KR101452730B1 - 신규한 위암 진단방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 당쇄변화 탐지를 통한 위암 진단방법 및 위암 진단용 킷트에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로는 렉틴 및 질량분석방법을 통해 탐지된 위암 환자 유래 햅토글로빈 (haptoglobin)의 N-당쇄화 (N-linked glycosylation) 변화 중 퓨코실화의 증가, 가지 (antennary) 구분에 따른 특정 당쇄구조들이 증가하거나 유의하게 변화한 경우, 또는 N-당쇄의 고 만노스 구조가 정상인에 비해 감소하는 것을 바탕으로, 상기 발굴된 N-당쇄 구조들은 진단마커로서 렉틴 또는 질량분석방법을 활용하는 위암 진단 방법 및 위암을 진단하는 킷트에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 위암 진단방법 {Novel diagnostic method for gastric cancer}
본 발명은 당쇄변화 탐지를 통한 신규한 위암 진단방법, 위암 진단용 킷트 및 위암 진단 정보를 제공하기 위한 당쇄변화 탐지 방법에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로는 렉틴 및 질량분석방법을 통해 탐지된 혈액 유래 햅토글로빈의 N-당쇄 변화를 이용한 위암 진단방법 및 위암 진단용 킷트에 관한 것이다.
암은 세계적으로 제1의 사망원인이며, 이 상황은 국내에도 마찬가지이다. 암은 유전적, 환경적 요인에 의해서 형성, 발전하며 식생활의 변화, 환경오염의 심화, 환경 및 정신적 스트레스의 노출 심화 등으로 인하여 암 발생 및 암으로 인한 사망자가 해마다 증가하는 추세이다. 다른 질병과 비교해 볼 때 암의 특징은 완치가 비교적 어렵다는 것과 치료 후 생존율이 평균적으로 낮다는데 있다. 생존율과 관련하여 암이 갖는 특징은 암의 진행 정도에 따라 환자의 예후와 생존율이 큰 차이를 보인다는 것인데 약 100여 년에 가까운 암치료기술의 발전에도 불구하고 암종마다 약간의 차이는 있지만 말기 암이나 전이가 이루어진 암의 경우는 완치율이 매우 낮다 (Etzioni R. et al., Nature Reviews Cancer 3, 243-252, 2003). 더욱이 암은 초기에 자각증상이 별로 없는 것이 일반적이며 자각증상에 의한 진단의 경우는 이미 치료가 불가능한 말기 상태로 발전한 경우가 많다. 즉, 암의 치료법 개발 필요성과 함께 치료가 가능한 초기에 암을 진단할 수 있는 방법이 암의 효과적인 치료와 생존율 제고라는 목표에 가장 부합하는 전략이라고 할 수 있다. 이러한 목적으로 암의 조기진단을 도울 수 있는 생체인자, 즉 바이오마커의 연구, 개발이 현재 프로테오믹스 기법을 중심으로 해서 세계적으로 활발하게 진행되고 있다.
종양 바이오마커는 다양한 용도가 있는데, 암의 조기진단을 도울 수 있고, 암의 진행 시기를 측정하고, 치료에 따른 암의 진행상황을 모니터할 수 있게 하며 수술 후의 예후를 판단할 수 있게 하는 기능도 있다 (Rifai N. et al., Nature Biotech. 24, 971-983, 2006). 이런 목적과 기능을 가진 바이오마커를 통하여 암의 발견 및 진행상황을 추적하기 위해서는 비파괴적인 방법이 요구되며, 따라서 검사시 위험부담이 적은 혈액 등의 체액이 바이오마커 개발연구에 있어 최적의 생체시료로 인식되고 있다. 즉, 소변이나 타액, 혈액 등을 통하여 탐지할 수 있는 바이오마커 개발이 가장 표준화된 방식의 접근법이며, 그 중에서도 혈액은 모든 조직 유래의 단백질이 모이는 가장 포괄적인 생체시료라고 할 수 있다. 또한, 생체물질의 형태로 볼 때 가장 선호되는 종양 바이오마커의 형태는 단백질이라고 할 수 있다.
국내 암발생률 1위인 위암을 진단받은 환자의 진단을 위한 방법 중 가장 많이 이용되는 검사는 위내시경 검사와 초음파 검사 등이 있다. 하지만 이러한 위암 진단방법은 고가의 의료장비를 이용하기 때문에 비용이 많이 소요된다는 문제점이 있고, 내시경 검사는 환자의 입장에서 거부감이 있다.
이러한 문제로 인하여 소량의 체액, 특히 혈액으로 암을 검사할 수 있는 체외 진단 기술에 응용 가능한 종양 바이오마커의 개발이 필요하다. 실제 지금까지는 FDA의 승인을 받은 위암 관련 혈액 유래 바이오마커는 없는 실정이다.
인체 내 단백질의 50% 이상이 당단백질이라는 점에서 많은 인체 질환이 당단백질과 관련되어 있을 확률이 높다. 따라서 질병에 연관된 당단백질을 탐색하고 그것의 질병특이적인 당쇄구조분석 연구를 통하여 진단 마커 개발이 가능하다.
대부분 암의 생화학적인 연구는 단백질의 발현변화에 초점이 맞추어졌으나 당쇄 구조 해석 기술의 발달에 따라 암 연구에서 복합 당질 당쇄의 중요성이 커지고 있는 상황이다. 해독 후 변형(post-translational modification)의 과정 중 하나인 당쇄화 (glycosylation)가 종양 발달을 표지할 수 있음이 알려져 있으나 현재까지 종양에서 당쇄구조가 변화하는 이유에 대한 정확한 과학적 근거는 밝혀지지 않고 있다. 하지만, 이러한 암종 특이적인 당쇄는 혈액으로 배출될 수 있는데, 이러한 당쇄는 다양한 종류의 항체 등을 이용하여 진단의 목적으로 이용될 수 있다.
식물에서 유래한 렉틴은 다양한 당쇄구조를 인식할 수 있는데, 이러한 렉틴은 쉽게 이용이 가능하며 가격도 저렴하여 당쇄구조를 검출하기 위한 목적으로 많이 이용되고 있다. 또한, 최근에는 진보된 방식의 질량분석기를 이용하여 좀 더 미량의 당쇄를 분석할 수 있는 방법들이 발달하고 있다.
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본 발명은 우수한 위암 진단용 바이오마커를 제공하는 것을 목표로 한다.
또한, 본 발명은 위암 진단용 킷트를 제공하는 것을 목표로 한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 위암의 신속하고 민감한 진단을 위한 위암 바이오마커 분석방법을 제공하는 것을 목표로 한다.
본 발명자들은 렉틴을 이용하여 혈액 내 당단백질에서 위암 특이적인 당쇄의 변화를 감지하고, 해당되는 당단백질인 햅토글로빈을 발굴하였으며, 이를 정제하여 렉틴 및 질량분석기를 이용하여 정상인과 구별되는 위암 특이적인 당쇄를 확인하였다. 본 발명자들은 햅토글로빈을 대상으로 렉틴을 이용한 렉틴 블랏팅을 수행하였으며, 햅토글로빈을 PNGase F로 처리하여 얻은 N-당쇄의 정량, 정성정보 및 당사슬 구조 내 퓨코스의 위치를 질량분석기를 통하여 확인하였다.
본 발명자들은 정상인 대조군과 비교하여 초기 위암 환자뿐만 아니라 말기 위암환자의 햅토글로빈에서 특이한 퓨코실화 및 높은 가지 (antennary) 구조의 현저한 증가를 관찰하였다. 위암 환자 햅토글로빈의 잘못된 당쇄화는 혈청 유래 햅토글로빈의 면역친화 정제 이후 렉틴 블랏팅, MALDI-TOF MS, 칩-기반 나노-LC/TOF-MS (Chip/TOF) 및 CID (collision-induced dissociation) 단편화로 타겟화된 MS/MS와 같은 다양한 글라이코믹스 분석의 조합에 의하여 입증되었다.
