WO2016199998A1 - N-당쇄 질량분석을 이용한 대장암 진단방법 - Google Patents

N-당쇄 질량분석을 이용한 대장암 진단방법 Download PDF

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김정회
이성현
박승열
안현주
김재한
오명진
김진만
이주아
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한국과학기술원
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Definitions

  • the present invention relates to a novel method for detecting colorectal cancer through sugar chain change detection and a method for detecting sugar chain change for providing colorectal cancer diagnostic information, and more specifically, N-sugar chain of haptoglobin detected through mass spectrometry.
  • the present invention relates to a method for diagnosing colorectal cancer and a method for detecting sugar chain change using mass spectrometry.
  • Cancer is the number one cause of death worldwide, and the situation is the same in Korea. Cancer is formed and developed by genetic and environmental factors, and the occurrence of cancer and deaths from cancer increase every year due to changes in diet, increased environmental pollution, and increased exposure to environmental and mental stress. Compared with other diseases, the characteristics of cancer are relatively difficult to cure and the average survival rate after treatment is low. The characteristics of cancer in relation to the survival rate is that the prognosis and survival rate of patients vary greatly depending on the progression of the cancer. The cure rate is very low in cancers or cancers with metastases (Etzioni R. et al., Nature Reviews Cancer 3, 243-252, 2003).
  • cancers generally have few subjective symptoms in the early stages, and the diagnosis of subjective symptoms often develops into a terminal state that is already incurable.
  • the necessity of developing a treatment method for cancer and the method of diagnosing cancer at the early stage of treatment can be said to be the strategy that best meets the goal of effectively treating cancer and improving survival rate.
  • biofactors that can help early diagnosis of cancer, that is, biomarkers, is currently being actively conducted around the world based on proteomic techniques.
  • Tumor biomarkers have a variety of uses, which can help with early diagnosis of cancer, measure the progress of cancer, monitor the progress of cancer following treatment, and determine the prognosis after surgery. (Rifai N. et al., Nature Biotech. 24, 971-983, 2006). Non-destructive methods are required to track cancer detection and progression through biomarkers with this purpose and function. Thus, fluids such as blood with less risk during testing are the optimal biological samples for biomarker development research. It is recognized. In other words, the development of biomarkers that can be detected through urine, saliva, and blood is the most standardized approach. Among them, blood is the most comprehensive biological sample in which proteins from all tissues are collected. In addition, the most preferred form of tumor biomarkers in the form of biomaterials can be said to be a protein.
  • Colorectal cancer is a malignant tumor of the colon and rectum, with the world's 2000 incidence (945,000 new cases, 9.4% of cancers worldwide) and mortality (492,000 deaths, 7.9% of all cancers) being the third of all cancers. Higher, gender-specific proportions occur in males and females (male: female 1.1: 1). The prevalence rate is the second highest in the world after breast cancer because it has a better prognosis than other cancers. An estimated 2.4 million people have been diagnosed and survived colon cancer within the past five years (Parkin DM, Global cancer statistics). in the year 2000, Lancet Oncol 2: 533-543, 2001). Colorectal cancer prognosis is more than 90% of 5 year survival in early stage 1 patients, whereas only 5% of 5 years in metastasized stage 4 patients (Cancer Facts and Figures 2004. American Cancer Society, 2004 ).
  • Colorectal cancer screening has the potential to reduce the incidence and mortality of colorectal cancer because of its slow development from precancerous lesions that can be removed or early stage cancers that can be treated. It is believed that colorectal cancer screening can reduce mortality from colorectal cancer in both men and women of age 50 and older (Walsh JM & Terdiman JP, JAMA 289: 1288-96, 2003). However, compliance and dissemination rate for colonoscopy, the most reliable screening method at present, is low. Conversely, the fecal occult blood test (FOBT), the most widely used noninvasive screening option, has a number of important limitations, including low sensitivity.
  • FOBT fecal occult blood test
  • colorectal cancer can be diagnosed efficiently because there are no microorganisms that can obtain samples and patients can participate more easily than fecal markers, sample processing is easy, and there are no microorganisms that can degrade biomarkers or interfere with analysis. There is a lack of research on biomarkers for the development of biomarkers for colon cancer diagnosis.
  • Glycosylation is one of the well-known post-translational modification processes. Cancers that occur in certain organs have their own sugar chains, so sphingoglycolipids and glycoproteins expressed in glycoproteins are thought to be useful for labeling or inhibiting tumor development. These sugar chains can be used for diagnostic purposes using a variety of antibodies, and these sugar chain antigens are considered to be excellent targets of immunotherapy in various preclinical studies.
  • Colorectal cancer has recently been increasing rapidly in Korea, with changes in environmental factors such as westernization of eating habits, and the age at which it is found is gradually decreasing. Therefore, the need for screening for early diagnosis such as colonoscopy is increasing. Colorectal cancer, unlike the upper digestive system appears late, even if the symptoms are often mistaken for simple constipation or hemorrhoids often miss the appropriate treatment time. Colorectal cancer in Korea is ranked fourth after stomach cancer, liver cancer, and lung cancer, and has been continuously increasing.
  • colorectal cancer In general, patients with colorectal cancer have a change in bowel habits, bloody or mucous stools (mucus mixed with mucus), thin stools, weight loss, abdominal discomfort (abdominal pain, bloating), fatigue, anorexia, vomiting, nausea, Symptoms such as anemia.
  • most colon cancers do not have any symptoms in the early stages, and if there are any symptoms due to colorectal cancer, the colon cancer has already advanced considerably.
  • the screening tests currently used for colorectal cancer include fecal occult blood test, tumor marker test, colon angiography, colonoscopy, computed tomography, abdominal ultrasonography, transrectal ultrasound, and S colonoscopy. There is. In order to improve the survival rate of colorectal cancer patients, a more accurate early diagnosis method should be developed.
  • glycoproteins Since more than 50% of the protein in the body is a glycoprotein, many human diseases are likely related to glycoproteins. Therefore, it is possible to develop diagnostic markers by searching for glycoproteins associated with disease and studying disease-specific sugar chain structure analysis.
  • the present invention aims to provide an excellent biomarker for diagnosing colorectal cancer.
  • the present invention aims to provide a method for analyzing colorectal cancer biomarkers for rapid and sensitive diagnosis of colorectal cancer.
  • the present inventors isolated blood glycoproteins known to change sugar chains in various carcinomas, and confirmed mass-specific colorectal cancer-specific sugar chains by mass spectrometry, and obtained by treating PNGase F with purified glycoproteins. Qualitative and quantitative information of the N-sugar chain was confirmed by mass spectrometry.
  • a mass sensitivity of N-glycoprotein in the glycoprotein of the colorectal cancer patient group is used to identify several N-glycosyl structures having high sensitivity and high specificity at a time, which are significantly different in the glycoprotein of the colorectal cancer patient group compared to the normal control group.
  • the present invention provides a method for diagnosing colorectal cancer by using sugar chain structures as opposed to analyzing only the amount of a specific protein in the related art.
  • Figure 1 (a) is a graph of identifying the sugar chain marker candidates showing a significant difference and the profile of the total sugar chain mass spectrometrically purified haptoglobin in the serum of normal and colon cancer patients. After treating the purified haptoglobin by PNGase F, only N-sugar chain was isolated, and then LC-MS was used to profile the N-sugar chain of haptoglobin derived from a normal control group and colon cancer patient group. Each sugar chain structure was represented by relative abundance and represented all structures within the ratio of 95% or more in total.
  • Figure 1 (b) shows three sugar structures showing the largest significant difference among the total sugar chains. Gomannose structures (5200, 6200, and 7200) were all identified as potential colon cancer biomarker candidates with AUC 0.9 or higher, with sensitivity and specificity of 80% or higher.
  • Anti-human beta-haptoglobin antibodies were purchased from Dako (Carpinteria, Calif.).
  • PNGase F Peptide N-glycosidase F
  • MA New England Biolabs
  • MA New England Biolabs
  • Graphitized carbon cartridges were manufactured by Grace Davison Discovery Sciences (IL, USA).
  • Mass spectroscopic calculation solution ESI-TOF Calibrant calibrant Mix mix G1969-85000 was used by Agilent Technologies (CA, USA). All other drugs used more than analytical grade.
  • Serum samples were obtained from Chungnam National University Hospital, a member of the National Biobank of Korea. Clinical information of 20 colorectal cancer patients and 20 normal subjects is summarized in Table 1 and Table 2. Patients were tested and diagnosed with biopsy by pathologists. The study was approved by the KAIST Ethics Committee and conducted with the consent of the normal and colon cancer patients.
  • Anti-haptoglobin affinity columns were prepared using anti-haptoglobin antibodies and purification was performed. 500 ⁇ l of serum was obtained from 20 colorectal cancer patients and 20 normal individuals, respectively, and diluted in 4 ml of PBS (phosphate-buffered saline, 10 mM phosphate buffer / 2.7 mM KCl / 137 mM NaCl, pH 7.4) to anti-haptoggle. It was applied to a robin affinity column and incubated for 2 hours at room temperature on a rotary stirrer.
