 미량의 sTF의 분리 및 검출을 제시한다.
도 4a, 도 4b, 도 4c 및 도 4d는 CSF와 혈청의 혼합물에서 단일-단계 퍼아이오데이트 산화를 사용하여 TF 당형태로부터 sTF를 분리하는 것을 제시한다. 도 4a는 CSF와 혈청 둘 다로부터 제거된 sTF의 아가로스 겔 분리 및 검출을 제시한다. 도 4b는 각각 단일-단계 퍼아이오데이트 산화 전 및 후의 CSF 및 혈청 내의 TF의 정량화를 제시한다. 도 4c는 단일 단계 퍼아이오데이트 산화 후에 CSF와 혈청의 상이한 혼합물 내의 잔류 TF (주로 aTF)의 정량화를 제시한다. 도 4d는 CSF와 다양한 혈청의 혼합물(1:1 v/v 비)로부터 sTF의 선택적인 제거 후의 TF의 검출을 제시한다 (S1: 29세/아프리카 남성, S2: 41세/백인 남성, S3: 61세/히스패닉계 여성, S4: 21세/아프리카 여성).
도 5a 및 5b는 TF 당형태의 분리를 위한 2-단계 효소 산화를 제시한다. 도 5a는 시알산의 제거 및 갈락토스의 산화, 이어서 산화된 sTF의 포획 및 제거를 제시한다. 도 5b는 TF 당형태의 분리를 위한 2-단계 효소 산화의 정량화를 제시한다.

본 발명의 바람직한 실시양태에 대한 기재가 아래에 제시된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 단수 단어는 달리 명시되지 않는 한 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 용어 "입자"는 하나 이상의 입자를 포괄한다.

트랜스페린 (TF)은 음으로 하전된 시알산 잔기로 그의 비-환원 말단에서 캡핑된 글리칸을 함유하는 여러 당형태를 갖는 분비된 당단백질이다 [11, 12]. TF는 비결합된 철과 관련된 자유 라디칼 손상에 대해 몸을 보호하는 것 뿐만 아니라, 철의 항상성 및 수송에서 중요한 역할을 수행한다 [13]. 혈청 내의 TF는 679개의 아미노산 잔기 (~78 kDa의 MW)로 이루어지고, 종종 다양한 수의 말단 (비-환원 말단부) 시알산 (또는 N-아세틸뉴라민산) 잔기를 보유하는 N-연결된 글리칸에 의해 점유되어 TF 당형태의 분균질한 집단을 생성하는 2개의 글리코실화 부위를 아스파라긴 Asn₄₃₂ 및 Asn₆₃₀에 갖는다 [11, 14] (도 1a 및 1b). 혈청 내의 TF는 완전히 시알릴화된 당형태로만 이루어진다. 이와 대조적으로, β2-트랜스페린 (β2TF)로 언급되는 CSF 내의 TF는 시알로 (sTF)와 아시알로당형태 (aTF)의 혼합물로 존재한다 [7, 12] (도 1a 및 1b). CSF 내의 aTF는 뇌 뉴라미니다제의 작용을 통해 혈청 sTF로부터 유래하는 것으로 추측된 바 있다 [15]. 수년에 걸쳐, 중추 신경계의 다양한 장애 뿐만 아니라 CSF 누출의 바이오마커로서 TF 이소형을 검출하기 위한 많은 방법이 고안된 바 있다 [16, 17]. 등전 포커싱 [18], 면역고정 겔 전기영동 [19], 소듐 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) [20], 및 모세관 전기영동 (CE) [21]을 비롯하여 전기영동에 의존하는 상이한 분리 방법이 TF 이소형을 분리하기 위해 개발된 바 있다.

본 발명은 척추 외과의사가 CSF를 수술후 배액과 같은 생물학적 샘플로부터 직접 검출 및/또는 측정할 수 있도록 하는 간단하고 신속한 방법을 포괄한다. 척추 외과의사는 환자의 수술후 절개 부위에서 체액 누출이 검출될 때 환자 치료와 관련하여 중요하고 긴급한 결정을 내려야 할 상황에 직면할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플, 예컨대 혈청 내의 sTF를 특이적으로 산화시켜, 이를 히드라지드 시약 (예컨대, 히드라지드 자성 마이크로입자)에 접합하고 샘플로부터 선택적으로 제거할 수 있고, 신속한 실시간 "딥-스틱" 분석에 사용할 수 있는 방법에 의해 CSF-유래 aTF를 신속하게 검출할 수 있도록 하는 화학적 및/또는 효소적 방법의 사용을 포괄한다.

생물학적 샘플은 CSF, 트랜스페린 및/또는 아시알로-트랜스페린을 함유하는 것으로 의심되는 임의의 샘플일 수 있다. 예시적인 생물학적 샘플은 예를 들어 혈청, 혈액, 혈장, 비강 체액, 귀 체액, 생검 샘플, 림프액 샘플, 머리 또는 척추 상처 또는 천자로부터의 체액, 및 수술 절개 부위로부터의 체액을 포함한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈청이다. 추가의 실시양태에서, 생물학적 샘플은 수술 동안 또는 수술 후에 인간 환자와 같은 대상체로부터 얻는다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 생물학적 샘플은 수술 절개 부위 또는 수술후 체액 저류로부터 얻는다. "대상체"라는 용어는 인간 대상체를 포괄하나 이에 제한되지는 않는 동물 대상체를 포함하는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 인간 대상체로부터 얻거나 인간 기원의 것이다.

본원에서 기재되는 방법은 생물학적 샘플에 산화제를 첨가하여 산화된 sTF를 생성하는 단계를 포괄한다. 산화제는 TF 내의 알콜기를 알데히드 기로 산화할 수 있는 약한 산화제와 같은 산화제이다. 일부 실시양태에서, 산화제는 화학적 또는 효소적 작용제이다. 일부 실시양태에서, 산화제는 TF의 말단 잔기에서 알콜을 알데히드로 산화시키는 것이다. 말단 잔기는 트랜스페린 분자의 비-환원 말단부의 모노사카라이드 잔기이다. 시알로-트랜스페린 (sTF)에서, 말단 잔기는 시알산 잔기이다. 시알산 잔기는 예를 들어 효소 뉴라미니다제로 처리함으로써 sTF로부터 제거될 수 있다. 시알산 기가 sTF로부터 제거될 때, 말단 모노사카라이드 잔기는 갈락토스이다. 예시적인 산화제는 예를 들어 퍼아이오데이트, 예컨대 퍼아이오데이트 염 (예를 들어, 소듐 퍼아이오데이트 및 포타슘 퍼아이오데이트)을 포함한다. 산화제는 또한 예를 들어 갈락토스 옥시다제와 같은 효소를 포함한다.