본 발명의 결과는 정상인 대조군과 비교하여 위암 환자 혈청 햅토글로빈에서 AAL 및 PHA-L 렉틴 블랏팅이 높음을 명확히 나타낸다 (도 1). 본 발명자들은 조혈청에서 잘못된 당쇄를 보유하는 단백질을 확인하기 위해 SDS-PAGE, 다양한 렉틴 블랏팅 및 관심 대상 렉틴에 민감한 스팟에 대한 LC-MS/MS로의 확인과 같은 방법들을 조합한 글라이코프로테오믹스 접근을 수행하여 약 45 kDa 분자량을 갖는 당단백질 스팟에서 정상인 대조군과 위암환자 사이에 렉틴 결합에 차이가 있음을 관찰하였다. 글라이코믹스 연구분야에서 렉틴은 상업적으로 입수 가능하고 실험에 적용하기 용이하기 때문에 특이한 당쇄화 경로와 관련된 당쇄 구조를 확인하는데 널리 이용되고 있다. 흥미롭게도, 정상인 대조군과 비교하여 위암환자군의 혈청에서 이 스팟의 퓨코실화 및 높은 가지 구조의 증가가 관찰되었다. 인-젤 트립신 절단 이후 LC-MS/MS 분석 결과 이 스팟은 햅토글로빈으로 밝혀졌고, 그 분자량은 항-햅토글로빈 웨스턴 블랏팅으로 확인되었다. 햅토글로빈은 아주 풍부한 당단백질 중 하나이며, 염증 및 종양과 같은 다양한 질병 진행단계에서 증가하는 주요 급성상 단백질 (acute phase protein)이다. 햅토글로빈에는 184, 207, 211 및 241 아스파라긴에 네 개의 N-당쇄화 부위가 있고, 하나의 O-당쇄화 부위가 있다고 알려져 있다. 어떤 당쇄화 타입과 어떤 당쇄화 부위가 위암 환자와 정상인 대조군 간에 구별되는 당쇄 변화를 제공하는지는 알려져 있지 않다.
렉틴 스크리닝으로 얻은 징후를 확인하기 위하여 혈청 유래 햅토글로빈 정제를 항-햅토글로빈 친화 크로마토그래피로 수행하였다 (도 4A). 왜냐하면 혼합 시료에 의해 당쇄의 정확한 구조가 감추어지기 때문에 정제된 단백질을 확인할 필요가 있는 것이다. 정제된 햅토글로빈의 렉틴 블랏팅으로 본 발명자들은 위암 환자 햅토글로빈의 잘못된 당쇄화 즉, 퓨코실화 및 높은 가지 (antennary) 구조를 확인하였다 (도 4B). 이 결과는 햅토글로빈의 퓨코실화 및 세 가지 (tri-antennary) 이상의 복합형 N-당쇄가 위암 진단에 효과적으로 이용될 수 있으며, 그 당쇄구조와 반응성을 나타내는 AAL과 PHAL 렉틴을 활용하는 위암 진단 가능성을 제공한다.
퓨코스 잔기는 α1-3/4/6 연결 글라이코시드 결합에 의해 GlcNAc와 연결될 수 있고, 루이스 혈액형 항원과 관련이 있다. 햅토글로빈의 다중 가지 N-당쇄는 PHAL 렉틴에 의해 나타나는 GlcNAcβ1-6Manα1-6Man 곁가지에 의해 완성된다. 위암환자 햅토글로빈에서 어느 퓨코스 잔기가 강화되는지, 가지 구조 분포가 어떤지에 대해서는 좀 더 연구가 필요하다. 그리하여 본 발명자들은 렉틴 블랏팅 및 면역친화 정제 후 칩-기반 나노-LC/TOF-MS (Chip/TOF) 분석을 이용하여 통합된 글라이코믹스로 정확한 당쇄화 상태를 결정하였다. LC-MS는 MALDI-MS보다 높아진 민감도 및 이온 단편화가 덜 얻어지므로, 본 발명자들은 햅토글로빈의 상세한 당쇄 구조를 성공적으로 설명할 수 있었다. 결론적으로, 위암 환자 유래 햅토글로빈에서 퓨코실화 및 높은 가지 (antennary) 구조로 변형된 당쇄화가 탐지되었다.
당쇄구조 프로파일링을 통하여 바뀐 퓨코실화 및 가지 (antennary) 구조뿐만 아니라 정상인 대조군과 위암환자군 간에 현저한 차이를 보이는 몇몇 당쇄구조를 발견할 수 있었다. 세 가지 (tri-antennary) 구조 중에 2151.774의 질량 값을 나타낸 Hex6-HexNAc5-Fuc1의 상대값이 가장 큰 차이를 보였으며 (P value=0.000699), 고 만노스 구조를 가진 다양한 N-당쇄 구조들도 정상인 대조군과 위암환자 사이에 상대적 양에서 현저한 차이를 나타내었다 (도 2, 표 2).
본 발명자들은 직접 위암 환자 유래 혈청 햅토글로빈에서 퓨코스의 잘못된 당쇄화를 발견하였다. 어떤 연구결과들에서 CID 분석 중 코어 퓨코스는 가지로 전이되지 않았지만, 외측 아암 (가지) 퓨코스 간에 퓨코스 재배열이 일어나거나 어떤 질환에서 코어 퓨코실화가 일어나는 것이 보고되었기 때문에, 위암 환자 유래 햅토글로빈 당쇄 형태에서 퓨코스의 위치를 확인할 필요가 있었다. 외측 아암 퓨코스를 포함하여 단당류의 연결에 따라 세 가지 (tri-antennary) 및 네 가지 (tetra-antennary) 복합 N-당쇄를 갖는 퓨코실화 구조는 루이스 항체가 될 수 있다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 위암 환자 유래 햅토글로빈에서 외측 아암 퓨코스 (Hex1-HexNAc1-Fuc1 당쇄 단편 같은 것들, m/z 512.19)가 존재함을 발견하였지만, 코어 퓨코실화 (HexNAc-Fuc 또는 HexNAc2-Fuc 당쇄 단편 같은 것들)의 존재는 확인하지 못하였다 (도 3B).
본 발명자들은 세 가지 (tri-antennary) 및 네 가지 (tetra-antennary) 복합형 N-당쇄가 상대적으로 증가함을 탐지하였다. 햅토글로빈 당쇄 구조 프로파일링을 통해 정상인 대조군과 위암 환자군 간에 대부분의 당쇄구조를 비교할 수 있었고, 이 중 현저한 차이를 보이는 몇몇 N-당쇄 구조를 요약하고 p-value에 의해서 유의성을 확인하였다 (도 2, 표 2). 또한, 정상인 대조군과 위암 환자군 간의 고 만노스 구조의 차이도 발견되었다. 흥미롭게도, 이러한 고 만노스 구조의 차이는 렉틴 분석이 아니라 칩-기반 나노-LC/TOF-MS (Chip/TOF)에 의해 관찰되었는데, 이는 이 방법을 이용함으로서 높은 민감성가지고 당쇄 구조를 분류할 수 있기 때문이다. 이러한 사실은 고감도의 질량분석방법이 바이오마커를 이용한 암 진단에 유용하게 활용될 수 있음을 증명한다. 이러한 결과로 얻은 잘못된 당쇄구조들은 위암의 모든 단계뿐만 아니라 위암의 초기 진단마커로 잠재력을 가지고 있음을 말해주며, 현재 비특이적인 위암 마커들을 대체할 수 있는 유용한 당쇄 마커임을 말해준다. 뿐만 아니라, 햅토글로빈의 당쇄구조와 렉틴의 반응성은 위암에 대한 렉틴-기반 진단 기술에 용이하게 응용할 수 있다.