  • PBS phosphate-buffered saline, 10 mM phosphate buffer / 2.7 mM KCl / 137 mM NaCl, pH 7.4
  • haptoglobin was eluted with elution buffer (0.1 M glycine / 0.5 M NaCl, pH 2.8) followed by neutralization buffer (1.0 M Tris-HCl, pH 9.0). Fractions into tubes containing). The eluate was concentrated, followed by removal of the surfactant with a centrifugal filter (molecular weight limit 10,000, Amicon Ultra, Millipore) followed by analysis of haptoglobin with Quant-iT Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, Calif.), And 12.5% SDS-PAGE and Coomassie blue staining was performed. Samples were lyophilized and stored at -80 ° C until analysis.
  • elution buffer 0.1 M glycine / 0.5 M NaCl, pH 2.8
  • neutralization buffer 1.0 M Tris-HCl, pH 9.0
  • PNGase F peptide N-glycosidase F; 500,000 units / ml
  • Flavobacterium meningosepticum was purchased from New England BioLabs (Ipswich, Mass.).
  • 50 ⁇ l of heptoglobin obtained through the above example was dissolved in digestion buffer (pH 7.5, 100 mM ammonium bicarbonate, 5 mM DTT) and heated in boiling water for 2 minutes. Protein was denatured. After cooling to room temperature, 2 ⁇ l of PNGase F (1,000 units) was added and the mixture was incubated in a 37 ° C. water bath for 16 hours.
  • the obtained solution was frozen at -40 ° C. for 60 minutes, centrifuged at 4 ° C. at 14,000 rpm for 20 minutes, and 400 ⁇ l of supernatant was taken for each sample, and ethanol contained in the supernatant was completely dried.
  • the sugar chain-containing sample separated with PNGase F was purified by graphite treated carbon cartridge SPE (PGC-SPE; filling amount 150 mg, cartridge volume 3 ml).
  • PGC SPE cartridges were obtained from Alltech (Deerfield, IL). The cartridge was washed with 6 ml of ultrapure water, 6 ml of 80% (v / v) acetonitrile (ACN) containing 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) prior to use and then again with 6 ml of ultrapure water.
  • the sugar chain-containing sample was placed in a PGC cartridge to remove salt by flowing ultrapure water several times the volume of the cartridge at a rate of 1 ml / min.
  • N-sugar chains were eluted sequentially with 10% (v / v) acetonitrile, 20% (v / v) acetonitrile and 40% (v / v) acetonitrile and 0.05% (v / v) TFA. . Each fraction was collected and dried on a centrifugal evaporator. Fractions were dissolved in ultrapure water prior to mass spectrometry.
  • Nano-LC separation was performed according to the prior art. N-sugar chain fractions of each sample were combined together and 2.0 ⁇ l (corresponding to 800 ng heptoglobin) were injected into the autosampler on a loaded nano-LC column (Agilent Technologies), where the nano-LC column was 9 ⁇ . It consists of a 0.075 mm id enrichment column and a 43 x 0.075 mm id analytical column, both columns packed with 5 ⁇ m porous graphitized carbon in the stationary phase.
  • the rapid sugar chain elution concentration gradient is 20 minutes B using (A) 3.0% acetonitrile and 0.1% formic acid (v / v) aqueous solution, and (B) 90.0% acetonitrile and 0.1% formic acid (v / v) aqueous solution.
  • the solution was raised from 6% to 100% at a rate of 0.3 ⁇ l / min.
  • the remaining non-sugar chain compounds were flowed into 100% B solution before re-equilibration.
  • sugar chains were ionized with chip-integrated nano-ESI spray tips and analyzed according to the prior art with a Q-TOF mass spectrometer (Model 6540, Agilent Technologies).
  • V collision 1.8V ⁇ (m / z) / 100Da ⁇ -4.8V
  • V collision refers to the voltage applied across the collision cell to accelerate and fragment the precursor.
  • Raw LC-MS data was performed using the Molecular Feature Extractor algorithm included in MassHunter Qualitative Analysis Software (version B.04.00 SP2, Agilent Technologies). The MS peaks were filtered with a signal-to-noise ratio of 5.0 to remove sugars one at a time to obtain a list of compound masses, ions, and retention times to determine sugar chain sequences (deconvolute).
  • a chip-based Nano-LC / TOF-MS Chip / TOF
  • the N-sugar chain of haptoglobin was separated by PNGase F treatment, and then the chip-based nano- / TOF-MS (Chip / TOF) was used to compare the N-sugar chain of haptoglobin derived from the normal control group and the colon cancer patient group. . All structures within the top 95% of the total N-sugar chain structures found in each sample were used and quantitative values were compared.
  • Hex5-HexNAc2 (5200 sugar chain structure) showing a mass value of 1234.43 in high mannose structures among the N-sugar chain structures
  • Hex6-HexNAc2 (6200 sugar chain structure) showing a mass value of 1396.48 and a mass value of 1558.54.
  • Hex7-HexNAc2 (7200 sugar chain structure) and the like showed a high AUC value of 0.90 or more.
  • Hex4-HexNAc3-NeuAc1 sugar chain (1566.6 m / z)
  • Hex5-HexNAc5-Fuc1-NeuAc2 sugar chain (2571.9 m / z)
  • Hex6- in addition to the high mannose structure, among several sugar chain structures showing significant differences between the normal control group and the colon cancer patient group.
  • HexNAc5 sugar chain (2005.7 m / z) and Hex6-HexNAc5-NeuAc2 sugar chain (2587.9 m / z) structures differed from normal controls with P ⁇ 0.01 in colorectal cancer samples, but not in normal cancer controls. Failed sugar chain structures.
  • FIG. 1 is a profile of total sugar chains analyzed by mass spectrometry of haptoglobin purified from serum of normal and colorectal cancer patients, and a sugar chain marker candidate having a significant difference was identified from this data.
  • A is a result of N-sugar chain profiling of haptoglobin derived from normal control group and colon cancer patient group using LC-MS after separation of N-sugar chain by PNgaseF treatment to purified heptoglobin. Each N-sugar chain structure was represented by relative abundance and represented all structures within a ratio of 95% or more in total.
  • B is three N-sugar chain structures showing the largest significant difference among the total N-sugar chains.
  • the high mannose structures (5200, 6200, 7200) were all identified as colon cancer-specific glycomarker candidates with AUC 0.9 or more, showing sensitivity and specificity of 80% or more.
  • Table 1 and Table 2 summarize the total of 40 normal and colorectal cancer patient groups (normal 20 and colorectal cancer patients). Each serum sample was obtained from Chungnam National University Hospital, a member of the National Biobank of Korea, and patients were tested and diagnosed by biopsy by pathologists.
  • Table 3 and Table 4 are N-sugar chain structures showing sensitivity of relative p-values of 0.05 or less in normal and colorectal cancer patients among the N-sugar chains isolated from haptoglobin identified by the nano LC chip / Q-TOF MS method.
  • the N-sugar chain structure can be identified by a retention time library, and the amount of all the haptoglobin-derived N-sugar chain structures can be determined for each sugar chain structure.
  • the sugar chain structure was classified according to the gomannose structure and each branch based on MS mass spectrometry.
  • Hex4-HexNAc3-NeuAc1 sugar chain (1566.6 m / z), Hex5-HexNAc5-Fuc1-NeuAc2 sugar chain (2571.9 m / z), Hex6-HexNAc5 sugar chain (2005.7 m / z) and Hex6-HexNAc5-NeuAc2 sugar chain (2587.9 m / z) z)
  • the structures showed a difference from normal in P ⁇ 0.01 in colorectal cancer samples, but it was confirmed that it was a colorectal cancer-specific sugar marker candidate that can be distinguished from gastric cancer with sugar chain structures indistinguishable from normal in gastric cancer patient samples. .
  • the present invention facilitates the application of in vitro diagnostic technology by using bodily fluids such as serum as a sample and haptoglobin, a glycoprotein present in a large amount in bodily fluids, especially serum.
  • bodily fluids such as serum as a sample and haptoglobin
  • a glycoprotein present in a large amount in bodily fluids especially serum.
  • FDA-approved biomarker-related biomarkers contain CEA protein, but have a limit of 70%.
  • the present invention analyzes the N-sugar chain structure that is changed in colorectal cancer patients by mass spectrometry compared to normal people, and thus the expression of specific N-sugar chain structures including Gomannose structure is different from that in normal cancer patients. It can provide a method for diagnosing the problem.
  • the lists of sugar chain biomarkers including gomannose structures discovered by mass spectrometry are summarized in Tables 3 and 4, all of which are significant biomarkers with a p value of 0.05 or less.
  • the present invention can be applied to the development of a new method for diagnosing colorectal cancer, a composition for diagnosing colorectal cancer, and a diagnostic kit.
  • Heptoglobin is one of the most abundant glycoproteins and is the major acute phase protein that increases at various stages of disease such as inflammation and tumors. Heptoglobin is known to have four N-glycosylation sites and one O-glycosylation site at 184, 207, 211 and 241 asparagine. It is not known which glycosylation type and which glycosylation site provides a distinct sugar chain change between colon cancer patients and normal controls.
  • Sugar chain structure profiling revealed several sugar chain structures with significant differences between normal controls and colorectal cancer patients.
  • Various N-sugar chain structures, including high mannose structures showed significant differences in relative amounts between normal controls and colorectal cancer patients (Table 3, Table 4).
  • the present invention is a.