산화된 sTF는 약한 산화 반응과 같은 산화 반응의 생성물인 sTF이다. 일부 실시양태에서, 산화된 sTF는 예를 들어 TF의 올리고사카라이드 측쇄에 알데히드 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 알데히드 기는 말단 모노사카라이드 잔기에 있다. 산화된 sTF의 비-제한적인 예는 말단 시알산의 C-7 위치가 알데히드 기인 sTF이다 (예를 들어, 도 1a 참조). 산화된 sTF의 또 다른 비-제한적인 예는 말단 시알산 잔기가 제거되었고 말단 갈락토스의 C-6 위치가 알데히드 기인 sTF이다 (예를 들어, 도 5a 참조).

히드라지드 기를 포함하는 시약은 예를 들어 히드라지드 반응성 기를 포함하는 임의의 물질, 화합물 또는 조성물을 포함한다. 카르보닐기와 히드라지드 관능기의 반응은 히드라존 결합의 형성에 의해 접합체를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 히드라지드 반응성 기를 포함하는 시약은 히드라지드 관능기를 포함하는 화학 시약이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 히드라지드 기를 포함하는 시약은 히드라지드 반응성 기를 포함하는 고체 지지체이다. 지지체는 유기 또는 무기 물질일 수 있고, 예를 들어 비드, 입자, 필름, 막, 튜브, 웰, 스트립, 막대, 평면 표면, 예를 들어 플레이트, 종이 유사체 등, 섬유 등을 포함한다. 고체 지지체의 다른 예는 예를 들어 중합체, 예컨대 니트로셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트를 포함한다. 히드라지드 모이어티는 임의의 고체 지지체에 라이게이팅되거나 화학적으로 결합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 히드라지드 반응성 기를 포함하는 시약은 입자이다. 히드라지드 입자의 제조는 예를 들어 문헌 [Hermanson 2013, Bioconjugate Techniques, 3^rd Ediition, London, UK: Academic Press]에 기재되어 있다. 히드라지드 입자는 또한 상업적으로 입수가능하다. 히드라지드 입자는, 히드라지드 반응성 기가 입자 표면 상에 존재하도록 처리되거나, 코팅되거나, 관능화될 수 있다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 시약은 자성 히드라지드 입자, 예를 들어 자성 히드라지드 마이크로입자 또는 나노입자 (예를 들어, SiMAG 히드라지드)이다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 시약은 히드라지드 관능기가 존재하도록 처리되거나, 코팅되거나, 관능화된 중합체 지지체, 예컨대 니트로셀룰로스이다. 추가의 실시양태에서, 히드라지드 시약은 비오티닐화된 히드라지드, 예컨대 (비오티닐 히드라지드) 및 6-(비오틴아미도)헥산히드라지드이다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 산화된 sTF는 히드라지드 반응성 기를 포함하는 시약과 접촉되어 복합체 또는 접합체를 형성하고, 복합체 또는 접합체는 샘플로부터 제거된다. 복합체 또는 접합체는 임의의 적절한 수단에 의해 샘플로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, 히드라지드 반응성 기를 포함하는 시약이 입자일 때, 입자는 여과, 원심분리, 침강 등과 같은 적절한 방법을 사용하여 샘플로부터 제거될 수 있다. 또 다른 예에서, 히드라지드 반응성 기를 포함하는 시약이 자성 입자일 때, 복합체 또는 접합체는 자기 분리기를 사용하여 제거될 수 있다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 히드라지드 시약이 비오티닐화된 히드라지드일 때, 비오티닐화된 복합체 또는 접합체는 아비딘-, 스트렙타비딘- 또는 다른 비오틴-결합 단백질을 사용하여 포획될 수 있다. 예를 들어, 비오티닐화된 복합체는 스트렙타비딘-커플링된 검출 기술을 사용하여 포획될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비오티닐화된 복합체는 스트렙타비딘-코팅된 입자, 예를 들어, 스트렙타비딘-코팅된 자성 입자를 사용하여 포획된다. 상기 입자는 스트렙타비딘이 공유 연결된 입자 또는 비드를 포함한다.

복합체 또는 접합체 제거 후에, 남아있는 샘플 (본원에서 "잔류 샘플"로 언급됨)은 sTF의 산화 및 제거를 수행하기 전의 샘플의 것보다 더 적은 sTF를 갖는다. 예를 들어, 자성 히드라지드 입자 및 자기 분리기가 상기 기재한 바와 같이 사용될 때, 상청액은 잔류 트랜스페린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 잔류 샘플에는 sTF가 실질적으로 없고, 예를 들어, 잔류 샘플은 (sTF의 산화 및 제거를 수행하기 전에) 샘플에 원래 존재하는 sTF의 약 5% 이하를 함유한다. 추가의 다른 실시양태에서, 잔류 샘플에는 sTF가 없다. 잔류 샘플에 남아있는 트랜스페린은 잔류 트랜스페린으로 언급된다.

상기 논의한 바와 같이, CSF 내의 TF는 시알로 (sTF)와 아시알로-트랜스페린 (aTF)의 혼합물로서 존재한다. 이와 대조적으로, 혈청에서, 트랜스페린은 완전히 시알릴화된 당형태로만 이루어진다. 생물학적 샘플로부터 sTF를 제거하면, 아시알로-트랜스페린을 검출하고 측정할 수 있다. 아시알로-트랜스페린은 CSF에서 발견되기 때문에 (혈청에서는 일반적으로 발견되지 않음), 생물학적 샘플에서 아시알로-트랜스페린의 검출 또는 측정은 CSF가 누출되었음을 나타낸다. 잔류 트랜스페린 또는 아시알로-트랜스페린은 예를 들어 항-트랜스페린 항체를 사용하여 검출되거나 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 잔류 트랜스페린은 면역검정, 예를 들어 경쟁적 면역검정, 샌드위치 면역검정, 측방 유동 면역검정 및/또는 ELISA에 의해 검출되거나 측정된다. 일부 실시양태에서, 잔류 트랜스페린은 표지된 항-트랜스페린 항체를 사용하여 검출되거나 측정된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 표준 곡선을 사용하여 샘플 내의 트랜스페린 또는 잔류 트랜스페린의 양을 측정할 수 있다.

일부 측면에서, 항-트랜스페린 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항체의 트랜스페린-결합 단편, 예컨대 Fab 단편이다. 항-트랜스페린 항체는 문헌 [Harlow, E., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1999]에 제시된 방법과 같이 통상의 기술자에게 공지된 통상의 방법을 사용하여 제조될 수 있거나, 상업적 공급자로부터 구입할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기재되는 방법 및 시험 스트립은 2개의 항체 (예를 들어, 결합 영역 내의 항체 및 시험 스트립의 포획 영역 내의 항체)의 사용을 포함한다. 두 항체는 상이한 유형일 수 있고, 예를 들어 제1 항체는 마우스 모노클로날 항체일 수 있고, 제2 항체는 토끼 폴리클로날 항체일 수 있거나, 또는 그 반대일 수 있거나, 항체는 트랜스페린의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다.