본 발명은
a) 피검체 유래 시료로부터 햅토글로빈 (haptoglobin)을 분리 및 정제하는 단계;
b) 정제된 햅토글로빈으로부터 N-당쇄를 분리하는 단계;
c) 분리된 N-당쇄의 당쇄구조를 질량분석하는 단계; 및
d) 질량분석한 결과에 대해 정량적 프로파일링을 수행하는 단계를 포함하는, 위암 바이오마커 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 c) 단계의 질량분석은 N-당쇄 구조가
Hex5-HexNAc2 당쇄 (1234.4 m/z),
Hex6-HexNAc2 당쇄 (1396.5 m/z),
Hex7-HexNAc2 당쇄 (1558.5 m/z),
Hex8-HexNAc2 당쇄 (1720.6 m/z),
Hex3-HexNAc3 당쇄 (1113.4 m/z),
Hex4-HexNAc3 당쇄 (1275.5 m/z),
Hex4-HexNAc4-Fuc1 당쇄 (1624.6 m/z),
Hex5-HexNAc4 당쇄 (1640.6 m/z),
Hex5-HexNAc4-Fuc1 당쇄 (1786.6 m/z),
Hex5-HexNAc4-NeuAc1 당쇄 (1931.7 m/z),
Hex5-HexNAc4-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (2077.7 m/z),
Hex4-HexNAc5-Fuc1 당쇄 (1827.6 m/z),
Hex5-HexNAc5-Fuc1 당쇄 (1989.7 m/z),
Hex5-HexNAc5-NeuAc1 당쇄 (2134.8 m/z),
Hex6-HexNAc5-Fuc1 당쇄 (2151.8 m/z),
Hex5-HexNAc5-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (2280.8 m/z),
Hex6-HexNAc5-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (2442.9 m/z),
Hex7-HexNAc6-Fuc1 당쇄 (2516.9 m/z),
Hex7-HexNAc6 당쇄 (2370.8 m/z) 및
Hex7-HexNAc6-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (2808.0 m/z) 중 하나 이상을 선택하여 수행함을 특징으로 하는 위암 바이오마커 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 c) 단계의 질량분석이 나노 LC 칩/Q-TOF 질량분석 방법임을 특징으로 하는 위암 바이오마커 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 d) 단계의 정량적 프로파일링이 T 검정 p-값 분석, ROC (Receiver-Operating curve) 및 AUC (Area under the ROC curve) 분석 중 한 가지 이상을 선택하여 수행함을 특징으로 하는 위암 바이오마커 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 d) 단계의 정량적 프로파일링 수행시 고만노즈 (high mannose) 구조 또는 N-당쇄화된 가지 (antennary) 변수를 부가함을 특징으로 하는 위암 바이오마커 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 a) 단계의 시료가 혈액, 혈청, 혈장, 세포 및 세포배양액으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 위암 바이오마커 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 d) 단계의 정량적 프로파일링이
Hex5-HexNAc2 당쇄 (1234.4 m/z),
Hex6-HexNAc2 당쇄 (1396.5 m/z),
Hex7-HexNAc2 당쇄 (1558.5 m/z) 또는
Hex8-HexNAc2 당쇄 (1720.6 m/z) 구조에서 고만노스 (high mannose) 구조의 상대량 (relative abundance) 평균값 또는 정량 합계에 대하여 T 검정 p-값 분석, ROC (Receiver-Operating curve) 및 AUC (Area under the ROC curve) 분석 중 한 가지 이상을 선택하여 수행함을 특징으로 하는 위암 바이오마커 분석방법에 관한 것이다. 햅토글로빈 전체 N-당쇄 구조의 평균값을 살펴본 결과 암 환자는 상기 네 개의 고만노스 구조 각각이 0.5% 이하인 경우가 90%였고, 정상인은 상기 네 개의 고만노스 구조 각각이 0.5% 이하인 경우가 16%였다 (데이타 나타내지 않음).
또한, 본 발명은 상기 d) 단계의 정량적 프로파일링이
Hex6-HexNAc5-Fuc1 당쇄 (2151.8 m/z) 및
Hex7-HexNAc6-Fuc1 당쇄 (2516.9 m/z) 중 하나 이상을 선택하거나, 두 당쇄구조의 평균값 또는 정량 합계의 T 검정 p-값 분석, ROC (Receiver-Operating curve) 및 AUC (Area under the ROC curve) 분석 중 한 가지 이상을 선택하여 수행함을 특징으로 하는 위암 바이오마커 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 c) 단계 이후
Hex4-HexNAc5-Fuc1 당쇄 (1827.6 m/z),
Hex5-HexNAc5-Fuc1 당쇄 (1989.7 m/z),
Hex6-HexNAc5-Fuc1 당쇄 (2151.8 m/z),
Hex5-HexNAc5-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (2280.8 m/z),
Hex6-HexNAc5-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (2442.9 m/z),
Hex7-HexNAc6-Fuc1 당쇄 (2516.9 m/z) 및
Hex7-HexNAc6-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (2808.0 m/z) 중 하나 이상을 선택하여 ECC (extracted compound chromatograms) 및 CID (collision induced dissociation) MS/MS를 추가로 수행하여, 가지 (antennae)에 위치한 퓨코스의 당쇄구조를 확인한 경우 피검체를 위암에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는, 위암 바이오마커 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 항 햅토글로빈 항체 및 AAL 렉틴 (Aleuria aurantia agglutinin lectin) 또는 PHA-L 렉틴 (Phaseolus vulgaris-L agglutinin lectin) 중 1종 이상의 렉틴을 함유하는 위암 진단용 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 AAL 렉틴 또는 PHA-L 렉틴이 리간드에 결합된 것임을 특징으로 하는 위암 진단용 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 리간드가 바이오틴, 아비딘 또는 스트렙트아비딘임을 특징으로 하는 위암 진단용 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 발색효소 또는 형광분자가 결합된 리간드 특이적 결합 분자를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 위암 진단용 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 발색효소는 HRP(horseradish peroxidase) 또는 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase)인 것을 특징으로 하는 위암 진단용 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 형광분자는 콜로이드 골드(colloid gold), 폴리-L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate; poly L-lysine-FITC) 및 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 위암 진단용 킷트에 관한 것이다.
본 발명의 위암 진단용 킷트에 있어서, 상기 AAL 렉틴 또는 PHA-L 렉틴은 바이오틴, 또는 아비딘 또는 스트렙트아비딘에 대해 바이오틴과 본질적으로 동일한 결합 작용을 갖는 바이오틴 유도체인 리간드에 결합된 것을 사용하는 것이 바람직하고, 상기 리간드 특이적 결합분자에 결합된 발색효소 또는 형광분자가 결합된 시각화 컨쥬게이트가 상기 리간드에 결합된 것을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 발색효소는 HRP(horseradish peroxidase) 또는 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase)인 것이 바람직하며, 상기 형광분자는 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate) 및 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 위암 진단용 킷트는 지지체로 나이트로셀룰로오즈 막, PVDF 막, 폴리비닐(polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(well plate), 유리로 된 슬라이드 글래스 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은
a) 접착성 지지체;
b) 상기 접착성 플라스틱 지지체의 상부 표면에 부착되어 있는, 분석하고자 하는 피검체 시료를 수용하는 검체 패드;
c) 상기 검체 패드와 연동되어 있고, 발색제-결합 AAL 렉틴을 함유하는 AAL 렉틴 컨쥬게이트 패드 또는 상기 검체 패드와 연동되어 있고, 발색제-결합 PHA-L 렉틴을 함유하는 PHA-L 렉틴 컨쥬게이트 패드;
d) 상기 검체 패드에 연결되어, 항 햅토글로빈 항체가 선형으로 고정된 검출라인(test line), 및
상기 검출라인의 다운스트림에 위치하고 항 AAL 렉틴 항체 또는 AAL 렉틴에 결합하는 당단백질이 선형으로 고정된 AAL 렉틴 대조라인(control line) 또는
항 PHA-L 렉틴 항체 또는 PHA-L 렉틴에 결합하는 당단백질이 선형으로 고정된 PHA-L 렉틴 대조라인(control line)을 포함하는,
상기 AAL 렉틴 컨쥬게이트 패드 또는 상기 PHA-L 렉틴 컨쥬게이트 패드와 연동된 신호검출 패드;
e) 신호검출반응이 종료된 피검 시료를 흡수하는, 상기 신호검출 패드의 다운스트림에 위치하는 흡수 패드로 구성된, 위암 진단용 면역크로마토그래피 스트립에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 c) 단계의 발색제가 콜로이드성 금 입자(gold particle)인 것을 특징으로 하는 위암 진단용 면역크로마토그래피 스트립에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 d) 단계의 신호검출 패드가 니트로셀룰로오스, 셀룰로오즈, 폴리에틸렌, 폴리에테르설폰 및 나일론으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 이루어진 것을 특징으로 하는 위암 진단용 면역크로마토그래피 스트립에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 e) 단계의 흡수 패드가 다공성 지지체, 및 상기 다공성 지지체의 공동(pore)에 분산되거나 다공성 지지체의 섬유사에 흡착 또는 코팅되어 있는 흡수제를 포함하는 것을 특징으로 하는 위암 진단용 면역크로마토그래피 스트립에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 면역크로마토그래피 스트립 상의 대조라인 및 검출라인에 착색선이 나타나면, 피검 시료를 위암 양성 시료로 판정하는 것을 특징으로 하는 위암 진단용 면역크로마토그래피 스트립에 관한 것이다.