  • the present invention is the N-sugar chain of step d)
  • Hex7-HexNAc6-Fuc1-NeuAc1 sugar chains (2808.0 m / z) by selecting one or more of the colorectal cancer biomarker analysis method characterized in that performed.
  • the present invention is the N-sugar chain of step d)
  • Hex6-HexNAc5-NeuAc2 sugar chain (2587.9 m / z) relates to a colon cancer biomarker analysis method characterized in that at least one. These structures differed from normal in P ⁇ 0.01 in colorectal cancer samples, but they were indistinguishable from normal in gastric cancer samples.
  • the present invention is the N-sugar chain in the mass spectrometry of step d)
  • It relates to a colon cancer biomarker analysis method characterized in that at least one of Hex9-HexNAc2 sugar chain (1882.7 m / z).
  • the present invention relates to a colon cancer biomarker analysis method characterized in that the mass spectrometry of step c) is a nano LC chip / Q-TOF mass spectrometry method.
  • the present invention is characterized in that the quantitative profiling of step d) is performed by selecting one or more of T-test p-value analysis, Receiver-Operating curve (ROC) and Area under the ROC curve (AUC) analysis It relates to a method for analyzing colorectal cancer biomarkers.
  • the present invention can be used in the field of diagnosis and prevention of colorectal cancer.

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Abstract

본 발명은 당쇄변화 탐지를 통한 대장암 진단방법에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로는 질량분석방법을 통해 탐지된 대장암 환자 유래 당단백질의 N-당쇄화 (N-linked glycosylation) 변화에 따른 특정 당쇄구조들이 증가 또는 감소하거나 유의하게 변화한 경우, 발굴된 N-당쇄 구조들은 진단마커로서 질량분석방법을 활용하는 대장암 진단 방법에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

N-당쇄 질량분석을 이용한 대장암 진단방법
본 발명은 당쇄변화 탐지를 통한 신규한 대장암 진단방법 및 대장암 진단 정보를 제공하기 위한 당쇄변화 탐지방법에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로는 질량분석방법을 통해 탐지된 햅토글로빈의 N-당쇄 질량분석을 이용한 대장암 진단방법 및 당쇄변화 탐지방법에 관한 것이다.
암은 세계적으로 제1의 사망원인이며, 이 상황은 국내에도 마찬가지이다. 암은 유전적, 환경적 요인에 의해서 형성, 발전하며 식생활의 변화, 환경오염의 심화, 환경 및 정신적 스트레스의 노출 심화 등으로 인하여 암 발생 및 암으로 인한 사망자가 해마다 증가하는 추세이다. 다른 질병과 비교해 볼 때 암의 특징은 완치가 비교적 어렵다는 것과 치료 후 생존율이 평균적으로 낮다는데 있다. 생존율과 관련하여 암이 갖는 특징은 암의 진행 정도에 따라 환자의 예후와 생존율이 큰 차이를 보인다는 것인데 약 100여 년에 가까운 암치료기술의 발전에도 불구하고, 암종마다 약간의 차이는 있지만 말기 암이나 전이가 이루어진 암의 경우는 완치율이 매우 낮다 (Etzioni R. et al., Nature Reviews Cancer 3, 243-252, 2003). 더욱이 암은 초기에 자각증상이 별로 없는 것이 일반적이며 자각증상에 의한 진단의 경우는 이미 치료가 불가능한 말기 상태로 발전한 경우가 많다. 즉, 암의 치료법 개발 필요성과 함께 치료 가능한 초기에 암을 진단할 수 있는 방법이 암의 효과적인 치료와 생존율 제고라는 목표에 가장 부합하는 전략이라고 할 수 있다. 이러한 목적으로 암의 조기진단을 도울 수 있는 생체인자, 즉 바이오마커의 연구, 개발이 현재 프로테오믹스 기법을 중심으로 해서 세계적으로 활발하게 진행되고 있다.
종양 바이오마커는 다양한 용도가 있는데, 암의 조기진단을 도울 수 있고, 암의 진행 시기를 측정하고, 치료에 따른 암의 진행상황을 모니터할 수 있게 하며 수술 후의 예후를 판단할 수 있게 하는 기능도 있다 (Rifai N. et al., Nature Biotech. 24, 971-983, 2006). 이런 목적과 기능을 가진 바이오마커를 통하여 암의 발견 및 진행상황을 추적하기 위해서는 비파괴적인 방법이 요구되며, 따라서 검사시 위험부담이 적은 혈액 등의 체액이 바이오마커 개발연구에 있어 최적의 생체시료로 인식되고 있다. 즉, 소변이나 타액, 혈액 등을 통하여 탐지할 수 있는 바이오마커 개발이 가장 표준화된 방식의 접근법이며, 그 중에서도 혈액은 모든 조직 유래의 단백질이 모이는 가장 포괄적인 생체시료라고 할 수 있다. 또한, 생체물질의 형태로 볼 때 가장 선호되는 종양 바이오마커의 형태는 단백질이라고 할 수 있다.
대장암은 결장과 직장에 생기는 악성 종양을 말하며, 세계적으로 2000년 발생률(945,000명 신규 발생, 세계 전체 암의 9.4%)과 사망률(492,000명 사망, 전체 암중 7.9%)이 모든 암 중 세 번째로 높고, 성별로 비교해보면 남자와 여자에게서 비슷한 비율로 발생한다(남:여 1.1:1). 다른 암들에 비해 상대적으로 예후가 좋기 때문에 유병률은 유방암에 이어 세계적으로 두 번째로 높은데, 과거 5년 이내에 대장암으로 진단되어 생존하고 있는 사람이 약 240만 명으로 추정된다(Parkin DM, Global cancer statistics in the year 2000, Lancet Oncol 2:533-543, 2001). 대장암 예후는 초기(1기) 환자의 경우 5년 생존율이 90% 이상인데 반해 전이된(4기) 환자의 5년 생존율은 5%에 불과하다(Cancer Facts and Figures 2004. American Cancer Society, 2004).
우리나라에서는 최근 식생활 문화의 서구화로 대장암의 발생률과 사망률이 현저히 증가하고 있다. 보건복지부와 한국 중앙암등록본부에서 발간한 한국 중앙암등록사업 연례 보고서(2002.1 ~ 2002. 12)에 따르면 2002년에 대장암 발생건수가 11,097건으로 전체 발생 암의 11.2%를 차지하는 네 번째로 많은 암이다. 성별로는 남성이 6,423명으로 여성(4,674명)보다 많으며 연령별로는 60대가 가장 많고(3,751명), 50대가 그 뒤를 잇고 있다(2,400명). 1999년부터 2002년까지 4년간 자료에 의하면 대장암의 발생률이 꾸준히 증가하고 있으며 조발생률(인구 100,000명당 새로 발생한 암 환자수)을 보면 1999년에 비해 2002년에 남자의 경우 22.5에서 30.7로 36.4% 증가하였으며, 여자의 경우 18.8에서 23.1로 22.9% 증가하여 전체적으로 20.6에서 26.9로 30.6%나 크게 증가하였다(1993-2002년 암발생자의 생존율 및 1999-2002년 암 발생률, 보건복지부, 2007. 7.). 2006년에 대장암으로 사망한 사람은 총 6,277명으로 전체 암 사망의 4위(9.5%)이며 남자는 3,453명으로 4위(8.0%), 여자는 2,824명으로 3위(11.5%)를 차지하였다. 또한 대장암은 폐암 다음으로 지난 10년 동안 사망률이 가장 많이 증가한 암이다(2006년 사망 및 사망원인통계결과, 통계청, 2007. 9.).
대장암의 경우 제거할 수 있는 전암성 병변이나 치료할 수 있는 초기단계 암으로부터 발달이 느리기 때문에 대장암 스크리닝은 이 질병의 발생률과 사망률을 줄일 수 있는 가능성이 있다. 50세 이상의 성인 남녀 모두에 대한 대장암 스크리닝 검사를 통해 대장암으로 인한 사망률을 감소시킬 수 있다고 믿어진다(Walsh JM & Terdiman JP, JAMA 289:1288-96, 2003). 그러나 현재 가장 신뢰성 있는 스크리닝 방법인 대장내시경에 대한 순응도와 보급률이 낮다. 반대로 현재 가장 널리 시행되는 비침입성 스크리닝(noninvasive screening) 옵션인 분변 잠혈검사(fecal occult blood test, FOBT)는 무엇보다 민감도가 낮다는 문제를 포함하여 여러 중요한 한계점들이 있다. 미국의 경우 2002년에 50세 이상 성인 중 40%만 지난 5년 이내에 대장내시경 검사를 받았고, 12개월 이내에 분변 잠혈검사를 받은 사람은 22%에 불과했다(Behavior risk factor survey, National center for chronic disease prevention and health promotion. Centers for disease control and prevention, 2002). 대장암 스크리닝 검사에 대한 참여율이, 특히 유방암과 자궁경부암에 비해 낮은 이유는 환자의 불편함, 비용, 인지도 부족, 현재 스크리닝 방법에 대한 낮은 수용성 등을 포함하는 여러 요인들 때문이다.
혈액 마커의 경우 분변 마커에 비해 검체를 얻기 쉽고 환자도 쉽게 참여할 수 있으며 시료처리가 쉽고 바이오마커를 분해하거나 분석을 방해할 수 있는 미생물들이 없어 대장암을 효율적으로 진단할 수 있으나, 아직 대장암 진단에 대한 바이오 마커에 대한 연구는 미비하여, 대장암 진단을 위한 바이오 마커의 개발이 필요한 상황이다.