추가의 실시양태에서, 잔류 트랜스페린은 잔류 샘플을 항-트랜스페린 항체로 코팅된 고체 지지체 (예를 들어, 멀티웰 플레이트)에 첨가한 후, 표지된 검출 항체를 고체 지지체에 첨가하는 ELISA를 사용하여 검출된다. 일부 실시양태에서, 표지된 검출 항체는 표지된 항-트랜스페린 항체이다. 예를 들어, 표지된 검출 항체는 예를 들어 형광원성 표지, 발색원성 표지, 비오틴 분자, 및/또는 금 입자를 포함하는 검출가능한 표지에 접합된 항체일 수 있다. 특정 측면에서, 표지된 검출 항체는 스트렙타비딘-퍼옥시다제 복합체를 첨가하고 비결합된 접합체를 제거하고 퍼옥시다제 기질, 예컨대 TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 또는 ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산))를 첨가함으로써 검출될 수 있는 비오티닐화된 항체이다.

또 다른 추가의 측면에서, 트랜스페린 또는 잔류 트랜스페린은 시험 스트립을 사용하여 검출된다. 일부 실시양태에서, 시험 스트립은 샘플 로딩 영역, 및 항-트랜스페린 항체를 포함하는, 샘플 로딩 영역의 하류의 결합 영역을 포함한다. 일부 측면에서, 결합 영역 내의 항-트랜스페린 항체는 표지된 항체이다. 트랜스페린은 표지된 항-트랜스페린 항체가 가시화되거나 다른 방식으로 검출되면서 검출 및/또는 측정된다. 추가의 측면에서, 시험 스트립은 결합 영역의 하류의 포획 영역을 추가로 포함하며, 여기서 포획 영역은 항-트랜스페린 항체-트랜스페린 복합체에 결합하는 포획 시약을 포함한다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 포획 시약은 시험 스트립에 고정된다. 추가의 측면에서, 포획 시약은 항체이다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 시험 스트립은 대조군 시약을 포함하는 대조군 영역을 추가로 포함한다. 대조군 시약은 예를 들어 표지된 항체에 대한 결합 친화도를 갖는 항체일 수 있다.

상기 논의된 바와 같이, 본 발명은 또한 수술 동안 또는 수술 후에 대상체에서 CSF 누출을 검출하는 방법을 포괄하며, 상기 방법은 a. 수술 전에 대상체로부터 제1 생물학적 샘플을 얻고, 제1 샘플에 존재하는 트랜스페린을 측정하는 단계; 및 b. 수술 동안 또는 수술 후에 대상체로부터 제2 생물학적 샘플을 얻고, 제2 샘플에 존재하는 트랜스페린을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 제1 샘플에 존재하는 트랜스페린과 비교하여 제2 샘플에 존재하는 트랜스페린의 보다 많은 양은 CSF 누출을 나타낸다. 일부 측면에서, 트랜스페린은 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 면역검정에 의해 검출된다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 트랜스페린은 시험 스트립을 사용하여 검출된다. 특정 측면에서, 샘플은 수득된 후에 희석된다. 또 다른 추가의 측면에서, sTF는 트랜스페린 측정 전에 제1 샘플로부터 및 제2 샘플로부터 제거된다.

상기 기재된 바와 같이, 본 발명은 또한 샘플에서 트랜스페린을 검출 또는 측정하기 위한 시험 스트립을 포괄하며, 상기 시험 스트립은 a. 샘플 로딩 영역; b. sTF에 결합하는 고정된 시약을 포함하는, 샘플 로딩 영역의 하류의 여과 영역; 및 c. 항-트랜스페린 항체를 포함하는, 여과 영역의 하류의 결합 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시험 스트립은 대조군 시약, 예를 들어 대조군 시약 항체를 포함하는 대조군 영역을 추가로 포함한다. 상기 논의된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 대조군 시약은 표지된 항체 및 표지된 항체 복합체에 대한 결합 친화도를 갖는 항체이고, 예를 들어 표지된 항체가 토끼 항체이면, 대조군 항체는 염소 항-토끼 항체일 수 있다. 추가의 또 다른 측면에서, 시험 스트립은 결합 영역의 하류의 포획 영역을 추가로 포함하며, 여기서 포획 영역은 항-트랜스페린 항체-트랜스페린 복합체에 결합하는 포획 시약을 포함하고, 예를 들어 포획 시약은 항-트랜스페린 항체이다. 특정 측면에서, 포획 시약은 시험 스트립에 고정된다. 추가의 실시양태에서, 결합 영역 내의 항-트랜스페린 항체는 표지된다.

일부 측면에서, 시험 스트립 상의 sTF에 결합하는 고정된 시약은 산화된 sTF에 결합하는 시약이고, 산화된 sTF는 sTF의 말단 잔기에 알데히드 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시약은 예를 들어 히드라지드 반응성 기를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 여과 영역은 니트로셀룰로스, PVDF 또는 다른 막을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 막은 히드라지드 반응성 기를 포함하고, 예를 들어 니트로셀룰로스 막은 히드라지드 반응성 기가 존재하고, 바람직하게는 고정되도록 코팅되거나 관능화될 수 있다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 여과 영역은 본원에서 기재되는 바와 같은 히드라지드 입자를 포함하며, 여기서 입자는 여과 영역에 고정된다. 따라서, 생물학적 샘플 내의 sTF는 시험 스트립의 여과 영역에 보유될 수 있고, 잔류 트랜스페린은 측방 유동에 의해 시험 스트립을 통해 이동할 수 있다.

측방 유동 및 측방 유동 시험 스트립은 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 예시적인 방법에서, 시험 샘플이 시험 표면에 첨가되고, 전형적으로 체이스 버퍼가 뒤이어 첨가된다. 체이스 버퍼는 시험 표면을 가로지른 체액의 유동을 용이하게 한다. 시험 스트립은 또한 표지된 항체, 예컨대 항체에 부착된 금 입자를 함유한다. 샘플에 존재하는 분석물 (트랜스페린 또는 잔류 트랜스페린)은 표지된 항체에 결합할 수 있고, 복합체는 모세관 작용에 의해 막을 통해 이동한다. 분석물 및 표지 복합체는 이어서 막에 고정된 항체에 결합하여 시험 대역에 착색 라인과 같은 검출가능한 지표를 생성할 수 있다. 분석물이 샘플에 존재하지 않으면, 접합체는 시험 대역을 지나 이동하고, 막의 시험 라인 상의 항체에 결합하지 않을 것이다. 선택적으로, 대조군 시약은 과량의 접합체를 포획하고 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대조군 시약 및 이로부터 생성된 라인은 시험이 적절히 수행되었음을 나타내는 대조군이다. 일부 실시양태에서, 결과는 약 1 내지 약 60분, 또는 약 1 내지 약 30분, 또는 약 5 내지 약 15분 내에 판독될 수 있다.