본 발명에 따른 면역크로마토그래피 스트립은, 우선 피검 시료인 혈액 등을 상기 검체 패드를 통해 면역크로마토그래피 스트립으로 공급한다. 상기 검체 패드는, 분석물질에 대한 선택성을 좀 더 향상시키기 위해 또는 상기 피검 시료에 포함될 수 있는 간섭물질에 의한 영향을 최소화하기 위해, 필터링 기능을 추가로 가질 수 있다. 필요한 경우, 상기 검체 패드의 업스트림에 분석물질과 컨쥬게이트 사이의 반응을 증가시키거나 또는 간섭물질에 의해 영향을 배제할 수 있는 물질을 함유하는 보조 패드를 추가로 구비할 수 있다. 상기 검체 패드를 통해 도입된 혈액은 크로마토그래피적 이동을 통해 상기 검체 패드의 업스트림에 위치하는 컨쥬게이트 패드로 이동한다. 상기 컨쥬게이트 패드는 혈액에 함유되어 있는 베타-햅토글로빈 또는 햅토글로빈과 특이적으로 결합하는 항 베타-햅토글로빈 항체 컨쥬게이트 또는 항 햅토글로빈 항체 컨쥬게이트가 함유되어 있다. 상기 컨쥬게이트는 금입자, 라텍스 입자, 형광물질, 및 효소 등에 의해 레이블링된다. 상기 컨쥬게이트 패드를 통과한 피검 시료는 신호검출 패드로 이동한다. 상기 신호검출 패드는 상기 피검 시료에 분석물질이 존재하는 지의 여부를 검출하는 검출라인과, 분석물질의 존재 유무와 관계없이 분석키드가 정상적으로 작동하였는지 여부를 확인하는 대조라인을 포함한다. 이를 위해, 상기 검출라인에는 분석물질과 상기 컨쥬게이트 패드에 함유된 컨쥬게이트 사이의 결합산물에 선택적이고 특이적으로 결합하는 물질(또는 신호검출물질)이 코팅되고, 상기 대조라인에는 상기 컨쥬게이트 패드에 함유된 컨쥬게이트에 특이적으로 결합하는 물질이 코팅되는 것이 좋다. 상기 신호검출 패드는 다공성 멤브레인 패드로 구성되며, 니트로셀룰로오스, 셀룰로오즈, 폴리에틸렌, 폴리에테르설폰, 나일론 등으로 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 피검체 시료가 혈액, 혈청, 혈장, 세포 및 세포배양액으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 위암 진단용 면역크로마토그래피 스트립에 관한 것이다.
또한, 본 발명은
a) 피검체 유래 시료를 항 베타-햅토글로빈 항체 또는 항 햅토글로빈 항체가 부착된 고체기판에 처리한 후 세척하는 단계;
b) 상기 기판에 AAL 렉틴(Aleuria aurantia agglutinin lectin) 또는 PHA-L 렉틴 (Phaseolus vulgaris-L agglutinin lectin)을 처리한 후 세척하는 단계; 및
c) 상기 기판 위에 AAL 렉틴 또는 PHA-L 렉틴의 부착 정도가 정상인과 유의한 차이를 나타내는 피검체를 위암에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는, 위암 바이오마커 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 a) 단계의 고체 기판이 NC(nitrocellulose) 막, PVDF(polyvinylidene fluoride) 막, 마이크로플레이트, 유리기판, 폴리스티렌, 실리콘기판 및 금속판으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 위암 바이오마커 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 b) 단계의 AAL 렉틴 또는 PHA-L 렉틴이 리간드에 결합된 것을 특징으로 하는, 위암 바이오마커 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 리간드가 바이오틴, 아비딘 또는 스트렙트아비딘인 것을 특징으로 하는, 위암 바이오마커 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 b) 단계가 리간드가 결합된 AAL 렉틴 또는 PHA-L 렉틴을 부착시킨 후, 상기 리간드에 특이적으로 결합하는 결합분자가 부착된 발색효소 또는 형광분자를 결합시키는 것을 특징으로 하는, 위암 바이오마커 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 발색효소는 HRP(horseradish peroxidase) 또는 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase)인 것을 특징으로 하는, 위암 바이오마커 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 형광분자는 콜로이드 골드(colloid gold), 폴리-L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate; poly L-lysine-FITC) 및 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 위암 바이오마커 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 c) 단계의 결합 정도를 웨스턴블랏팅 (Western blotting)법, 효소-면역화학 검출법 (Enzymelinked immunosorbent assay, ELISA), 면역침강 (immunoprecipitation) 및 면역형광법 (immunofluorescence)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는, 위암 바이오마커 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명에서 상기 피검체 유래 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 세포 및 세포배양액으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 위암 바이오마커 분석방법에 관한 것이다.
본 발명은 렉틴들의 위암환자군의 혈청에서 유래한 햅토글로빈에서 퓨코실화 또는 1-6 GlcNAc 가지화가 위암 환자군에서 정상 대조군에 비해 확연히 증가함을 관찰하여 이 당쇄구조에 반응성을 지니는 AAL 또는 PHAL 렉틴을 기반한 위암 진단 방법을 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명의 당쇄의 질량분석을 통해 정상 대조군에 비해 위암 환자군 혈액 유래의 햅토글로빈에서 값이 확연히 차이나는 고감도, 고특이도를 가지는 수 가지 당쇄 구조를 한번에 확인할 수 있으며, 종래의 특정 단백질의 양만을 분석하는 것과는 달리 당쇄 구조들을 이용함으로서 위암을 진단할 수 있는 방법을 제공한다.
도 1은 정상인 및 위암환자의 혈청 내에 존재하는 당쇄 패턴을 여러 가지 렉틴을 사용하여 스크리닝한 결과이다. 레인 1-2: 정상 혈청, 레인 3-4: 위암 1기, 2기, 레인 5-6: 위암 3기, 4기. 블랏팅 지수 (blotting index)는 렉틴 블랏팅 띠 강도를 웨스턴 블랏팅 띠 강도로 나눈 값을 나타낸다.
도 2는 정상인 및 위암환자 혈청에서 정제한 햅토글로빈 N-당쇄 프로파일링 결과이다. 정제된 햅토글로빈에 PNGase F처리를 하여 N-당쇄만 분리한 후 칩-기반 나노-/TOF-MS(Chip/TOF)를 이용하여 정상인 대조군과 위암 환자군에서 유래한 햅토글로빈의 N-당쇄를 확인하였다. 녹색 원은 만노즈, 노란색 원은 갈락토즈, 청색 네모는 N-아세틸헥소사민, 적색 마름모는 시알산, 적색 세모는 퓨코즈를 나타낸다.
도 3은 정상인과 위암환자의 혈청에서 분리한 햅토글로빈에서 세 가지 (tri-antennary) 당쇄의 퓨코스 위치를 보여주는 결과이다. (A) 세 가지 (tri-antennary) 구조 Hex6-HexNAc5-Fuc1 (6510, m/z 2151.774)의 이성질체의 과부하 크로마토그램 (B) 위암환자 혈청 유래 외측 아암 퓨코스를 가진 세 가지 (tri-antennary) 당쇄구조의 아이소폼의 CID 스펙트럼.
도 4는 정상인 및 위암환자의 혈청에서 햅토글로빈을 정제한 결과 및 AAL 및 PHAL 렉틴과 햅토글로빈 항체를 이용한 블랏팅 결과이다. 레인 1: 분자량 마커, 레인 2: 1/100 희석한 혈청, 레인 3: 위암 환자 혈청으로부터 정제한 햅토글로빈.
아래에서는 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
재료 및 기타 시약
바이오틴 결합된 알레우리아 아우란티아 (Aleuria aurantia) 렉틴 (AAL: Fuca1-3/ 4/ 6GlcNAc에 결합), 바이오틴 결합된 파세올루스 불가리스-E (Phaseolus vulgaris-E) 렉틴 (PHA-E: bisected 복합형에 결합), 바이오틴 결합된 파세올루스 불가리스-L (Phaseolus vulgaris-L) 렉틴 (PHA-L: 세 가지 (tri-antennary) 및 네 가지 (tetra-antennary) 복합형에 결합), 바이오틴 결합된 WGA (wheat germ agglutinin: 말단 N-아세틸글루코사민, 시알산에 결합) 및 바이오틴 결합된 콘카나발린 A (Con A: 올리고만노스 타입에 결합)는 Vector Laboratories (Burlingame, CA)에서 입수하였다. 상업적으로 판매하는 인간 햅토글로빈과 ExtrAvidin Peroxidase는 Sigma (St. Louis, MO)에서 구입하였다. 토끼 항-인간 베타-햅토글로빈 항체는 Dako (Carpinteria, CA)에서 구입하였다. 염소 항-토끼 IgG 호스래디쉬 퍼옥시데이즈 (HRP)는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) 제품을 사용하였다. PNGase F (Peptide N-glycosidase F)는 New England Biolabs (MA, USA)에서 구입하였다. 흑연화 탄소 카트리지 (Graphitized carbon cartridges)는 Grace Davison Discovery Sciences (IL, USA) 제품을 사용하였다. 질량 분광학적 계산 솔루션 (ESI-TOF Calibrant calibrant Mix mix G1969-85000)은 Agilent Technologies (CA, USA) 제품을 사용하였다. 다른 모든 약품은 분석 등급 이상의 것을 사용하였다.