현재까지 암의 생화학적 진행과정에서 전통적 연구는 단백질의 발현 변화에 초점이 맞추어져 수행되어 왔으나, 생체 구성 성분인 복합 당질 당쇄에 착목한 질환의 연구는 당쇄구조 해석의 어려움으로 제대로 수행되지 않았다. 그러나, 미량당쇄 구조 해석 기술, 당쇄 기능 해석기술 및 당쇄 합성 기술 등의 발전으로 복합 당질 당쇄의 중요성이 급속히 밝혀지고 있으며, 암세포의 발병이 다양한 당전이 효소의 역할에 기인하며, 이로 인한 당단백질의 당질 변화가 세포의 암화 과정과 연관되어 있다는 보고가 이어지고 있다(Orntoft,T.F., Vestergaard, E. M., “Clinical aspects of altered glycosylation of glycoproteins in cancer” Electrophoresis 1999, 20, 362-371).
당쇄화(glycosylation)는 잘 알려진 해독 후 변형(post-translational modification) [0007] 과정의 하나이다. 어떤 장기에 발생하는 암은 고유한 자체의 당쇄를 가지고 있어서, 스핑고당지질과 당단백질로 발현되는 당쇄는 종양 발달을 표지하거나 이를 저해하는 데 유용한 것으로 여겨지고 있다. 이러한 당쇄는 다양한 종류의 항체를 이용하여 진단의 목적으로 사용될 수 있을 뿐 아니라, 이러한 당쇄 항원들은 다양한 전임상 연구에서 면역치료의 훌륭한 표적으로 고려되고 있다.
대장암은 식생활의 서구화 등 환경적 요인의 변화와 함께 최근 우리나라에서 급속히 증가하는 경향을 보이고 발견되는 연령도 점점 낮아지고 있어, 대장 내시경 등 조기 진단을 위한 검사의 필요성이 증가하고 있다. 대장암은 상부 소화기관과 달리 증세가 늦게 나타나며, 증세가 나타나더라도 단순 변비나 치질로 오인하여 적절한 치료시기를 놓치는 경우가 많다. 우리나라에서 대장암은 위암, 간암, 폐암에 이어 제4위를 차지하며 지속적인 증가 추세를 보이고 있다.
일반적인 경우 대장암 환자들은 배변 습관의 변화, 혈변이나 점액변(변에 점액이 섞임), 굵기가 가늘어진 변, 체중 감소, 복부 불편감(복통·복부팽만), 피로, 식욕부진·구토·오심, 빈혈 등의 증상을 보인다. 그러나 대장암은 초기에는 대부분 아무런 증상이 없으며, 대장암으로 인해 어떤 증상이 나타나는 경우에는 이미 대장암이 상당히 진행된 경우가 많다. 현재 대장암에 사용되고 있는 선별 검사로는 대변 잠혈 검사, 종양표지자 검사, 대장조영술, 대장내시경 검사, 전산화 단층촬영, 복부 초음파 검사, 경직장 초음파, 에스결장경 검사가 있으나 이러한 검사법은 조기진단에 여러 가지 한계가 있다. 대장암 환자의 생존율을 높이기 위해서는 좀 더 정확하게 조기에 진단할 수 있는 방법이 개발되어야 할 것이다.
이러한 문제로 인하여 소량의 체액, 특히 혈액으로 암을 검사할 수 있는 체외 진단 기술에 응용 가능한 종양 바이오마커의 개발이 필요하다. 실제 지금까지는 FDA의 승인을 받은 대장암 관련 혈액 유래 바이오마커는 없는 실정이다.
인체 내 단백질의 50% 이상이 당단백질이라는 점에서 많은 인체 질환이 당단백질과 관련되어 있을 확률이 높다. 따라서 질병에 연관된 당단백질을 탐색하고 그것의 질병특이적인 당쇄구조분석 연구를 통하여 진단 마커 개발이 가능하다.
대부분 암의 생화학적인 연구는 단백질의 발현변화에 초점이 맞추어졌으나 당쇄 구조 해석 기술의 발달에 따라 암 연구에서 복합 당질 당쇄의 중요성이 커지고 있는 상황이다. 해독 후 변형(post-translational modification)의 과정 중 하나인 당쇄화 (glycosylation)가 종양 발달을 표지할 수 있음이 알려져 있으나 현재까지 종양에서 당쇄구조가 변화하는 이유에 대한 정확한 과학적 근거는 밝혀지지 않고 있다. 하지만, 이러한 암종 특이적인 당쇄는 혈액으로 배출될 수 있는데, 이러한 당쇄는 다양한 종류의 항체 등을 이용하여 진단의 목적으로 이용될 수 있다. 식물에서 유래한 렉틴은 다양한 당쇄구조를 인식할 수 있는데, 이러한 렉틴은 쉽게 이용이 가능하며 가격도 저렴하여 당쇄구조를 검출하기 위한 목적으로 많이 이용되고 있다. 하지만, 렉틴은 제한된 당쇄구조만을 검출할 수 있는 단점이 존재한다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 최근에는 진보된 방식의 질량분석기를 이용하여 기존의 분석방법으로는 분석이 불가능했던 미량의 당쇄를 분석할 수 있는 방법들이 발달하고 있다.
본 발명은 우수한 대장암 진단용 바이오마커를 제공하는 것을 목표로 한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 대장암의 신속하고 민감한 진단을 위한 대장암 바이오마커 분석방법을 제공하는 것을 목표로 한다.
본 발명자들은 여러 가지 암종에서 당쇄가 변화한다고 알려져 있는 혈액 당단백질을 분리한 후 질량분석 방법을 이용하여 정상인과 구별되는 대장암 특이적인 당쇄를 확인하였고, 정제한 당단백질에 PNGase F를 처리하여 얻은 N-당쇄의 정성 정보 및 정량 정보를 질량분석 방법을 통하여 확인하였다.
대장암 환자 햅토글로빈의 비정상적인 당쇄화는 혈청 유래 햅토글로빈의 항체를 이용한 정제 이후 칩-기반 나노-LC/TOF-MS (Chip/TOF) 분석에 의하여 입증되었다.
본 발명의 결과는 정상인 대조군과 비교하여 대장암 환자 혈청 햅토글로빈에서 N-당쇄 구조 중 일부가 현저히 적거나 현저히 많음을 명확히 나타낸다 (도 1의 A, B).
본 발명은 대장암 환자군의 당단백질 중 N-당쇄의 질량분석을 통해 정상 대조군에 비해 대장암 환자군의 당단백질에서 값이 확연히 차이 나는 고감도, 고특이도를 가지는 수 가지 N-당쇄 구조를 한번에 확인할 수 있으며, 종래의 특정 단백질의 양만을 분석하는 것과는 달리 당쇄 구조들을 이용함으로써 대장암을 진단할 수 있는 방법을 제공한다.
도 1(a)는 정상인 및 대장암 환자의 혈청에서 정제한 햅토글로빈을 질량분석한 전체 당쇄의 프로파일 및 유의한 차이를 보이는 당쇄마커 후보들을 발굴하는 그래프이다. 정제된 햅토글로빈에 PNGase F를 처리하여 N-당쇄만 분리한 후 LC-MS를 이용하여 정상인 대조군과 대장암 환자군에서 유래한 햅토글로빈의 N-당쇄를 프로파일링한 결과이다. 각 당쇄구조들은 상대값 (Relative abundance)으로 나타내었고, 전체에서 95% 이상 비율 내의 모든 구조를 나타내었다. 도 1(b)는 전체 당쇄 중 가장 큰 유의한 차이를 나타내는 세 가지 당 구조를 나타낸 것이다. 고만노즈 구조(5200, 6200 및 7200)는 모두 AUC 0.9 이상으로 80% 이상의 민감도 및 특이도를 보이는 유력한 대장암 바이오마커 후보임을 확인하였다.
아래에서는 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다. 또한, 본 발명의 실시예에서는 당단백질의 예로 햅토글로빈을 이용하였으나, 당쇄화와 관련된 효소들은 특정 단백질에 대해서만 당쇄화하는 것이 아니며, 햅토글로빈은 대표적인 당쇄화 단백질의 일 예로서 기재한 것임은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것이다.
재료 및 기타 시약
항-인간 베타-햅토글로빈 항체는 Dako (Carpinteria, CA)에서 구입하였다. PNGase F (Peptide N-glycosidase F)는 New England Biolabs (MA, USA)에서 구입하였다. 흑연화 탄소 카트리지 (Graphitized carbon cartridges)는 Grace Davison Discovery Sciences (IL, USA) 제품을 사용하였다. 질량 분광학적 계산 솔루션 (ESI-TOF Calibrant calibrant Mix mix G1969-85000)은 Agilent Technologies (CA, USA) 제품을 사용하였다. 다른 모든 약품은 분석 등급 이상의 것을 사용하였다.