또 다른 추가의 실시양태에서, 본 발명은 샘플에서 트랜스페린의 존재를 검출하기 위한 디바이스로서, 디바이스는 본원에서 기재되는 시험 스트립, 및 시험 스트립을 함유하는 하우징을 포함하며, 여기서 하우징은 샘플 로딩 대역 내의 시험 스트립의 표면을 샘플에 노출시키기 위한 적어도 하나의 개방부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 디바이스는 핸드헬드 디바이스이다.

또 다른 추가의 측면에서, 본 발명은 본원에서 기재되는 시험 스트립 또는 디바이스, 및 산화제를 함유하는 용기를 포함하는 키트를 포괄한다. 일부 실시양태에서, 산화제는 소듐 퍼아이오데이트 또는 포타슘 퍼아이오데이트가다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 산화제는 갈락토스 옥시다제이다.

본원에서 기재되는 다양한 실시양태는 표지된 항체의 사용을 포함한다. 예시적인 표지는 예를 들어 효소 및 기질에 대한 그의 생성되는 효과, 콜로이드 금속 입자, 염료가 혼입된 라텍스, 및 염료 입자를 포함한다. 효소는 기질과 반응하여, 예를 들어 흡수 색상 (예를 들어, 자외선, 가시광선, 적외선) 또는 형광에 의해 검출가능한 생성물을 생성할 수 있다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 표지는 형광원성 표지, 발색원성 표지, 비오틴 분자 및/또는 금속 입자이다. 일부 측면에서, 금속 입자는 백금, 금, 은, 셀레늄, 또는 구리, 또는 특유한 색상을 보이는 임의의 다른 금속 화합물을 포함할 수 있다. 본 발명에 사용하기 적합한 금속 입자는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 금 졸 입자의 제조는 문헌 [Frens, Nature 241: 20-22 (1973)]에 기재되어 있다.

추가의 실시양태에서, 시험 스트립은 고체 지지체 (플라스틱, 카드보드, 또는 다른 단단한 또는 반 단단한 물질, 및 고체 지지체 상부 상의 막 (일부 예에서, 막은 니트로셀룰로스 또는 PVDF 막임)을 포함한다. 막은 본원에서 기재되는 샘플 로딩 영역 및 결합 영역을 포함한다. 또한, 막은 포획 영역 및/또는 대조군 영역을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 생물학적 샘플을 본원에서 기재되는 시험 스트립, 디바이스 또는 키트와 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 샘플에서 트랜스페린을 검출하거나 또는 트랜스페린의 양을 측정하는 방법을 포괄하며, 상기 방법은 결합 영역 또는 포획 영역에서 또는 결합 영역 또는 포획 영역의 하류에서 트랜스페린을 검출하거나 또는 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스페린은 β2-트랜스페린, 예를 들어, 아시알로-트랜스페린이다. 특정 측면에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플을 본원에서 기재되는 시험 스트립, 디바이스 또는 키트와 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 샘플에서 CSF의 존재를 검출하는 방법이며, 상기 방법은 결합 영역 또는 포획 영역에서 또는 결합 영역 또는 포획 영역의 하류에서 트랜스페린을 검출하거나 또는 측정하는 것을 포함한다.

본 발명은 다음의 실시예에 의해 예시되고, 실시예는 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다.

실시예

2. 재료 및 방법

2.1 효소 반응 및 표지

인간 혈청 sTF (10 mg/mL, 시그마(Sigma)) 1X 글리코버퍼 (5 mM CaCl₂를 포함하는 pH 5.5의 20 mM 아세트산나트륨 버퍼)에 용해시켰다. 인간 sTF 용액을 뉴라미니다제 (1X 글리코버퍼 내의 1 mg/mL, 시그마)로 37℃에서 밤새 처리하여 aTF를 생성하였다. sTF 및 aTF 둘 모두는 제조자의 프로토콜에 따라 NHS-로다민 (피어스(Pierce))으로 표지하였다. 모든 미반응 로다민을 PD 미니트랩(MiniTrap) G-25 칼럼 (지이 헬스케어(GE Heathcare))에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 제거하였다.

뉴라미니다제 (시그마) 및 갈락토스 옥시다제 (시그마)를 포함하는 2-단계 효소 반응은 인간 CSF (프리시전메드(PrecisionMed)), 모은 인간 혈청 (이노베이티브 리서치 인크.(Innovative Research Inc.)) 및 개개의 인간 혈청 샘플 (바이오리클레이메이션아이브이티(BioreclaimationIVT))에 대해 수행하였다. CSF와 혈청 둘 다는 먼저 1X 글리코버퍼 내에, 각각 2배 및 200배 희석되었다. 희석된 CSF (10 μL) 및 희석된 혈청 (10 μL)을 각각 뉴라미니다제 (1 mg/mL의 10 μL)로 37℃에서 1시간 동안 처리한 후, 37℃에서 100 mM의 pH 7.2의 트리스 버퍼 (0.5 KU/mL의 10 μL) 내에 용해시킨 갈락토스 옥시다제로 다양한 시간 동안 처리하였다.

2.2 아가로스 겔 전기영동

40 mL의 1X 트리스-보레이트 버퍼 (89 mM 트리스 염기 및 89 mM 붕산, pH 8.0)에 0.4 g의 아가로스 분말 (시그마)을 용해시킨 후, 전자레인지에서 아가로스를 용융시킨 후, 용융된 아가로스 용액을 주조 트레이에 붓고, 실온에서 냉각시킨 후 고체 겔을 형성함으로써 아가로스 겔 (1%)을 제조하였다. 로딩 샘플은 로다민-표지된 단백질 (10 μL 내의 20-320 ng)을 30% 글리세롤 (2 μL)과 혼합하여 제조하였다. 단백질 샘플을 로딩한 후, 겔을 200 V에서 15분 동안 전기영동하였다.

2.3 퍼아이오데이트 산화

약한 퍼아이오데이트 산화는 TF 내의 비-환원 말단부 시알산 잔기를 산화시키기 위해 30분 동안 4℃에서 (빙상에서) 1 mM NaIO₄로 수행하였다. 퍼아이오데이트 산화 동안 생성된 과량의 퍼아이오데이트 및 포름알데히드는 PD 미니트랩 G-25 칼럼 (지이 헬스케어)에 의해 제거하였다. G-25 칼럼을 사용하여 100 mM의 pH 7.0의 인산나트륨 버퍼를 사용한 탈염 및 버퍼 교환 후에, 산화된 시알산 잔기를 함유하는 TF는 SiMAG-히드라지드 마이크로입자 (케미셀(Chemicell))로 포획하였다.