위암 환자 및 정상인의 혈청시료
혈청 시료는 힌국 인체자원은행 (National Biobank of Korea)의 일원인 충남대학교 병원에서 입수하였다. 10명의 위암환자 및 6명의 정상인의 임상정보는 표 1에 요약하였다. 환자들은 병리학자들에 의해 생검의 시험 및 진단을 받았다. 이 연구는 KAIST 윤리위원회의 허가를 받았고, 참여한 정상인과 위암환자들로부터 동의서를 받고 연구를 수행하였다.
인간 혈청으로부터 햅토글로빈 정제
항-햅토글로빈 항체를 이용하여 항-햅토글로빈 친화 컬럼을 제조하고 정제를 수행하였다. 10명의 위암환자 및 여섯 명의 정상인으로부터 각각 500 ㎕의 혈청을 얻어 4 ㎖의 PBS (phosphate-buffered saline, 10 mM 인산 완충액/2.7 mM KCl/ 137 mM NaCl, pH 7.4)에 희석하여 항-햅토글로빈 친화 컬럼에 적용하고 회전 교반기 상에서 상온으로 두 시간 동안 배양하였다. 결합되지 않은 물질들은 30 ㎖의 PBS로 컬럼을 세척하여 제거하였고, 햅토글로빈은 용출 완충액 (0.1 M 글라이신/ 0.5 M NaCl, pH 2.8)으로 용출한 후 중화 완충액 (1.0 M Tris-HCl, pH 9.0)을 함유한 튜브에 분획하였다. 용출액은 농축한 다음 원심분리 필터 (분자량 한계 10,000, Amicon Ultra, Millipore)로 계면활성제를 제거한 다음 Quant-iT Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA)로 햅토글로빈을 분석하였고, 12.5% SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색을 수행하였다 (도 2A). 시료는 동결건조하여 분석시까지 -80℃에 보관하였다.
β- 햅토글로빈 렉틴 블랏팅 및 웨스턴 블랏팅
렉틴 블랏팅은 종래 논문의 방법을 약간 변형하여 수행하였다. 즉, 0.5 ㎕의 혈청과 0.5 ㎎의 햅토글로빈을 10% 및 12.5% SDS-PAGE로 전기영동하고, PVDF 막 (Millipore, Billerica, MA)에 옮긴 후 바이오틴 결합된 렉틴들 (AAL, PHA-E, PHA-L, WGA, ConA) 각각을 이용하여 블랏팅하였다. PVDF 막은 5% 소 혈청 알부민을 포함하는 T-TBS [TBS (140 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0)/ 0.05% Tween 20]로 상온에서 한 시간 블로킹하였다. T-TBS로 5분간 세 번 헹군 후, 막은 1:1,000-5,000으로 희석한 바이오틴 결합된 렉틴을 함유한 T-TBS로 콜드룸에서 오버나잇 배양하였다. 그런 다음 막은 T-TBS로 세 번 헹구고 1:3,000 희석한 ExtrAvidin-Peroxidase로 상온에서 한 시간 동안 배양하였다. 그 후 막은 T-TBS로 세 번 헹구고, ECL Supersignal kit(Pierce ECL Western Blotting Substrate, Thermo Science, Rockford, IL)로 현상하였다. 햅토글로빈을 로딩할 만큼의 양을 제조하기 위해 렉틴 블랏팅 이후 동일한 블랏에 대해 항-햅토글로빈 항체로 다시 블랏팅하였다. 간단히 설명하면, 막은 스트리핑 완충액 (Candor Bioscience GmbH, Weissensberg, Germany)으로 상온에서 한 시간 배양한 후 T-TBS로 다섯 번 헹구고, 5% BSA로 한 시간 블로킹한 다음 1/50,000으로 희석된 토끼 항-햅토글로빈 항체로 콜드룸에서 오버나잇 배양하여 면역 블랏팅한 다음 T-TBS로 세 번 헹구고 1/5,000으로 희석된 염소 항-토끼 IgG-HRP로 한 시간 배양한 후 T-TBS로 세 번 헹구고 ECL 용액으로 현상하였다.
인-젤 단백질 절단
관심 대상 단백질 띠를 잘라내어 서열분석용 변형 트립신 (Promega, Madison, WI, USA)으로 인-젤 절단하였다. 간단히 설명하면, 목표 단백질 스팟을 젤에서 잘라내어 폴리프로필렌 (에펜도르프) 튜브에 넣고 150 ㎕의 1:1 아세토나이트릴/ 25 mM 중탄산 암모늄 (pH 7.8)으로 다섯 번 세척하였다. 젤 슬라이스는 Speedvac 농축기에서 건조시킨 후 30 ㎕의 20 ng의 트립신이 함유된 25 mM 중탄산 암모늄 (pH 7.8)으로 재수화하였다. 37 ℃에서 20시간 동안 배양한 후 액체는 새로운 폴리프로필렌 튜브로 옮겼다. 젤 매트릭스에 잔존하는 트립신 처리된 펩타이드들은 0.1% (v/v) 포름산을 함유한 50% (v/v) 수용성 아세토나이트릴 20 ㎕로 30 ℃에서 40분간 추출하였다. 조합된 상층액은 Speedvac에서 증발시키고, 0.1% (v/v) 포름산을 함유한 5% (v/v) 수용성 아세토나이트릴 8 ㎕에 용해시켜 질량분석용으로 사용하였다.
LC - MS / MS 에 의한 단백질 규명
준비한 트립신 처리된 펩타이드는 Finnigan LCQ 이온 트랩 질량분광계와 커플된 역상 모세관 HPLC를 이용하여 분석하였다. 0.1 X 20 ㎜ 트래핑 컬럼과 0.075 X 130 ㎜ 분해용 (resolving) 컬럼 모두 Vydac 218MS 저 트리플르오로아세트산 (low trifluoroacetic acid) C18 비드 (크기는 5 ㎛, 포어 크기는 300 Å; Vydac, Hesperia, CA, USA)로 패킹하였다. 트립신 처리한 펩타이드를 트래핑 컬럼에 0.1% (v/v) 포름산을 함유한 5% (v/v) 수용성 아세토나이트릴과 함께 10분간 포획한 후, 포획된 펩타이드는 0.1% (v/v) 포름산을 함유한 5~80% (v/v) 수용성 아세토나이트릴 농도구배로 50분간 0.2 ㎕/min 속도로 용출하였다. MS/MS에서는 전체 질량 스캔 레인지 모드는 m/z = 450 ~ 2,000 Da였다. 줌 스캔에서 하나의 이온에 대한 부하 상태를 결정한 후, 상대적 충돌 에너지 55%의 MS/MS 모드에서 프로덕트 이온 스펙트럼이 생성되었다. MS/MS 스펙트럼은 TurboSEQUEST 소프트웨어 (Thermo Quest, San Jose, CA)를 핸들링하여 진행하였다. 얻어진 피크 리스트 파일은 MASCOT 프로그램 (http://www.matrixscience.com)을 이용하여 NCBI 또는 MSDB 데이타베이스를 얻는데 이용하였다.
효소에 의한 N- 당쇄 방출
효소에 의한 N-당쇄 방출은 종래기술을 약간 변형하여 수행하였다. 간단히 설명하면, 정제한 혈청 햅토글로빈은 100 mM 중탄산 암모늄 및 5 mM 다이티오트레이톨 (dithiothreitol) 수용액 내에서 빠른 온열 사이클링 (25~100 ℃)으로 변성시켰다. 식힌 후 2.0 ㎕ (또는 1,000 U)의 PNGase F를 가하여 혼합물을 37 ℃ 수조에서 16시간 동안 배양하였다.