대장암 환자 및 정상인의 혈청시료
혈청 시료는 한국인체자원은행 (National Biobank of Korea)의 일원인 충남대학교 병원에서 입수하였다. 20명의 대장암환자 및 20명의 정상인의 임상정보는 표 1, 표 2에 요약하였다. 환자들은 병리학자들에 의해 생검의 시험 및 진단을 받았다. 이 연구는 KAIST 윤리위원회의 허가를 받았고, 참여한 정상인과 대장암환자들로부터 동의서를 받고 연구를 수행하였다.
인간 혈청으로부터 햅토글로빈 정제
항-햅토글로빈 항체를 이용하여 항-햅토글로빈 친화 컬럼을 제조하고 정제를 수행하였다. 20명의 대장암 환자 및 20명의 정상인으로부터 각각 500 ㎕의 혈청을 얻어 4 ㎖의 PBS (phosphate-buffered saline, 10 mM 인산 완충액/2.7 mM KCl/ 137 mM NaCl, pH 7.4)에 희석하여 항-햅토글로빈 친화 컬럼에 적용하고 회전 교반기 상에서 상온으로 두 시간 동안 배양하였다. 결합하지 않은 물질들은 30 ㎖의 PBS로 컬럼을 세척하여 제거하였고, 햅토글로빈은 용출 완충액 (0.1 M 글라이신/ 0.5 M NaCl, pH 2.8)으로 용출한 후 중화 완충액 (1.0 M Tris-HCl, pH 9.0)을 함유한 튜브에 분획하였다. 용출액은 농축한 다음 원심분리 필터 (분자량 한계 10,000, Amicon Ultra, Millipore)로 계면활성제를 제거한 다음 Quant-iT Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA)로 햅토글로빈을 분석하였고, 12.5% SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색을 수행하였다. 시료는 동결건조하여 분석시까지 -80℃에 보관하였다.
효소를 이용한 N- 당쇄 분리
플라보박테리움 메닝고셉티쿰 (Flavobacterium meningosepticum) 유래 PNGase F (peptide N-glycosidase F; 500,000 unit/㎖)를 New England BioLabs (Ipswich, MA)에서 구입하였다. 효소를 이용하여 당쇄를 단백질로부터 분리하기 위해, 상기 실시예를 거쳐 얻어진 50 ㎕의 햅토글로빈을 소화 완충액 (pH 7.5, 100 mM 중탄산 암모늄, 5 mM DTT)에 용해시키고, 끓는 물에 2분간 가열하여 단백질을 변성시켰다. 실온에서 식힌 후 2 ㎕의 PNGase F (1,000 units)를 가하고 혼합액을 37 ℃ 수조에서 16시간 동안 배양하였다.
차가운 상태의 400 ㎕ 에탄올을 가하여 펩타이드와 단백질을 침전시켰다.
얻은 용액은 -40 ℃에서 60 분간 동결한 후 4 ℃에서 분당 14,000 rpm으로 20분간 원심분리한 후 각 시료마다 400 ㎕의 상층액을 취하고, 상층액에 포함된 에탄올을 완전히 건조시켰다.
그 후 각 시료에 1 ㎖의 물을 가하고 격렬히 교반하여 정제를 위한 당쇄 함유 시료를 준비하였다.
당쇄 정제
PNGase F로 분리된 당쇄 함유 시료를 흑연 처리한 탄소 카트리지 SPE (PGC-SPE; 충진량 150 ㎎, 카트리지 부피 3 ㎖)로 정제하였다. PGC SPE 카트리지는 Alltech (Deerfield, IL)에서 입수하였다. 사용에 앞서 카트리지를 초순수 6 ㎖로 세척하고 0.1% 트리플루오로초산 (TFA) 함유 80% (v/v) 아세토나이트릴 (ACN) 6 ㎖로 세척한 후 다시 초순수 6 ㎖로 세척하였다. 당쇄 함유 시료는 PGC 카트리지에 넣고 카트리지 부피의 수 배의 초순수를 1 ㎖/min의 속도로 흘려주어 염을 제거하였다. N-당쇄는 10% (v/v) 아세토나이트릴, 20% (v/v) 아세토나이트릴 및 40% (v/v) 아세토나이트릴과 0.05% (v/v) TFA로 순서대로 용출시켰다. 각 분획을 수집하여 원심식 증발기로 건조시켰다. 분획들은 질량분석에 앞서 초순수에 용해시켰다.
칩-기반 나노-LC/MS 및 MS/MS
Nano-LC 분리는 종래기술에 따라 수행하였다. 각 시료의 N-당쇄 분획들을 함께 조합하여 2.0 ㎕ (800 ng 햅토글로빈에 해당함)를 칩이 올려진 나노-LC 컬럼 (Agilent Technologies) 상에 오토샘플러로 주입하였는데, 나노-LC 컬럼은 9 X 0.075 mm i.d. 농축용 컬럼 및 43 X 0.075 mm i.d. 분석용 컬럼으로 구성되어 있고, 양 컬럼은 모두 정지상으로 5 ㎛의 다공성 흑연화 카본으로 패킹되어 있다. 쾌속 당쇄 용출 농도구배는 (A) 3.0% 아세토나이트릴 및 0.1% 포름산 (v/v) 수용액, 그리고 (B) 90.0% 아세토나이트릴 및 0.1% 포름산 (v/v) 수용액을 이용하여 20분간 B 용액을 6%에서 100%까지 올리며 0.3 ㎕/min의 속도로 흘려주었다. 남아있는 비당쇄 화합물들은 재평형화 이전에 100% B 용액으로 흘려보냈다. 크로마토그래피를 이용한 분리 이후, 당쇄들은 칩-집적 나노-ESI 스프레이 팁으로 이온화하고 Q-TOF 질량분석기 (Model 6540, Agilent Technologies)로 종래기술에 따라 분석하였다. 캘리브란트 분자 (ESI-TOF Calibrant Mix G1969-85000, Agilent Technologies)들은 직접 전기스프레이 내로 주사하여 내부 질량 측정이 가능하도록 하였다. MS 스펙트럼은 스펙트럼당 2초의 획득시간으로 질량범위 m/z 500-2000을 넘어 양성 이온화 모드에서 얻어졌다. MS/MS 스펙트럼은 스펙트럼당 1.5초의 획득시간으로 질량범위 m/z 100-3000을 넘어 양성 이온화 모드에서 얻어졌다. MS 스캔 이후 전구체 화합물들은 이온 양 및 전하 상태 (z = 2 또는 3)에 기초한 획득 소프트웨어에 의해 MS/MS 분석용으로 자동 선택되었고, 1.3 m/z의 질량 대역 (mass bandpass) FWHM (full width at half maximum)으로 사중극 (quadrupole)에서 분리되었고, 다음의 식에 따라 CID에 의해 단편화되었다.
V collision=1.8V{(m/z)/100Da}-4.8V
이 식에서, V collision은 전구체를 가속하고 조각내기 위해 충돌세포를 가로질러 적용한 전압을 말한다. 원 LC-MS 데이타는 MassHunter 질적 분석 소프트웨어 (version B.04.00 SP2, Agilent Technologies)에 포함된 Molecular Feature Extractor 알고리즘을 이용하여 수행하였다. MS 피크는 신호 대 노이즈 비율 5.0으로 여과되어 화합물 질량, 이온 양 및 체류시간 리스트를 얻기 위해 한 번에 하나씩 당을 제거하여 당쇄 서열을 결정하였다 (deconvolute).
정확한 질량에 의한 N- 당쇄 규명
nano-LC/MS에 의해 탐지된 화합물들은 알려진 생물학적 합성경로와 당쇄화 패턴에 기초한 모든 가능한 복합, 하이브리드 및 고-만노스 당쇄 구조의 당쇄 데이타베이스에 정확한 질량을 비교하였다. 각 ECC 피크의 당쇄 서열 결정방법으로 결정된 질량은 20 ppm의 질량 오차 허용치를 이용하여 이론적 당쇄 질량과 비교하였다. 인간 혈청 유래 시료 셋트와 같이, 헥소스 (Hexose), HexNAc (N-acetylhexosamine), 퓨코스 (fucose) 및 NeuAc (N-acetylneuraminic acid)를 포함하는 당쇄 구성만 고려하였다. T 검정 p-값 분석, ROC 커브(Receiver-Operating Characteristic curve) 및 AUC (Area under the ROC curve) 등을 이용하여 각 시료에서 추출된 N-당쇄를 비교분석하였다.