2.4 시알로 -단백질의 커플링 및 분리

SiMAG-히드라지드 입자 (10 mg/ml)를 pH 7.0의 100 mM 인산나트륨 버퍼로 2회 세척한 후, 입자를 산화된 시알산 잔기를 함유하는 TF와 함께 20℃에서 3시간 동안 인큐베이팅하였다. 단백질-입자 접합체를 자기 분리기를 사용하여 펠렛화하였다. 상청액에 남아있는 단백질을 수집하고, 아미콘(Amicon) 초원심분리 필터 (울트라셀(Ultracel)-3K)로 농축하였다. aTF를 함유하는 농축된 샘플을 아가로스 겔 전기영동 또는 트랜스페린 ELISA 키트 (압캠(Abcam))를 사용하여 분석하였다.

2.5 ELISA 검정

시험 샘플에서 인간 TF는 트랜스페린 ELISA 검정 키트 (압캠)로 검출할 수 있다. 간단하게는, 표준물질 또는 시험 샘플을 TF 특이적 항체로 미리 코팅된 96-웰 플레이트에 첨가하고, 이어서 특이적인 비오티닐화된 TF 검출 항체를 첨가하고, 플레이트를 세척 버퍼로 세척하였다. 스트렙타비딘-퍼옥시다제 복합체를 첨가하고, 비결합된 접합체를 세척 버퍼로 세척 제거하였다. TMB는 퍼옥시다제에 의해 촉매되어, 산성 정지 용액 첨가 후에 황색으로 변하는 청색 생성물을 생성하기 때문에, TMB를 사용하여 스트렙타비딘-퍼옥시다제 효소 반응을 가시화하였다. 황색의 흡광도는 450 nm의 파장에서 마이크로플레이트 판독기 (스펙트라맥스(SpectraMax) M5, 몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices))로 즉시 측정하였다. 상세한 ELISA 프로토콜은 제조 가이드라인 (압캠)을 따랐다.

3. 결과 및 논의

뉴라미니다제는 sTF로부터 aTF를 생성하기 위해 사용되었다. 시알산 잔기를 제거한 후, TF를 NHS-로다민을 사용하여 표지하였다 (도 2a). 로다민-표지된 aTF 및 sTF는 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 분리될 수 있다 (도 2b). 결과는 더 많이 음으로 하전된 sTF가 애노드에 더 가까이 이동함을 제시하였다. 또한, 로다민-표지된 트랜스페린은 인간 혈장에서 선택적으로 검출될 수 있다 (도 2b). 로다민-표지된 TF에 대한 검출 한계는 2 μg/mL이었고 (도 2c), 이것은 면역고정 (IFE) 겔 전기영동에 의한 검출과 유사하다 [19].

인간 혈청 TF는 비-환원성 말단 시알산 잔기를 함유하는 2개의 글리칸을 갖는 당단백질 (sTF)이고 CSF는 sTF 및 aTF 둘 다를 함유하기 때문에 [7, 12], 약한 퍼아이오데이트 산화 [22]는 sTF를 히드라존으로서 포획될 수 있도록 만든다 (도 3a). 따라서, 본 발명자들은 CSF 내의 aTF의 검출을 용이하게 하기 위해 sTF를 선택적으로 제거하였다 (도 3a). sTF 내의 말단 시알산 잔기는 소듐 퍼아이오데이트으로 약하게 처리하여 그의 알데히드 유도체로 산화시키고 [22, 23], 산화된 sTF는 안정한 히드라존 연결의 형태로 SiMAG-히드라지드 (자성 히드라지드 마이크로입자)에 대한 공유 커플링에 의해 포획되었다. 이어서, sTF-비드 접합체는 자기 분리기를 사용하여 쉽게 제거될 수 있다 (도 3b). 개념 증명으로서, 본 발명자들은 상이한 농도 (100 μL)의 sTF 및 aTF를 약한 퍼아이오데이트 산화 (30분 동안 4℃에서 1 mM NaIO₄)에 적용하고, sTF 내의 말단 시알산 잔기의 C-7 위치에 알데히드를 선택적으로 도입하였다. 세파덱스 G-25 칼럼에서 탈염함으로써 비반응 산화 시약을 제거한 후, 알데히드 기 함유 sTF를 3시간 동안 20℃에서 200 μL의 SiMAG-히드라지드 (10 mg/mL)와 함께 인큐베이팅하여 포획하였다. 포획된 sTF는 자기 분리기로 제거하고, 미량의 잔류 sTF와 함께 aTF를 함유하는 상청액을 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 검정하였다 (도 3c). 결과는 sTF가 SiMAG-히드라지드를 사용한 공유 포획을 통해 선택적으로 제거되고 aTF는 상청액 버퍼에 남아있음을 제시하였다. sTF의 고농도 (0.8 mg/mL)에서, 그의 포획에 필요한 SiMAG-히드라지드의 불충분한 양의 존재 때문에 ~50%의 sTF가 상청액 버퍼에 잔류하였다. 본 발명자들이 SiMAG-히드라지드의 양을 2배(20 mg/mL)로 늘리면, 잔류 sTF는 <3%로 떨어졌다 (데이터는 제시되지 않음). 상기 약한 퍼아이오데이트 산화는 30분 내에 알데히드 기를 sTF 내에 신속하게 선택적으로 도입하고 (도 3c), <5시간의 총 전처리 시간을 필요로 하는 SiMAG-히드라지드 자성 마이크로입자와의 커플링은 3시간 내에 수행될 수 있다. 이러한 결과에 고무된 본 발명자들은 CSF를 검출하기 위해 개발된 프로토콜을, CSF와 혈청의 혼합물로 이루어지는 샘플에서 aTF를 검출하기 위해 적용하였다.

로다민-표지된 (200배) 희석된 혈청과 로다민-표지된 (2배) 희석된 CSF의 혼합물 (10 μL)을 CSF 및 혈청 둘 다를 함유하는 샘플에 대한 개념 증명 시험으로서 약한 퍼아이오데이트 산화에 적용하였다. 상기 기재한 프로토콜에 따라 혈청 및 CSF 둘 다로부터 sTF를 선택적으로 분리한 후, 아가로스 겔 내의 잔류 sTF를 분석하였다 (도 4a). 혈청 내의 sTF 수준은 CSF 내의 sTF보다 더 높았고, 혈청 및 CSF 둘 다에 존재하는 모든 sTF는 약한 퍼아이오데이트 산화 및 SiMAG-히드라지드를 사용한 포획에 의해 성공적으로 제거되었다 (도 4a의 하부 밴드).