흑연화 카본 고상 추출에 의한 N- 당쇄 농축
N-당쇄의 고상 추출 (Solid-phase extraction)은 종래 최적화 방법을 약간 변형하여 수행하였다 (45). 간단히 설명하면, 흑연화 카본 카트리지 (150 ㎎, 4.0 ㎖, Grace Davison)를 80% 아세토나이트릴 / 0.1% 트리플루오로아세트산 (v/v) 함유 수용액으로 워싱한 후 초순수로 조건을 맞추었다. 햅토글로빈 절단물들을 카트리지에 로딩하고 초순수로 워싱하여 염과 완충액을 제거하였다. N-당쇄는 10% 및 20% 아세토나이트릴과 40% 아세토나이트릴/ 0.05% 트리플루오로아세트산 (v/v) 함유 수용액을 순서대로 가하여 용출하였다. 시료는 진공건조하였다.
칩-기반 나노- LC / MS 및 MS / MS
Nano-LC 분리는 종래기술에 따라 수행하였다. 각 시료의 N-당쇄 분획들을 함께 조합하여 2.0 ㎕ (800 ng 햅토글로빈에 해당함)를 칩이 올려진 나노-LC 컬럼 (Agilent Technologies) 상에 오토샘플러로 주입하였는데, 나노-LC 컬럼은 9 X 0.075 mm i.d. 농축용 컬럼 및 43 X 0.075 mm i.d. 분석용 컬럼으로 구성되어 있고, 양 컬럼은 모두 정지상으로 5 ㎛의 다공성 흑연화 카본으로 패킹되어 있다. 쾌속 당쇄 용출 농도구배는 (A) 3.0% 아세토나이트릴 및 0.1% 포름산 (v/v) 수용액, 그리고 (B) 90.0% 아세토나이트릴 및 0.1% 포름산 (v/v) 수용액을 이용하여 20분간 B 용액을 6%에서 100%까지 올리며 0.3 ㎕/min의 속도로 흘려주었다. 남아있는 비당쇄 화합물들은 재평형화 이전에 100% B 용액으로 흘려보냈다. 크로마토그래피를 이용한 분리 이후, 당쇄들은 칩-집적 나노-ESI 스프레이 팁으로 이온화하고 Q-TOF 질량분석기 (Model 6530, Agilent Technologies)로 종래기술에 따라 분석하였다. 캘리브란트 분자 (ESI-TOF Calibrant Mix G1969-85000, Agilent Technologies)들은 직접 전기스프레이 내로 주사하여 내부 질량 측정이 가능하도록 하였다. MS 스펙트럼은 스펙트럼당 1.5초의 획득시간으로 질량범위 m/z 500-2000을 넘어 양성 이온화 모드에서 얻어졌다. MS/MS 스펙트럼은 스펙트럼당 1.5초의 획득시간으로 질량범위 m/z 1000-3000을 넘어 양성 이온화 모드에서 얻어졌다. MS 스캔 이후 전구체 화합물들은 이온 양 및 전하 상태 (z = 2 또는 3)에 기초한 획득 소프트웨어에 의해 MS/MS 분석용으로 자동 선택되었고, 1.3 m/z의 질량 대역 (mass bandpass) FWHM (full width at half maximum)으로 사중극 (quadrupole)에서 분리되었고, 다음의 식에 따라 CID에 의해 단편화되었다.
Figure 112014016259574-pat00001
이 식에서, V collision은 전구체를 가속하고 조각내기 위해 충돌세포를 가로질러 적용한 전압을 말한다. 원 LC-MS 데이타는 MassHunter 질적 분석 소프트웨어 (version B.04.00 SP2, Agilent Technologies)에 포함된 Molecular Feature Extractor 알고리즘을 이용하여 수행하였다. MS 피크는 신호 대 노이즈 비율 5.0으로 여과되어 화합물 질량, 이온 양 및 체류시간 리스트를 얻기 위해 한 번에 하나씩 당을 제거하여 당쇄 서열을 결정하였다 (deconvolute).
정확한 질량에 의한 N- 당쇄 규명
MALDI-MS와 nano-LC/MS에 의해 탐지된 화합물들은 알려진 생물학적 합성경로와 당쇄화 패턴에 기초한 모든 가능한 복합, 하이브리드 및 고-만노스 당쇄 구조의 당쇄 데이타베이스에 정확한 질량을 비교하였다. 각 ECC 피크의 당쇄 서열 결정방법으로 결정된 질량은 20 ppm의 질량 오차 허용치를 이용하여 이론적 당쇄 질량과 비교하였다. 인간 혈청 유래 시료 셋트와 같이, 헥소스 (Hexose), HexNAc (N-acetylhexosamine), 퓨코스 (fucose) 및 NeuAc (N-acetylneuraminic acid)를 포함하는 당쇄 구성만 고려하였다. T 검정 p-값 분석, ROC 커브(Receiver-Operating Characteristic curve) 및 AUC (Area under the ROC curve) 등을 이용하여 각 시료에서 추출된 N-당쇄를 비교분석하였다.
결과 1: 정상인 혈청과 비교한 위암 환자 혈청의 잘못된 당쇄를 포함하는 렉틴-결합 당단백질 확인
정상과 비교하여 위암환자 혈청 단백질의 다른 당쇄화 패턴을 확인하기 위하여 렉틴 블랏팅 방법을 선택하였다. 많은 렉틴이 구입 가능할 뿐 아니라 혈청 내 당쇄 분석에 적용하기 용이하기 때문이다. 건강한 대조군 혈청, 그리고 1기 내지 4기의 위암환자군 총 6명으로부터 얻은 0.5 ㎕의 혈청을 10% 아크릴아마이드 젤에서 전기영동하고 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색 및 항-인간 햅토글로빈 항체와 다양한 렉틴을 이용하여 웨스턴 블랏팅을 수행하였다. 정상인 대조군은 레인 1, 2, 위암 1기 내지 4기는 각각 레인 3~6이다 (도 1A). 위암환자와 정상인의 조혈청에서 얻은 당단백질의 당쇄 패턴을 비교하기 위해 AAL, PHA-L, PHA-E, WGA 및 Con A의 다섯 가지 렉틴을 선택하였다. 렉틴에 결합한 모든 단백질을 탐지하였고 약 45 kDa에 위치한 하나의 스팟에 대한 렉틴들의 반응성은 위암 환자군과 정상 대조군 간에 확연히 달랐다. 본 발명자들은 위암환자군의 혈청에서 유래한 스팟에서 퓨코실화 및 β1-6 GlcNAc 가지화가 증가하였음을 관찰하였다. 위암환자에서 당쇄 패턴이 상승한 스팟을 확인하기 위해 레인 1과 레인 5의 밴드를 잘라내어 인-젤 절단하였다. 이와 같이 트립신 처리한 펩타이드는 LC-MS/MS 분석하였다. 데이타베이스 서치에서 이 펩타이드는 햅토글로빈 (Hp)으로 나타났다. 뿐만 아니라, 항-햅토글로빈 항체로 햅토글로빈 분자량의 위치 및 함량을 확인하기 위하여 햅토글로빈을 웨스턴 블랏팅을 수행하였다 (도 1A). 햅토글로빈 내 당쇄 에피토프의 블랏팅 지수 값을 시험한 결과는 다른 당쇄 구조와 비교하여 정상인, 위암 초기환자 및 위암 말기환자 간의 퓨코스와 가지가 많은 구조의 차이점을 분명히 보여주었다 (도 1B).
결과 2: 햅토글로빈의 위암 특이적 N-연결 당쇄 분석
햅토글로빈의 자세한 당쇄화 패턴은 칩-기반 나노-LC/TOF-MS (Chip/TOF) 시스템으로 분석하였는데, 이 시스템은 다른 연결 또는 다른 가지를 갖는 당쇄 이질성 (heterogeneity)을 식별할 수 있고 MALDI-MS 및 전통적인 LC/MS와 비교하여 더 높은 민감성을 제공할 수 있는데, 이는 낮은 에너지 이온, 넓은 다이나믹 레인지 및 매치되지 않는 체류시간 재생성 제공과 같은 부가적인 장점때문이다. 본 발명자들은 나노-LC/MS로 두 번씩 정상인과 환자 (n=16)의 혈청 시료 유래 햅토글로빈의 N-당쇄를 분석하였다 (도 2, 표 2). PNGase F 처리를 통하여 햅토글로빈의 N-당쇄만 분리한 후 칩-기반 나노-/TOF-MS(Chip/TOF)로 정상인 대조군과 위암 환자군에서 유래한 햅토글로빈의 N-당쇄를 비교하였다. 각 시료내 확인되는 전체 N-당쇄구조의 상위 95%비율 내의 모든 구조를 이용하였고 정량값을 비교하였다. 해당 N-당쇄구조들 중, 고만노즈 구조들과 세 가지 (tri-antennary)구조 중에 2151.774의 질량 값을 나타낸 Hex6-HexNAc5-Fuc1,6510 당쇄구조 그리고 네 가지 (tetra-antennary)구조 중에 2442.876의 질량 값을 나타낸 Hex7-HexNAc5-Fuc1,7610 당쇄구조 등이 0.90 이상의 높은 AUC값을 나타내었다. 고만노즈 구조들의 합의 경우, 0.8589 cutoff value에서 60% 민감도 (sensitivity) 그리고 100%의 특이도(specificity)를 보였다. 6510 그리고 7610 당쇄구조의 경우, 각 3.014 그리고 2.616 cutoff value에서 90% 민감도 (sensitivity) 그리고 100%의 특이도(specificity)를 보였다. 표 2는 정상인과 위암환자 혈청 간에 현저한 차이 (p <0.05)를 보이며, 0.8 이상의 높은 AUC값으로 고감도 고특이성를 가진 햅토글로빈의 N-당쇄구조들을 요약한 것이다.