결과 1: 햅토글로빈의 대장암 특이적 N- 당쇄 분석
혈액 당단백질인 햅토글로빈의 자세한 당쇄화 패턴은 칩-기반 나노-LC/TOF-MS (Chip/TOF) 시스템으로 분석하였는데, 이 시스템은 다른 연결 또는 다른 가지를 갖는 당쇄 이질성 (heterogeneity)을 식별할 수 있고 MALDI-MS 및 전통적인 LC/MS와 비교하여 더 높은 민감성을 제공할 수 있는데, 이는 낮은 에너지 이온, 넓은 다이나믹 레인지 및 매치되지 않는 체류시간 재생성 제공과 같은 부가적인 장점 때문이다. 본 발명자들은 나노-LC/MS로 두 번씩 정상인과 환자 (n=40)의 혈청 시료 유래 햅토글로빈의 N-당쇄를 분석하였다. PNGase F 처리를 통하여 햅토글로빈의 N-당쇄만 분리한 후 칩-기반 나노-/TOF-MS (Chip/TOF)로 정상인 대조군과 대장암 환자군에서 유래한 햅토글로빈의 N-당쇄를 비교하였다. 각 시료 내에서 확인되는 전체 N-당쇄 구조의 상위 95% 비율 내의 모든 구조를 이용하였고 정량값을 비교하였다. 해당 N-당쇄 구조들 중 고만노즈 (high mannose) 구조들 중에 1234.43의 질량 값을 나타낸 Hex5-HexNAc2 (5200 당쇄 구조), 1396.48의 질량 값을 나타낸 Hex6-HexNAc2 (6200 당쇄 구조) 그리고 1558.54의 질량 값을 나타낸 Hex7-HexNAc2 (7200 당쇄 구조) 등이 0.90 이상의 높은 AUC값을 나타내었다. 또한 정상인 대조군과 대장암 환자군 간에 현저한 차이를 보이는 몇몇 당쇄 구조 중 고만노즈 구조 이외에 Hex4-HexNAc3-NeuAc1 당쇄 (1566.6 m/z), Hex5-HexNAc5-Fuc1-NeuAc2 당쇄 (2571.9 m/z), Hex6-HexNAc5 당쇄 (2005.7 m/z) 및 Hex6-HexNAc5-NeuAc2 당쇄 (2587.9 m/z) 구조들은 대장암 시료에서 P<0.01로 정상인 대조군과 차이를 보였으나, 위암 환자 시료에서는 정상인 대조군과 차이가 구분되지 못한 당쇄 구조들이다.
도 1은 정상인 및 대장암환자의 혈청에서 정제한 햅토글로빈을 질량분석을 이용하여 분석한 전체 당쇄의 프로파일로서, 이 데이타로부터 유의한 차이를 보이는 당쇄마커 후보를 발굴하였다. A는 정제된 햅토글로빈에 PNgaseF처리를 하여 N-당쇄만 분리한 후 LC-MS를 이용하여 정상인 대조군과 대장암 환자군에서 유래한 햅토글로빈의 N-당쇄 프로파일링 결과이다. 각 N-당쇄 구조들은 상대값(Relative abundance)로 나타내었고, 전체에서 95% 이상 비율 내의 모든 구조를 나타내었다. B는 전체 N-당쇄 중 가장 큰 유의한 차이를 보이는 세 가지 N-당쇄 구조이다. 고만노즈구조 (5200, 6200, 7200)는 모두 모두 AUC 0.9 이상으로 80% 이상의 민감도 및 특이도를 보이는 대장암 특이적인 당마커 후보임을 확인하였다.
표 1, 표 2는 총 40명의 정상인과 대장암 환자군 (정상 20명, 대장암 환자 20명)에 대한 요약 정보이다. 각 혈청 시료는 한국 인체자원은행 (National Biobank of Korea)의 일원인 충남대학교 병원에서 입수하였고, 환자들은 병리학자들에 의해 생검의 시험 및 진단을 받았다.
표 3, 표 4는 nano LC chip/Q-TOF MS방법으로 확인된 햅토글로빈에서 분리된 N-당쇄 구조 중에서 정상인과 대장암 환자군의 상대적인 p 값이 0.05 이하인 감도를 보이는 N-당쇄 구조 리스트이다. 참고로 N-당쇄 구조는 체류시간 라이브러리 (retention time library)로 확인이 가능하며 당쇄 구조별로 모든 햅토글로빈 유래 N-당쇄 구조의 존재량을 파악할 수 있다. 표 3, 표 4에서는 MS 질량분석 결과를 토대로 고만노즈 구조와 각 가지 (antennary) 별로 당쇄 구조를 구분하였다. 특히 몇 가지 고만노즈 구조 (Hex5-HexNAc2 당쇄 (1234.4 m/z), Hex6-HexNAc2 당쇄 (1396.5 m/z), Hex7-HexNAc2 당쇄 (1558.5 m/z))는 AUC 0.9 이상으로 대장암 환자와 정상인을 정확하게 구분할 수 있음을 확인했다. 또한 Hex4-HexNAc3-NeuAc1 당쇄 (1566.6 m/z), Hex5-HexNAc5-Fuc1-NeuAc2 당쇄 (2571.9 m/z), Hex6-HexNAc5 당쇄 (2005.7 m/z) 및 Hex6-HexNAc5-NeuAc2 당쇄 (2587.9 m/z) 구조들은 대장암 시료에서 P<0.01로 정상과 차이를 보였으나, 위암 환자 시료에서는 정상과 차이가 구분되지 못한 당쇄 구조들로 위암과 구분될 수 있는 대장암 특이적인 당마커 후보임을 확인하였다.
본 발명은 혈청 등의 체액을 시료로 사용하고 체액, 특히 혈청 내에 다량으로 존재하는 당단백질인 햅토글로빈을 이용함으로서 체외 진단 기술 응용이 용이하다. 현재 FDA 승인된 대장암 관련 바이오 마커는 CEA 단백질이 있으나 70% 정도의 진단율을 보이는 한계가 있다.
본 발명은 정상인에 비해 대장암 환자에서 바뀌는 N-당쇄 구조를 질량분석을 통해 분석함으로써 고만노즈 구조를 포함한 특정 N-당쇄 구조들의 발현이 대장암 환자에서 정상인과 차이가 나는 결과를 이용하여 대장암을 진단하는 방법을 제공할 수 있다. 질량분석법을 통해 발굴한 고만노즈 구조들을 포함한 당쇄구조 바이오 마커 리스트는 표 3, 표 4에 정리되었으며, 이들은 모두 p 값 0.05 이하로 유의성 있는 바이오마커이다.
본 발명은 새로운 대장암 진단 방법, 대장암 진단용 조성물 및 진단 키트 개발에 응용될 수 있다.
Case no. Classification Age Sex Location ClinicalTNM Stage
cc1 Colon Cancer 71 F ascending T2N0M0 Ⅰ
cc2 Colon Cancer 51 F sigmoid T3N0M0 ⅡA
cc3 Colon Cancer 70 F rectum T3N0M0 ⅡA
cc4 Colon Cancer 54 F descending T2N0M0 Ⅰ
cc5 Colon Cancer 62 F sigmoid T3N0M0 ⅡA
cc6 Colon Cancer 81 M ascending T3N0M0 ⅡA
cc7 Colon Cancer 68 F ascending T1N0M0 Ⅰ
cc8 Colon Cancer 65 M rectum T3N0M0 ⅡA
cc9 Colon Cancer 73 M rectum T3N1bM0 ⅢB
cc10 Colon Cancer 64 F ascending T3N0M0 ⅡA
cc11 Colon Cancer 73 F rectosigmoid T3N0M0 ⅡA
cc12 Colon Cancer 76 F rectum T0N0M0 ⅢB
cc13 Colon Cancer 69 F sigmoid TisN0M0 0
cc14 Colon Cancer 62 M sigmoid T3N0M0 ⅡA
cc15 Colon Cancer 64 M ascending T2N0M0 Ⅰ
cc16 Colon Cancer 61 M rectum T2N0M0 Ⅰ
cc17 Colon Cancer 70 F ascending T2N0M0 Ⅰ
cc18 Colon Cancer 66 F sigmoid T3N1M1 Ⅳ
cc19 Colon Cancer 68 F sigmoid TN0M0 Ⅰ
cc20 Colon Cancer 70 F rectum T2N0M0 Ⅰ
Case no. Classification Age Sex
n1 normal 34 M
n2 normal 31 M
n3 normal 31 M
n4 normal 30 M
n5 normal 53 F
n6 normal 49 F
n7 normal 49 F
n8 normal 51 F
n9 normal 49 F
n10 normal 61 F
n11 normal 61 F
n12 normal 60 M
n13 normal 34 F
n14 normal 52 F
n15 normal 51 M
n16 normal 59 M
n17 normal 47 F
n18 normal 63 F
n19 normal 46 M
n20 normal 47 M
GlycanMass/Da Composition Relative abundance(%) t-Test AUC
Hex HexNAc Fuc NeuAc Normal Colon Cancer
High Mannose
1234.43 5 2 0 0 0.58 0.19 0.000555 0.91
1396.48 6 2 0 0 0.40 0.11 0.000108 0.91
1558.54 7 2 0 0 0.29 0.07 0.000377 0.94
1720.59 8 2 0 0 0.27 0.08 0.008656 0.87
1882.65 9 2 0 0 0.10 0.03 0.000204 0.83
Mono,Bi-antennary
1566.56 4 3 0 1 3.4865 2.065 0.009169 0.77
1437.50 5 3 0 0 0.2468 0.1444 0.003803 0.75
1462.54 3 4 1 0 0.2645 0.1235 0.006786 0.74
1624.60 4 4 1 0 0.5336 0.2776 0.010488 0.72
1769.64 4 4 0 1 1.3232 0.8425 0.025722 0.76
1915.71 4 4 1 1 0.1402 0.0325 0.001757 0.83
1640.59 5 4 0 0 14.3 21.967 0.004744 0.77
1786.65 5 4 1 0 0.7582 1.2421 0.021130 0.65
1931.69 5 4 0 1 39.632 27.961 0.018485 0.77
2077.74 5 4 1 1 1.8768 0.9942 0.000309 0.85
1802.65 6 4 0 0 0.0261 0.0975 0.000467 0.72
GlycanMass/Da Composition Relative abundance(%) t-Test AUC
Hex HexNAc Fuc NeuAc Normal Colon Cancer
Tri-antennary
1665.63 3 5 1 0 0.1043 0.0532 0.012200 0.69
1827.65 4 5 1 0 0.2608 0.134 0.007611 0.77
1989.73 5 5 1 0 0.4789 0.2619 0.000844 0.8
2134.76 5 5 0 1 0.7312 0.4441 0.000218 0.86
2280.82 5 5 1 1 1.8226 0.6526 0.000262 0.9
2571.92 5 5 1 2 0.3514 0.0355 0.000710 0.86
2005.72 6 5 0 0 6.7373 13.096 0.002537 0.8
2151.77 6 5 1 0 0.4991 2.2004 0.000539 0.79
2297.85 6 5 2 0 0.0269 0.1298 0.015538 0.6
2587.93 6 5 0 2 0.082 0.0206 0.003398 0.77
2442.88 6 5 1 1 1.0125 1.6435 0.012092 0.72
Tetra-antennary
2370.85 7 6 0 0 0.9597 2.1479 0.001962 0.75
2516.91 7 6 1 0 0.0566 0.4507 0.003370 0.74
2808.00 7 6 1 1 0.089 0.2639 0.005788 0.73
햅토글로빈은 아주 풍부한 당단백질 중 하나이며, 염증 및 종양과 같은 다양한 질병 진행단계에서 증가하는 주요 급성상 단백질 (acute phase protein)이다. 햅토글로빈에는 184, 207, 211 및 241 아스파라긴에 네 개의 N-당쇄화 부위가 있고, 하나의 O-당쇄화 부위가 있다고 알려져 있다. 어떤 당쇄화 타입과 어떤 당쇄화 부위가 대장암 환자와 정상인 대조군 간에 구별되는 당쇄 변화를 제공하는지는 알려져 있지 않다.