혈청과 CSF 둘 다에 존재하는 단백질의 복합체 혼합물 때문에 아가로스 겔에서 aTF 밴드를 직접 검출하는 것은 불가능하였다. 따라서, CSF와 혈청 둘 다에서 잔류 TF를 검출하기 위해 TF만을 특이적으로 포획하기 위해 인간 트랜스페린 ELISA를 수행하였다 (도 4b). CSF 내의 잔류 TF (aTF)의 양은 혈청 내의 잔류 TF (비포획된 sTF)의 양보다 분명히 더 많았다. 그러나, 시알산 잔기의 불완전한 산화 또는 비효율적인 포획 때문에 미량의 잔류 TF (비포획된 sTF)가 혈청에 계속 존재하였다. ELISA에서 TF의 표준 곡선 (데이터는 제시되지 않음)에 기초하여, 혈청 내의 미량의 잔류 TF의 수준은 버퍼 대조군의 수준과 유사한 ~7 ng/mL이었다. 이와 대조적으로, CSF 내의 잔류 TF (aTF)는 CSF 내의 초기 TF 양 (~170 ng/mL)의 1/3에 해당하는 ~60 ng/mL이었다. 이 결과는 CSF 내의 총 TF의 ~30%만이 aTF이기 때문에 예상되었다 [7]. 본 발명자들은 CSF 누출의 실제 상황을 시뮬레이션하기 위해 혈청과 CSF의 혼합물을 상이한 부피비로 준비하였다. 상기 프로토콜을 사용하여 혈청과 CSF의 혼합물로부터 sTF를 선택적으로 제거한 후, 잔류 TF (주로 aTF)를 ELISA 키트에 의해 측정하였다 (도 4c). 그 결과는 혈청과 CSF의 혼합물로부터의 잔류 TF의 양이, 버퍼 내의 상이한 양의 CSF (혈청과 CSF의 혼합물의 동일한 희석 비율임)로부터의 잔류 TF의 양과 유사함을 제시하였다. 또한, 본 발명자들은 여러 혈청 샘플 (S1: 29세/아프리카 남성, S2: 41세/백인 남성, S3: 61세/히스패닉계 여성, S4: 21세/아프리카 여성)을 사용하고, CSF와 다양한 혈청의 혼합물 (1:1 v/v 비)을 제조하고, sTF를 선택적으로 제거하였다. 상이한 혈청 샘플과 CSF의 혼합물로부터의 초기 및 잔류 TF 둘 다를 ELISA 키트로 측정하였다 (도 4d). CSF로부터의 잔류 TF (주로 aTF)는 혈청 종류와 상관없이 분명하게 검출되었고, 혈청으로부터의 잔류 TF의 양은 음성 대조군 (버퍼 단독)과 유사하였다.

본 발명자들은 sTF의 선택적 제거를 통해 CSF와 혈청을 구별할 수 있었지만, 혈청 sTF의 완전한 제거는 CSF와 혈청의 혼합물을 분석할 때 CSF에서 aTF의 정확한 결정을 위해 바람직하다. 따라서, 본 발명자들은 효소가 매우 높은 기질 특이성을 제시하기 때문에 sTF 내에 알데히드 기를 생성하기 위한 2-단계 효소 (뉴라미니다제 및 갈락토스 옥시다제) 반응을 조사하였다. CSF-유래 aTF에는 비-환원성 말단 시알산 잔기 및 갈락토스 잔기가 존재하지 않기 때문에 [7], 2-단계 효소 반응은 갈락토스 잔기의 C-6 위치의 알데히드 기를 sTF 내에 정량적으로 및 선택적으로 도입하여야 한다 (도 5a). 희석된 (2배) CSF 및 (200배) 혈청 둘 다의 10 μL 샘플을 37℃에서 뉴라미니다제 (1 mg/mL의 10 μL) 및 갈락토스 옥시다제 (0.5 KU/mL의 10 μL)에 첨가하였다. 샘플을 상이한 시간 동안 2개의 효소와 반응시킨 후, SiMAG-히드라지드 (10 mg/mL의 100 μL)를 반응 혼합물에 첨가하고, 산화된 sTF를 포획하기 위해 20℃에서 추가로 3시간 동안 인큐베이팅하였다. 마이크로입자-포획된 산화된 sTF를 자기 분리기로 침강시킨 후, 상청액 내의 잔류 TF를 ELISA로 측정하였다 (도 5b). 결과는 본 발명자들이 상기 2-단계 효소 반응에서 혈청 sTF를 완전히 제거할 수 있음을 제시하였지만, 이 절차는 24시간을 필요로 하였다. 그러나, 상기 2-단계 과정은 모든 sTF를 성공적으로 제거할 수 있었지만, 이 전처리 단계는 외과의사의 즉각적인 임상 결정을 수용하기에는 너무 긴 ~24시간을 필요로 하였다. 따라서, 향후 연구는 퍼아이오데이트 전처리의 선택성을 개선하고 2-단계 효소 전처리에 필요한 시간을 단축시키는 것을 목표로 할 것이다.

CSF의 신속하고 민감한 검출은 환자 치료와 관련하여 실시간으로 중요한 결정을 내리기 위해 중요하다 [24]. 예를 들어, CSF 누출이 수술 후 발생하는 경우, 환자는 CSF 누출을 조사하고 복구하기 위해 신속하게 수술실로 보낼 필요가 있을 수 있고, 다시 체위성 두통 및 오염된 피부와의 접촉에 의한 잠재적인 감염, 이에 의한 수막염 발생 위험의 증가에 대해 치료될 것이다. 체액이 처음 발견된 시점에, 체액이 CSF를 함유하는지 의사가 확신하지 못하는 경우, 종종 의사는 단지 확증 분석을 기다릴 수 있고, 이것은 조치를 지연하고, 더 불량한 환자의 예후를 야기할 수 있다. 일부 경우에서, 환자는 체위성 두통에 대한 고전적인 표현을 할 수 없을 수 있고, 이것은 CSF 체액 누출의 진단을 더 지연시킬 수 있다. 따라서, CSF 체액의 존재를 검출할 수 있는 신속한 시험을 통해, 척추 외과의사는 즉각적인 임상 결정을 내릴 수 있고, 이에 따라 환자 치유를 개선할 수 있다.

β2 트랜스페린 (β2TF)의 형성은 중추 신경계 내에서 뉴라미니다제 활성에 의해 매개된다 [25]. 따라서, β2TF는 CSF 누출에 대한 효능 있는 매우 선택적인 마커 단백질을 나타내고, 이것은 β2TF가 아시알릴화 TF 당형태인 aTF로서 존재하는 CSF 내에만 위치하기 때문이다. 이러한 해부학적 선택성은 CSF 관련 β2TF (aTF)의 검출을 가능하게 하는, 체액 누출 샘플에서 혈청 sTF의 신속하고 선택적 제거를 위한 전처리 방법의 개발을 가능하게 하였다. 신속한 전처리 방법은 또한 사용하기 쉬운 간단한 TF 시험 키트의 상업적 개발을 용이하게 할 것이다.