결과 3: 나노 LC - MS / MS 에 의한 햅토글로빈 상이 퓨코스 위치 결정
위암 환자 혈청 유래 햅토글로빈의 세 가지 (tri-antennary) 이상의 당쇄 구조에서 퓨코스의 위치를 결정하기 위해 본 발명자들은 화합물 크로마토그램을 추출하고 특이한 당쇄 구조 (Hex6-HexNAc5-Fuc1, 2151.774 m/z)를 갖는 타겟화된 CID MS/MS를 수행하였다. 표 2와 같이, 세 가지 (tri-antennary) 및 네 가지 (tetra-antennary) 당쇄 타입에서 Hex6-HexNAc5-Fuc1 및 Hex7-HexNAc6-Fuc1은 각각 정상인과 위암 환자 간에 가장 현저한 차이를 나타내는 구조였다. 도 3A는 복합 퓨코실화된 세 가지 (tri-antennary) N-당쇄 구성 Hex6-HexNAc5-Fuc1에 대해 과적 미가공 ECC (extracted compound chromatograms)를 보여준다. 본 발명자들은 목표 구조의 당쇄 이성질체를 분리할 수 있었고, 정상인 대조군과 위암 환자군의 혈청에서 모두 네 개의 이성질체 (체류시간 8.03, 8.45, 8.83 및 9.26분)가 관찰되었다. 이성질체의 전체적인 강도는 정상인 군보다 위암환자군에서 더 높았다. 또한, 본 발명자들은 햅토글로빈 N-당쇄의 CID 단편화에서 외측 아암 (가지) 퓨코스를 관찰하였으나, 코어 퓨코실화와 관련된 단편 이온은 발견하지 못하였다 (도 3B). m/z 512.19 (Hex1-HexNAc1-Fuc1)의 단편 이온은 가지 퓨코실화에 해당하며, CID MS/MS 스펙트럼에서 퓨코실화된 세 가지 (tri-antennary) N-당쇄 구조 Hex6-HexNAc5-Fuc1 (삼중으로 양자화된 m/z 781.59)의 이성질체로 밝혀졌다. 본 발명자들은 ECCs와 타겟화된 CID MS/MS로 세 가지 (tri-antennary) 또는 네 가지 (tetra-antennary) N-당쇄 구조를 가진 햅토글로빈에서 퓨코실화 증가를 나타내는 데이타들을 확증하고 완성할 수 있었다.
결과 4: 정상인과 위암환자로부터 정제한 햅토글로빈에 대하여 렉틴 AAL 및 PHAL 을 이용한 렉틴 블랏팅
혼합시료와 비교하여 정제된 당단백질에서 당쇄의 보다 정확한 구조를 정할 수 있기 때문에, 본 발명자들은 500 ㎕의 혈청을 이용하여 항-햅토글로빈 친화 크로마토그래피를 수행하여 풍부한 혈청 당단백질인 햅토글로빈을 정제하였다 (도 4A). 햅토글로빈은 두 가지의 알파체인과 베타체인으로 이루어져 있으며 베타체인에만 N-당쇄가 결합할 수 있는 네 가지 (tetra-antennary) 부위(184, 207, 211, 241번)가 존재한다. B에서는 정제한 햅토글로빈의 베타체인에 존재하는 비정상적인 당쇄를 렉틴 AAL 및 PHAL을 이용하여 확인하였고, 햅토글로빈 항체를 이용하여 햅토글로빈 존재여부도 확인하였다. 그 결과, 표 3에서 보는 바와 같이, AAL렉틴의 경우, 위암환자의 50%(5/10)가 블랏팅 지표(Blotting index)에서 0.6 이상을 보였고, 60%(6/10)가 0.4 이상을, 그리고 90%(9/10)가 0.2이상을 보인 반면에, 정상인의 17%(1/6)가 0.6 이상을, 33%(2/6)가 0.4이상을, 그리고 67%(4/6)가 0.2이상의 값을 보이는 것을 알 수 있었다. PHAL렉틴의 경우, 위암환자의 80%(8/10)가 블랏팅 지표에서 0.6 이상을 보였고, 100%(10/10)가 0.4 이상을, 그리고 1000%(10/10)가 0.2이상을 보인 반면에, 정상인의 17%(1/6)가 0.6 이상을, 33%(2/6)가 0.4이상을, 그리고 67%(4/6)가 0.2이상의 값을 보이는 것을 알 수 있었다. 베타-햅토글로빈에서 AAL의 강도는 정상 대조군과 비교하여 위암 환자에서 더 높았고, 이 결과는 정상인보다 위암 환자의 햅토글로빈에서 퓨코실화된 당쇄가 증가하였음을 나타낸다. PHAL 강도도 정상인에 비해 위암 환자의 베타-햅토글로빈에서 더 증가하는 것으로 탐지되었다. PHAL 렉틴은 β1-6 GlcNAc 가지가 많기 때문에 세 가지 (tri-antennary) 또는 네 가지 (tetra-antennary) 복합형 N-당쇄 구조를 인식할 수 있다. 다른 렉틴을 이용한 블랏팅도 수행하였지만, 연관도는 AAL 및 PHAL의 연관도보다 낮았다 (데이타 나타내지 않음). 이 결과는 AAL 또는 PHAL 렉틴과 햅토글로빈을 이용한 렉틴 기반의 위암 진단 가능성을 제시한다.