본 발명자들은 항-햅토글로빈 항체 친화 크로마토그래피로 혈청 유래 햅토글로빈 정제를 수행하였다.
본 발명자들은 면역친화 크로마토그래피 정제 후 칩-기반 나노-LC/TOF-MS (Chip/TOF) 분석을 이용하여 정확한 당쇄화 상태를 결정하였다. LC-MS는 MALDI-MS보다 높아진 민감도 및 이온 단편화가 덜 얻어지므로, 본 발명자들은 햅토글로빈의 상세한 당쇄 구조를 성공적으로 설명할 수 있었다. 결론적으로, 대장암 환자 유래 햅토글로빈에서 변형된 N-당쇄가 탐지되었다.
당쇄구조 프로파일링을 통하여 정상인 대조군과 대장암 환자군 간에 현저한 차이를 보이는 몇몇 당쇄 구조를 발견할 수 있었다. 고 만노스 구조를 포함한 다양한 N-당쇄 구조들은 정상인 대조군과 대장암 환자 사이에 상대적 양에서 현저한 차이를 나타내었다 (표 3, 표 4).
본 발명자들은 정상인 대조군과 대장암 환자군 간의 고만노스 구조의 차이를 발견하였다. 흥미롭게도, 이러한 고만노스 구조의 차이는 칩-기반 나노-LC/TOF-MS (Chip/TOF)에 의해 관찰되었는데, 이는 이 방법을 이용함으로써 높은 민감성가지고 당쇄 구조를 분류할 수 있기 때문이다. 이러한 사실은 고감도의 질량분석방법이 바이오마커를 이용한 암 진단에 유용하게 활용될 수 있음을 증명한다. 이러한 결과로 얻은 비정상적인 당쇄 구조들은 현재 비특이적인 대장암 마커들을 대체할 수 있는 유용한 당쇄 마커임을 말해준다.
본 발명은
a) 피검체 유래 전 혈액, 혈청 또는 혈장 시료로부터 햅토글로빈 등의 당단백질을 분리하는 단계;
b) 분리된 당단백질로부터 N-당쇄를 분리하는 단계;
c) 분리된 N-당쇄를 LC/MS로 질량분석하는 단계; 및
d) 질량분석한 결과에 대해 N-당쇄의 구조 및 조성을 밝히고 정량적 프로파일링을 수행하는 단계를 포함하는, 대장암 바이오마커 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 d) 단계의 N-당쇄가
Hex5-HexNAc2 당쇄 (1234.4 m/z),
Hex6-HexNAc2 당쇄 (1396.5 m/z),
Hex7-HexNAc2 당쇄 (1558.5 m/z),
Hex8-HexNAc2 당쇄 (1720.6 m/z),
Hex9-HexNAc2 당쇄 (1882.7 m/z),
Hex4-HexNAc3-NeuAc1 당쇄 (1566.6 m/z),
Hex5-HexNAc3 당쇄 (1437.5 m/z),
Hex3-HexNAc4-Fuc1 당쇄 (1462.5 m/z),
Hex4-HexNAc4-Fuc1 당쇄 (1624.6 m/z),
Hex4-HexNAc4-NeuAc1 당쇄 (1769.6 m/z),
Hex4-HexNAc4-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (1915.7 m/z),
Hex5-HexNAc4 당쇄 (1640.6 m/z),
Hex5-HexNAc4-Fuc1 당쇄 (1786.7 m/z),
Hex5-HexNAc4-NeuAc1 당쇄 (1931.7 m/z),
Hex5-HexNAc4-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (2077.7 m/z),
Hex6-HexNAc4 당쇄 (1802.7 m/z),
Hex3-HexNAc5-Fuc1 당쇄 (1665.6 m/z),
Hex4-HexNAc5-Fuc1 당쇄 (1827.7 m/z),
Hex5-HexNAc5-Fuc1 당쇄 (1989.7 m/z),
Hex5-HexNAc5-NeuAc1 당쇄 (2134.8 m/z),
Hex5-HexNAc5-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (2280.8 m/z),
Hex5-HexNAc5-Fuc1-NeuAc2 당쇄 (2571.9 m/z),
Hex6-HexNAc5 당쇄 (2005.7 m/z),
Hex6-HexNAc5-Fuc1 당쇄 (2151.8 m/z),
Hex6-HexNAc5-Fuc2 당쇄 (2297.9 m/z),
Hex6-HexNAc5-NeuAc2 당쇄 (2587.9 m/z),
Hex6-HexNAc5-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (2442.9 m/z),
Hex7-HexNAc6 당쇄 (2370.9 m/z),
Hex7-HexNAc6-Fuc1 당쇄 (2516.9 m/z) 및
Hex7-HexNAc6-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (2808.0 m/z) 중 하나 이상을 선택하여 수행함을 특징으로 하는 대장암 바이오마커 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 d) 단계의 N-당쇄가
Hex4-HexNAc3-NeuAc1 당쇄 (1566.6 m/z),
Hex5-HexNAc5-Fuc1-NeuAc2 당쇄 (2571.9 m/z),
Hex6-HexNAc5 당쇄 (2005.7 m/z) 및
Hex6-HexNAc5-NeuAc2 당쇄 (2587.9 m/z) 구조 중 하나 이상임을 특징으로 하는 대장암 바이오마커 분석방법에 관한 것이다. 이 구조들은 대장암 시료에서 P<0.01로 정상과 차이를 보였으나, 위암 시료에서는 정상과 차이가 구분되지 못한 당쇄 구조들이다.
또한, 본 발명은 상기 d) 단계의 질량분석에서 N-당쇄가
Hex5-HexNAc2 당쇄 (1234.4 m/z),
Hex6-HexNAc2 당쇄 (1396.5 m/z),
Hex7-HexNAc2 당쇄 (1558.5 m/z),
Hex8-HexNAc2 당쇄 (1720.6 m/z) 및
Hex9-HexNAc2 당쇄 (1882.7 m/z) 중 하나 이상임을 특징으로 하는 대장암 바이오마커 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 c) 단계의 질량분석이 나노 LC 칩/Q-TOF 질량분석 방법임을 특징으로 하는 대장암 바이오마커 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 d) 단계의 정량적 프로파일링이 T 검정 p-값 분석, ROC (Receiver-Operating curve) 및 AUC (Area under the ROC curve) 분석 중 한 가지 이상을 선택하여 수행함을 특징으로 하는 대장암 바이오마커 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은
a) 피검체 유래 혈액 시료 및 정상인 혈액 시료로부터 각각 햅토글로빈을 분리하는 단계;
b) 분리된 각 햅토글로빈으로부터 N-당쇄를 분리하는 단계;
c) 분리된 N-당쇄를 LC/MS로 질량분석하는 단계; 및
d) 질량분석한 결과에 대해 N-당쇄의 구조 및 조성을 밝히고 정량적 프로파일링을 수행하여 정상인 혈액 유래 N-당쇄와 비교하여 피검체 유래 N-당쇄 T 검정 p-값 0.05 이하 또는 AUC (Area under the ROC curve) 값 0.7 이상인 경우 대장암인 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 대장암 바이오마커 분석방법에 관한 것이다.
본 발명은 대장암의 진단과 예방 분야에 이용할 수 있다.