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본 발명은 그의 바람직한 실시양태를 참조하여 구체적으로 제시되고 기재되었지만, 첨부된 청구범위에 포괄되는 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부 사항에서의 다양한 변화가 이루어질 수 있음이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다.

Claims

생물학적 샘플에서 뇌척수액 (CSF)의 존재를 검출하는 방법이며,
a. 생물학적 샘플을 얻는 단계;
b. 산화된 시알로-트랜스페린 (sTF)을 생성하기에 충분한 양으로 산화제를 샘플에 첨가하며, 여기서 산화된 sTF는 말단 잔기에 알데히드 기를 포함하는 것인 단계;
c. 단계 b로부터 얻은 샘플을 히드라지드 반응성 기를 포함하는 시약과 접촉시키며, 여기서 산화된 sTF는 히드라지드 반응성 기에 결합하여 복합체를 형성하는 것인 단계;
d. 샘플로부터 복합체를 제거하여 잔류 샘플을 형성하는 단계; 및
e. 잔류 샘플에서 잔류 트랜스페린의 존재를 검출하는 단계
를 포함하며, 여기서 생물학적 샘플에서 잔류 트랜스페린의 검출은 CSF의 존재를 나타내는 것인 방법.
제1항에 있어서, 잔류 트랜스페린이 β2-트랜스페린을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 산화제가 퍼아이오데이트 염인 방법.
제2항에 있어서, 산화제가 소듐 퍼아이오데이트인 방법.
제1항에 있어서, 산화제가 갈락토스 옥시다제이고, 샘플이 산화 전에 뉴라미니다제로 처리되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 산화된 sTF가 공유 결합에 의해 히드라지드 반응성 기에 결합하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 히드라지드 반응성 기를 포함하는 시약이 자성 히드라지드 입자인 방법.
제7항에 있어서, 자성 히드라지드 입자가 자성 히드라지드 마이크로입자인 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, 복합체가 자기 분리기를 사용하여 제거되는 것인 방법.
제9항에 있어서, 잔류 트랜스페린이 자기 분리기를 사용한 후에 상청액에 존재하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 히드라지드 반응성 기를 포함하는 시약이 비오티닐화된 히드라지드이고, 복합체가 비오티닐화된 복합체인 방법.
제11항에 있어서, 비오티닐화된 복합체가 비오틴-결합 단백질을 사용하여 포획되는 것인 방법.
제12항에 있어서, 비오틴-결합 단백질이 아비딘 또는 스트렙타비딘인 방법.
제13항에 있어서, 비오티닐화된 복합체가 스트렙타비딘-커플링된 입자를 사용하여 포획되는 것인 방법.
제14항에 있어서, 스트렙타비딘-커플링된 입자가 자성 입자인 방법.
제1항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈청, 혈액, 혈장, 비강 체액, 귀 체액, 생검 샘플, 림프액 샘플, 머리 또는 척추 상처 또는 천자로부터의 체액, 또는 수술 절개 부위로부터의 체액인 방법.
제16항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈청인 방법.
제1항에 있어서, 생물학적 샘플이 수술 동안 또는 수술 후에 환자로부터 얻은 샘플인 방법.
제18항에 있어서, 샘플이 척추 수술 동안 또는 수술 후에 환자로부터 얻어지는 것인 방법.
제1항에 있어서, 샘플이 수술 동안 또는 수술 후에 환자의 절개 부위로부터 얻어지는 것인 방법.
제1항에 있어서, 샘플이 수술후 체액 저류로부터 얻어지는 것인 방법.
제1항에 있어서, 잔류 트랜스페린이 면역검정에 의해 검출되는 것인 방법.
제22항에 있어서, 잔류 트랜스페린이 샌드위치 면역검정에 의해 검출되는 것인 방법.
제22항에 있어서, 잔류 트랜스페린이 ELISA에 의해 검출되는 것인 방법.
제22항에 있어서, 잔류 트랜스페린이 경쟁적 면역검정에 의해 검출되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 잔류 트랜스페린이 시험 스트립을 사용하여 검출되는 것인 방법.
제1항 또는 제22항에 있어서, 잔류 트랜스페린이 항-트랜스페린 항체를 사용하여 검출되는 것인 방법.
제23항 또는 제24항에 있어서, 잔류 샘플이 항-트랜스페린 항체로 코팅된 고체 지지체에 첨가되는 것인 방법.
제28항에 있어서, 표지된 검출 항체가 고체 지지체에 첨가되는 것인 방법.
제29항에 있어서, 표지된 검출 항체가 항-트랜스페린 항체인 방법.
제29항 또는 제30항에 있어서, 표지된 검출 항체가 형광원성 표지, 발색원성 표지, 비오틴 분자 및/또는 금 입자에 접합된 항체인 방법.
제31항에 있어서, 표지된 검출 항체가 비오티닐화된 항체인 방법.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 대상체에서 CSF 누출을 검출하기 위해 사용되는 것인 방법.
제33항에 있어서, 대상체가 척추 수술을 받았던 것인 방법.
제34항에 있어서, 척추 수술이 요추 수술인 방법.
제1항에 있어서, 샘플이 얻어진 후에 희석되는 것인 방법.
제26항에 있어서, 시험 스트립이
a. 샘플 로딩 영역; 및
b. 항-트랜스페린 항체를 포함하는, 샘플 로딩 영역의 하류의 결합 영역
을 포함하는 것인 방법.
제37항에 있어서, 항-트랜스페린 항체가 검출가능하게 표지되는 것인 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서, 시험 스트립이 결합 영역의 하류의 포획 영역을 추가로 포함하며, 여기서 포획 영역은 항-트랜스페린 항체-트랜스페린 복합체에 결합하는 포획 시약을 포함하는 것인 방법.
제39항에 있어서, 시험 스트립이 결합 영역의 하류의 포획 영역을 추가로 포함하며, 여기서 포획 영역은 항-트랜스페린 항체-트랜스페린 복합체에 결합하는 포획 시약을 포함하며, 여기서 포획 시약은 고정되는 것인 방법.
제39항 또는 제40항에 있어서, 포획 시약이 항-트랜스페린 항체인 시험 스트립.
생물학적 샘플로부터 시알로-트랜스페린 (sTF)을 제거하는 방법이며,
a. 생물학적 샘플을 얻는 단계;