Figure 112014016259574-pat00002
Figure 112014016259574-pat00003
Figure 112014016259574-pat00004

Claims (30)

  1. a) 피검체 유래 시료로부터 햅토글로빈 (haptoglobin)을 분리 및 정제하는 단계;
    b) 정제된 햅토글로빈으로부터 N-당쇄를 분리하는 단계;
    c) 분리된 N-당쇄의 당쇄구조를 질량분석하는 단계; 및
    d) 질량분석한 결과에 대해 정량적 프로파일링을 수행하는 단계를 포함하는, 위암 바이오마커 분석방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 c) 단계의 질량분석은 N-당쇄 구조가
    Hex5-HexNAc2 당쇄 (1234.4 m/z),
    Hex6-HexNAc2 당쇄 (1396.5 m/z),
    Hex7-HexNAc2 당쇄 (1558.5 m/z),
    Hex8-HexNAc2 당쇄 (1720.6 m/z),
    Hex3-HexNAc3 당쇄 (1113.4 m/z),
    Hex4-HexNAc3 당쇄 (1275.5 m/z),
    Hex4-HexNAc4-Fuc1 당쇄 (1624.6 m/z),
    Hex5-HexNAc4 당쇄 (1640.6 m/z),
    Hex5-HexNAc4-Fuc1 당쇄 (1786.6 m/z),
    Hex5-HexNAc4-NeuAc1 당쇄 (1931.7 m/z),
    Hex5-HexNAc4-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (2077.7 m/z),
    Hex4-HexNAc5-Fuc1 당쇄 (1827.6 m/z),
    Hex5-HexNAc5-Fuc1 당쇄 (1989.7 m/z),
    Hex5-HexNAc5-NeuAc1 당쇄 (2134.8 m/z),
    Hex6-HexNAc5-Fuc1 당쇄 (2151.8 m/z),
    Hex5-HexNAc5-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (2280.8 m/z),
    Hex6-HexNAc5-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (2442.9 m/z),
    Hex7-HexNAc6-Fuc1 당쇄 (2516.9 m/z),
    Hex7-HexNAc6 당쇄 (2370.8 m/z) 및
    Hex7-HexNAc6-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (2808.0 m/z) 중 하나 이상을 선택하여 수행함을 특징으로 하는 위암 바이오마커 분석방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 c) 단계의 질량분석은 나노 LC 칩/Q-TOF 질량분석 방법임을 특징으로 하는 위암 바이오마커 분석방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 d) 단계의 정량적 프로파일링은 T 검정 p-값 분석, ROC (Receiver-Operating curve) 및 AUC (Area under the ROC curve) 분석 중 한 가지 이상을 선택하여 수행함을 특징으로 하는 위암 바이오마커 분석방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 d) 단계의 정량적 프로파일링 수행시 고만노즈 (high mannose) 구조 또는 N-당쇄화된 가지 (antennary) 변수를 부가함을 특징으로 하는 위암 바이오마커 분석방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 a) 단계의 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 세포 및 세포배양액으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 위암 바이오마커 분석방법.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 d) 단계의 정량적 프로파일링은
    Hex5-HexNAc2 당쇄 (1234.4 m/z),
    Hex6-HexNAc2 당쇄 (1396.5 m/z),
    Hex7-HexNAc2 당쇄 (1558.5 m/z) 또는
    Hex8-HexNAc2 당쇄 (1720.6 m/z) 구조에서 고만노스 (high mannose) 구조의 상대량 (relative abundance) 평균값 또는 정량 합계에 대하여 T 검정 p-값 분석, ROC (Receiver-Operating curve) 및 AUC (Area under the ROC curve) 분석 중 한 가지 이상을 선택하여 수행함을 특징으로 하는 위암 바이오마커 분석방법.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 d) 단계의 정량적 프로파일링은
    Hex6-HexNAc5-Fuc1 당쇄 (2151.8 m/z) 및
    Hex7-HexNAc6-Fuc1 당쇄 (2516.9 m/z) 중 하나 이상을 선택하거나, 두 당쇄구조의 평균값 또는 정량 합계의 T 검정 p-값 분석, ROC (Receiver-Operating curve) 및 AUC (Area under the ROC curve) 분석 중 한 가지 이상을 선택하여 수행함을 특징으로 하는 위암 바이오마커 분석방법.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 c) 단계 이후
    Hex4-HexNAc5-Fuc1 당쇄 (1827.6 m/z),
    Hex5-HexNAc5-Fuc1 당쇄 (1989.7 m/z),
    Hex6-HexNAc5-Fuc1 당쇄 (2151.8 m/z),
    Hex5-HexNAc5-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (2280.8 m/z),
    Hex6-HexNAc5-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (2442.9 m/z),
    Hex7-HexNAc6-Fuc1 당쇄 (2516.9 m/z) 및
    Hex7-HexNAc6-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (2808.0 m/z) 중 하나 이상을 선택하여 ECC (extracted compound chromatograms) 및 CID (collision induced dissociation) MS/MS를 추가로 수행하여, 가지 (antennae)에 위치한 퓨코스의 당쇄구조를 확인한 경우 피검체를 위암에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는, 위암 바이오마커 분석방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
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  16. a) 접착성 지지체;
    b) 상기 접착성 플라스틱 지지체의 상부 표면에 부착되어 있는, 분석하고자 하는 피검체 시료를 수용하는 검체 패드;
    c) 상기 검체 패드와 연동되어 있고, 발색제-결합 AAL 렉틴을 함유하는 AAL 렉틴 컨쥬게이트 패드 또는 상기 검체 패드와 연동되어 있고, 발색제-결합 PHA-L 렉틴을 함유하는 PHA-L 렉틴 컨쥬게이트 패드;
    d) 상기 검체 패드에 연결되어, 항 햅토글로빈 항체가 선형으로 고정된 검출라인(test line), 및
    상기 검출라인의 다운스트림에 위치하고 항 AAL 렉틴 항체 또는 AAL 렉틴에 결합하는 당단백질이 선형으로 고정된 AAL 렉틴 대조라인(control line) 또는
    항 PHA-L 렉틴 항체 또는 PHA-L 렉틴에 결합하는 당단백질이 선형으로 고정된 PHA-L 렉틴 대조라인(control line)을 포함하는,
    상기 AAL 렉틴 컨쥬게이트 패드 또는 상기 PHA-L 렉틴 컨쥬게이트 패드와 연동된 신호검출 패드;
    e) 신호검출반응이 종료된 피검 시료를 흡수하는, 상기 신호검출 패드의 다운스트림에 위치하는 흡수 패드로 구성된, 위암 진단용 면역크로마토그래피 스트립.
  17. 청구항 16에 있어서,
    상기 c) 단계의 발색제는 콜로이드성 금 입자(gold particle)인 것을 특징으로 하는 위암 진단용 면역크로마토그래피 스트립.
  18. 청구항 16에 있어서,
    상기 d) 단계의 신호검출 패드는 니트로셀룰로오스, 셀룰로오즈, 폴리에틸렌, 폴리에테르설폰 및 나일론으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 이루어진 것을 특징으로 하는 위암 진단용 면역크로마토그래피 스트립.
  19. 청구항 16에 있어서,
    상기 e) 단계의 흡수 패드는 다공성 지지체, 및 상기 다공성 지지체의 공동(pore)에 분산되거나 다공성 지지체의 섬유사에 흡착 또는 코팅되어 있는 흡수제를 포함하는 것을 특징으로 하는 위암 진단용 면역크로마토그래피 스트립.
  20. 청구항 16에 있어서,
    면역크로마토그래피 스트립 상의 대조라인 및 검출라인에 착색선이 나타나면, 피검 시료를 위암 양성 시료로 판정하는 것을 특징으로 하는 위암 진단용 면역크로마토그래피 스트립.
  21. 청구항 16에 있어서,
    상기 피검체 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 세포 및 세포배양액으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 위암 진단용 면역크로마토그래피 스트립.
  22. a) 피검체 유래 시료를 항 베타-햅토글로빈 항체 또는 항 햅토글로빈 항체가 부착된 고체기판에 처리한 후 세척하는 단계;
    b) 상기 기판에 AAL 렉틴(Aleuria aurantia agglutinin lectin) 또는 PHA-L 렉틴 (Phaseolus vulgaris-L agglutinin lectin)을 처리한 후 세척하는 단계; 및
    c) 상기 기판 위에 AAL 렉틴 또는 PHA-L 렉틴의 부착 정도가 정상인과 유의한 차이를 나타내는 피검체를 위암에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는, 위암 바이오마커 분석방법.
  23. 청구항 22에 있어서,
    상기 a) 단계의 고체기판은 NC(nitrocellulose) 막, PVDF(polyvinylidene fluoride) 막, 마이크로플레이트, 유리기판, 폴리스티렌, 실리콘기판 및 금속판으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 위암 바이오마커 분석방법.
  24. 청구항 22에 있어서,
    상기 b) 단계의 AAL 렉틴 또는 PHA-L 렉틴은 리간드에 결합된 것을 특징으로 하는, 위암 바이오마커 분석방법.
  25. 청구항 24에 있어서,
    상기 리간드는 바이오틴, 아비딘 또는 스트렙트아비딘인 것을 특징으로 하는, 위암 바이오마커 분석방법.
  26. 청구항 22에 있어서,
    상기 b) 단계는 리간드가 결합된 AAL 렉틴 또는 PHA-L 렉틴을 부착시킨 후, 상기 리간드에 특이적으로 결합하는 결합분자가 부착된 발색효소 또는 형광분자를 결합시키는 것을 특징으로 하는, 위암 바이오마커 분석방법.
  27. 청구항 26에 있어서,
    발색효소는 HRP(horseradish peroxidase) 또는 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase)인 것을 특징으로 하는, 위암 바이오마커 분석방법.
  28. 청구항 27에 있어서,
    형광분자는 콜로이드 골드(colloid gold), 폴리-L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate; poly L-lysine-FITC) 및 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 위암 바이오마커 분석방법.
  29. 청구항 22에 있어서,
    상기 c) 단계의 결합 정도는 웨스턴블랏팅 (Western blotting)법, 효소-면역화학 검출법 (Enzymelinked immunosorbent assay, ELISA), 면역침강 (immunoprecipitation) 및 면역형광법 (immunofluorescence)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는, 위암 바이오마커 분석방법.
  30. 청구항 22에 있어서,
    상기 피검체 유래 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 세포 및 세포배양액으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 위암 바이오마커 분석방법.
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