Claims (13)

  1. a) 피검체 유래 혈액 시료로부터 햅토글로빈을 분리하는 단계;
    b) 분리된 햅토글로빈으로부터 N-당쇄를 분리하는 단계;
    c) 분리된 N-당쇄를 LC/MS로 질량분석하는 단계; 및
    d) 질량분석한 결과에 대해 N-당쇄의 구조 및 조성을 밝히고 정량적 프로파일링을 수행하는 단계를 포함하는, 대장암 바이오마커 분석방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 d) 단계의 N-당쇄가
    Hex5-HexNAc2 당쇄 (1234.4 m/z),
    Hex6-HexNAc2 당쇄 (1396.5 m/z),
    Hex7-HexNAc2 당쇄 (1558.5 m/z),
    Hex8-HexNAc2 당쇄 (1720.6 m/z),
    Hex9-HexNAc2 당쇄 (1882.7 m/z),
    Hex4-HexNAc3-NeuAc1 당쇄 (1566.6 m/z),
    Hex5-HexNAc3 당쇄 (1437.5 m/z),
    Hex3-HexNAc4-Fuc1 당쇄 (1462.5 m/z),
    Hex4-HexNAc4-Fuc1 당쇄 (1624.6 m/z),
    Hex4-HexNAc4-NeuAc1 당쇄 (1769.6 m/z),
    Hex4-HexNAc4-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (1915.7 m/z),
    Hex5-HexNAc4 당쇄 (1640.6 m/z),
    Hex5-HexNAc4-Fuc1 당쇄 (1786.7 m/z),
    Hex5-HexNAc4-NeuAc1 당쇄 (1931.7 m/z),
    Hex5-HexNAc4-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (2077.7 m/z),
    Hex6-HexNAc4 당쇄 (1802.7 m/z),
    Hex3-HexNAc5-Fuc1 당쇄 (1665.6 m/z),
    Hex4-HexNAc5-Fuc1 당쇄 (1827.7 m/z),
    Hex5-HexNAc5-Fuc1 당쇄 (1989.7 m/z),
    Hex5-HexNAc5-NeuAc1 당쇄 (2134.8 m/z),
    Hex5-HexNAc5-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (2280.8 m/z),
    Hex5-HexNAc5-Fuc1-NeuAc2 당쇄 (2571.9 m/z),
    Hex6-HexNAc5 당쇄 (2005.7 m/z),
    Hex6-HexNAc5-Fuc1 당쇄 (2151.8 m/z),
    Hex6-HexNAc5-Fuc2 당쇄 (2297.9 m/z),
    Hex6-HexNAc5-NeuAc2 당쇄 (2587.9 m/z),
    Hex6-HexNAc5-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (2442.9 m/z),
    Hex7-HexNAc6 당쇄 (2370.9 m/z),
    Hex7-HexNAc6-Fuc1 당쇄 (2516.9 m/z) 및
    Hex7-HexNAc6-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (2808.0 m/z) 중 하나 이상임을 특징으로 하는 대장암 바이오마커 분석방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 d) 단계의 N-당쇄가
    Hex5-HexNAc2 당쇄 (1234.4 m/z),
    Hex6-HexNAc2 당쇄 (1396.5 m/z),
    Hex7-HexNAc2 당쇄 (1558.5 m/z),
    Hex8-HexNAc2 당쇄 (1720.6 m/z) 및
    Hex9-HexNAc2 당쇄 (1882.7 m/z) 구조 중 하나 이상임을 특징으로 하는 대장암 바이오마커 분석방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 d) 단계의 N-당쇄가
    Hex4-HexNAc3-NeuAc1 당쇄 (1566.6 m/z),
    Hex5-HexNAc5-Fuc1-NeuAc2 당쇄 (2571.9 m/z),
    Hex6-HexNAc5 당쇄 (2005.7 m/z) 및
    Hex6-HexNAc5-NeuAc2 당쇄 (2587.9 m/z) 구조 중 하나 이상임을 특징으로 하는 대장암 바이오마커 분석방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 c) 단계의 LC/MS는 nano LC chip/Q-TOF MS임을 특징으로 하는 대장암 바이오마커 분석방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 d) 단계의 정량적 프로파일링은 T 검정 p-값 분석, ROC (Receiver-Operating curve) 및 AUC (Area under the ROC curve) 분석 중 한 가지 이상을 선택하여 수행함을 특징으로 하는 대장암 바이오마커 분석방법.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 혈액 시료는 전 혈액, 혈청 및 혈장 중 선택된 1종임을 특징으로 하는 대장암 바이오마커 분석방법.
  8. a) 피검체 유래 혈액 시료 및 정상인 혈액 시료로부터 각각 햅토글로빈을 분리하는 단계;
    b) 분리된 각 햅토글로빈으로부터 N-당쇄를 분리하는 단계;
    c) 분리된 N-당쇄를 LC/MS로 질량분석하는 단계; 및
    d) 질량분석한 결과에 대해 N-당쇄의 구조 및 조성을 밝히고 정량적 프로파일링을 수행하는 단계; 및
    e) 프로파일링 결과, 정상인 혈액 유래 N-당쇄와 비교하여 피검체 유래 N-당쇄의 T 검정 p-값 0.05 이하 또는 AUC (Area under the ROC curve) 값 0.7 이상인 N-당쇄를 대장암 바이오마커로 선정하는 단계;를 포함하는, 대장암 바이오마커 분석방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    e) 단계 이후
    f) 대장암 바이오마커로 선정된 동일 구조의 N-당쇄에 대하여 피검체 유래 N-당쇄의 함량이 정상인의 N-당쇄 함량에 비해 유의한 차이가 있는 경우 대장암인 것으로 판단하는 단계;를 더 포함하는, 대장암 바이오마커 분석방법.
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 e) 단계에서 선정된 대장암 바이오마커는
    Hex5-HexNAc2 당쇄 (1234.4 m/z),
    Hex6-HexNAc2 당쇄 (1396.5 m/z),
    Hex7-HexNAc2 당쇄 (1558.5 m/z),
    Hex8-HexNAc2 당쇄 (1720.6 m/z),
    Hex9-HexNAc2 당쇄 (1882.7 m/z),
    Hex4-HexNAc3-NeuAc1 당쇄 (1566.6 m/z),
    Hex5-HexNAc3 당쇄 (1437.5 m/z),
    Hex3-HexNAc4-Fuc1 당쇄 (1462.5 m/z),
    Hex4-HexNAc4-Fuc1 당쇄 (1624.6 m/z),
    Hex4-HexNAc4-NeuAc1 당쇄 (1769.6 m/z),
    Hex4-HexNAc4-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (1915.7 m/z),
    Hex5-HexNAc4 당쇄 (1640.6 m/z),
    Hex5-HexNAc4-Fuc1 당쇄 (1786.7 m/z),
    Hex5-HexNAc4-NeuAc1 당쇄 (1931.7 m/z),
    Hex5-HexNAc4-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (2077.7 m/z),
    Hex6-HexNAc4 당쇄 (1802.7 m/z),
    Hex3-HexNAc5-Fuc1 당쇄 (1665.6 m/z),
    Hex4-HexNAc5-Fuc1 당쇄 (1827.7 m/z),
    Hex5-HexNAc5-Fuc1 당쇄 (1989.7 m/z),
    Hex5-HexNAc5-NeuAc1 당쇄 (2134.8 m/z),
    Hex5-HexNAc5-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (2280.8 m/z),
    Hex5-HexNAc5-Fuc1-NeuAc2 당쇄 (2571.9 m/z),
    Hex6-HexNAc5 당쇄 (2005.7 m/z),
    Hex6-HexNAc5-Fuc1 당쇄 (2151.8 m/z),
    Hex6-HexNAc5-Fuc2 당쇄 (2297.9 m/z),
    Hex6-HexNAc5-NeuAc2 당쇄 (2587.9 m/z),
    Hex6-HexNAc5-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (2442.9 m/z),
    Hex7-HexNAc6 당쇄 (2370.9 m/z),
    Hex7-HexNAc6-Fuc1 당쇄 (2516.9 m/z) 및
    Hex7-HexNAc6-Fuc1-NeuAc1 당쇄 (2808.0 m/z) 중 하나 이상임을 특징으로 하는 대장암 바이오마커 분석방법.
  11. 청구항 8에 있어서,
    상기 e) 단계에서 선정된 대장암 바이오마커는
    Hex5-HexNAc2 당쇄 (1234.4 m/z),
    Hex6-HexNAc2 당쇄 (1396.5 m/z),
    Hex7-HexNAc2 당쇄 (1558.5 m/z),
    Hex8-HexNAc2 당쇄 (1720.6 m/z) 및
    Hex9-HexNAc2 당쇄 (1882.7 m/z) 구조 중 하나 이상임을 특징으로 하는 대장암 바이오마커 분석방법.
  12. 청구항 8에 있어서,
    상기 e) 단계에서 선정된 대장암 바이오마커는
    Hex4-HexNAc3-NeuAc1 당쇄 (1566.6 m/z),
    Hex5-HexNAc5-Fuc1-NeuAc2 당쇄 (2571.9 m/z),
    Hex6-HexNAc5 당쇄 (2005.7 m/z) 및
    Hex6-HexNAc5-NeuAc2 당쇄 (2587.9 m/z) 구조 중 하나 이상임을 특징으로 하는 대장암 바이오마커 분석방법.
  13. 청구항 8에 있어서,
    상기 혈액 시료는 전 혈액, 혈청 및 혈장 중 선택된 1종임을 특징으로 하는 대장암 바이오마커 분석방법.
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