b. 산화된 sTF를 생성하기에 충분한 양으로 산화제를 샘플에 첨가하며, 여기서 산화된 sTF는 말단 잔기에 알데히드 기를 포함하는 것인 단계;
c. 단계 b로부터 얻은 샘플을 히드라지드 반응성 기를 포함하는 시약과 접촉시키며, 여기서 산화된 sTF는 반응성 기에 결합하여 복합체를 형성하는 것인 단계; 및
d. 샘플로부터 복합체를 제거하는 단계
를 포함하는 방법.
제42항에 있어서, 산화제가 퍼아이오데이트 염인 방법.
제43항에 있어서, 산화제가 소듐 퍼아이오데이트인 방법.
제42항에 있어서, 산화제가 갈락토스 옥시다제이고, 샘플이 산화 전에 뉴라미니다제로 처리되는 것인 방법.
제42항에 있어서, 산화된 sTF가 공유 결합에 의해 히드라지드 기에 결합하는 것인 방법.
제42항에 있어서, 히드라지드 반응성 기를 포함하는 시약이 자성 히드라지드 입자인 방법.
제47항에 있어서, 자성 히드라지드 입자가 자성 히드라지드 마이크로입자인 방법.
제47항 또는 제48항에 있어서, 복합체가 자기 분리기를 사용하여 제거되는 것인 방법.
제42항에 있어서, 히드라지드 반응성 기를 포함하는 시약이 비오티닐화된 히드라지드이고, 복합체가 비오티닐화된 복합체인 방법.
제50항에 있어서, 비오티닐화된 복합체가 비오틴-결합 단백질을 사용하여 포획되는 것인 방법.
제51항에 있어서, 비오틴-결합 단백질이 아비딘 또는 스트렙타비딘인 방법.
제52항에 있어서, 비오티닐화된 복합체가 스트렙타비딘-커플링된 입자를 사용하여 포획되는 것인 방법.
제53항에 있어서, 스트렙타비딘-커플링된 입자가 자성 입자인 방법.
제42항에 있어서, 생물학적 샘플이 비강 체액, 귀 체액, 혈액, 혈청, 머리 또는 척추 상처 또는 천자로부터의 체액, 또는 수술 절개 부위로부터의 체액인 방법.
제55항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈청인 방법.
제42항에 있어서, 생물학적 샘플이 수술 동안 또는 수술 후에 환자로부터 얻은 샘플인 방법.
제57항에 있어서, 샘플이 척추 수술 동안 또는 수술 후에 환자로부터 얻어지는 것인 방법.
제55항에 있어서, 샘플이 수술 동안 또는 수술 후에 환자의 절개 부위로부터 얻어지는 것인 방법.
제55항에 있어서, 샘플이 수술후 체액 저류로부터 얻어지는 것인 방법.
수술 동안 또는 수술 후에 대상체에서 CSF 누출을 검출하는 방법이며,
a. 수술 전에 대상체로부터 제1 생물학적 샘플을 얻고, 제1 샘플에 존재하는 트랜스페린을 측정하는 단계; 및
b. 수술 동안 또는 수술 후에 대상체로부터 제2 생물학적 샘플을 얻고, 제2 샘플에 존재하는 트랜스페린을 측정하는 단계
를 포함하며, 여기서 제1 샘플에 존재하는 트랜스페린과 비교하여 제2 샘플에 존재하는 트랜스페린의 보다 많은 양은 CSF 누출을 나타내는 것인 방법.
제61항에 있어서, 트랜스페린이 면역검정에 의해 검출되는 것인 방법.
제61항에 있어서, 트랜스페린이 시험 스트립을 사용하여 검출되는 것인 방법.
제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스페린이 항-트랜스페린 항체를 사용하여 검출되는 것인 방법.
제61항에 있어서, 대상체가 척추 수술을 받았던 것인 방법.
제65항에 있어서, 척추 수술이 요추 수술인 방법.
제61항에 있어서, 샘플이 얻어진 후에 희석되는 것인 방법.
제61항에 있어서, 트랜스페린이 측정되기 전에 sTF가 제1 샘플 및 제2 샘플로부터 제거되는 것인 방법.
제68항에 있어서, β2-트랜스페린이 측정되는 것인 방법.
샘플에서 트랜스페린을 검출 또는 측정하기 위한 시험 스트립이며,
a. 샘플 로딩 영역;
b. sTF에 결합하는 고정된 시약을 포함하는, 샘플 로딩 영역의 하류의 여과 영역; 및
c. 항-트랜스페린 항체를 포함하는, 여과 영역의 하류의 결합 영역
을 포함하는 시험 스트립.
제70항에 있어서, 대조군 항체를 포함하는 대조군 영역을 추가로 포함하는 시험 스트립.
제70항 또는 제71항에 있어서, 결합 영역의 하류의 포획 영역을 추가로 포함하며, 여기서 포획 영역은 항-트랜스페린 항체-트랜스페린 복합체에 결합하는 포획 시약을 포함하는 것인 시험 스트립.
제72항에 있어서, 포획 시약이 항-트랜스페린 항체인 시험 스트립.
제70항에 있어서, 결합 영역 내의 항-트랜스페린 항체가 검출가능하게 표지되는 것인 시험 스트립.
제74항에 있어서, 항-트랜스페린 항체가 형광원성 표지, 발색원성 표지, 비오틴 분자 및/또는 금 입자에 접합된 항체인 시험 스트립.
제72항 또는 제73항에 있어서, 포획 시약이 고정되는 것인 시험 스트립.
제70항에 있어서, sTF에 결합하는 고정된 시약이 산화된 sTF에 결합하는 시약이고, 산화된 sTF가 sTF의 말단 시알산 잔기에 알데히드 기를 포함하는 것인 시험 스트립.
제77항에 있어서, 시약이 히드라지드 반응성 기를 포함하는 것인 시험 스트립.
제78항에 있어서, 시약이 반응성 히드라지드 기를 포함하는 입자인 시험 스트립.
샘플에서 트랜스페린의 존재를 검출하기 위한 디바이스이며,
a. 제70항 내지 제79항 중 어느 한 항의 시험 스트립;
b. 시험 스트립을 함유하는 하우징으로서, 여기서 하우징은 샘플 로딩 대역 내의 시험 스트립의 표면을 샘플에 노출시키기 위한 적어도 하나의 개방부를 포함하는 것인 하우징
을 포함하는 디바이스.
제75항에 있어서, 디바이스가 핸드헬드 디바이스인 디바이스.
제70항 내지 제79항 중 어느 한 항의 시험 스트립, 및 산화제를 함유하는 용기를 포함하는 키트.
제81항 또는 제82항의 디바이스, 및 산화제를 함유하는 용기를 포함하는 키트.
생물학적 샘플을 제70항 내지 제79항 중 어느 한 항의 시험 스트립, 또는 제80항 또는 제81항의 디바이스, 또는 제82항 또는 제83항의 키트와 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 샘플에서 트랜스페린을 검출하거나 또는 트랜스페린의 양을 측정하는 방법이며, 상기 방법은 결합 영역에서 또는 포획 영역의 하류에서 트랜스페린을 검출하거나 또는 측정하는 것을 포함하는 것인 방법.
제84항에 있어서, 샘플이 생물학적 샘플인 방법.
제84항에 있어서, 방법이 CSF 누출을 검출하기 위해 사용되고, 샘플이 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플인 방법.