KR102222002B1 - 중간-상하향 분석법으로 탐색한 표적 당단백질 유래 위암 바이오마커 - Google Patents

중간-상하향 분석법으로 탐색한 표적 당단백질 유래 위암 바이오마커 Download PDF

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Abstract

표적 당단백질의 부위 특이적 당쇄화 정보는 질병 진단에 고민감도 바이오마커를 제공할 수 있다. 일반적으로 부위 특이적 당쇄화 분석은 두 가지 다른 방법, 즉 트립신 소화를 이용한 프로테옴 접근과 탠덤 MS를 이용한 프로테옴 접근 또는 프로네이즈 소화를 이용한 글리코믹스 접근 방식으로 수행되었다. 그러나 기존의 두 가지 접근방식의 데이터 처리와 해석은 어렵고 지루하며 시간이 많이 소요되었다. 따라서 다량의 임상 시료 세트에 대해 높은 고민감도와 고특이성을 나타내는 용이하고 직접적인 방법이 요구되어 왔다. 본 발명에서는 표적 혈청 합토글로빈(Hp)을 위한 중간-상하향 글라이코프로테옴 방법을 발명하여 비교적 간단한 시료 준비와 데이터 처리 및 해석방법으로 임상 시료를 분석하여 위암 바이오마커를 발견하였다. 트립신이 생성하는 Hp의 글라이코폼은 펩타이드 순서에 따라 3개의 당펩타이드 군으로 분류할 수 있으며, 각각 3개 군에서 10, 15, 14개의 잠재적 바이오마커(p < 0.0001)가 발견되었다. 바이오마커를 보완하고 개선하기 위해 다변량 로지스틱 회귀 분석 모델을 3개 군의 잠재적 당펩타이드 바이오마커에 적용하였다. 결합된 바이오마커의 ROC 곡선은 AUC 값이 0.974, 0.931 및 0.980으로 건강한 대조군과 위암 환자 사이에 강한 차이를 나타냈다.

Description

중간-상하향 분석법으로 탐색한 표적 당단백질 유래 위암 바이오마커{Gastric Cancer Biomarkers Derived from Target Glycoproteins Discovered by Middle-up-down Analysis}
본 발명은 중간-상하향 분석법으로 탐색한 위암 바이오마커에 관한 것으로서, 좀 더 자세히는 당쇄화 자리를 가진 위암 연관 당단백질을 표적으로 하여 당펩타이드 단계의 질량분석 후 중간-상하향 접근법으로 탐색한 위암 바이오마커에 관한 것이다.
위암은 가장 빈번하게 발생하는 암 중 하나이며 한국과 아시아에서 암 사망의 주요 원인이다(1). 현재 위암의 원인은 보고된 바에 따르면 유전적 요인, 식이 습관, 흡연, 알코올 소비 및 헬리코박터 파일로리 감염이다(2). 지난 수십 년 동안 조기 진단 및 개선된 치료 기술로 인해 위암의 5년 생존율이 유의하게 증가하였지만, 후기 발견의 어려움과 높은 재발률로 인해 후기 생존율은 여전히 10% 미만이다(3-5).
위암 진단에는 혈청 단백질 마커가 이용되어 왔다. 고전적으로, CEA (carcino-embryonic antigen), CA19-9 (carbohydrate antigen 19-9), CA72-4 (carbohydrate antigen 72-4) 및 CA125 (carbohydrate antigen 125)가 위암 스크리닝에 이용되어 왔다(6). 그러나, ELISA 시험에 의한 현재의 혈청-기반 단백질 마커는 위암-특이적이지 않으며, 또한 낮은 특이성 및 감도를 갖는다. 따라서 많은 연구자들이 위암 진단을 위한 새로운 유형의 바이오마커를 발견하기 위해 광범위하게 노력하고 있다.
당쇄화(glycosylation)는 가장 일반적인 번역 후 변형이며 포유동물의 모든 단백질 중 50%가 당쇄화된 것으로 추정된다. 당쇄화의 산물인 글라이코컨쥬게이트는 200개 이상의 당쇄전이효소에 의해 합성되고 단백질 안정성, 세포 성장 및 증식, 세포-세포 상호 작용, 염증 및 종양 전이와 같은 다양한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 한다(7, 8). 혈액 내 당쇄는 당단백질 형태로 세포에서 분비되며, 이들 당쇄는 건강 상태 및 다양한 질병에 따라 달라진다(9). 특히, 비정상적인 당쇄화는 암에서 주로 관찰되며 암의 널리 알려진 특징이다(10). 따라서, 전체 혈청 기반 당쇄 프로파일링은 비침습적 바이오마커 연구에서 많이 개발되고 진행되고 있다. 많은 잠재적인 암 바이오마커가 혈청 당쇄 프로파일링을 통해 밝혀졌지만, 최근에 좀 더 우수한 감도 및 특이성을 나타내는 암 진단을 위한 임상 분야에서 표적화된 당단백질 접근법에 관심이 모아지고 있다(11-13, 14-17).
합토글로빈 (Hp)은 주요 혈청 성분 중 하나이며 면역 조절 특성을 나타내는 양성 급성기 당단백질이다. 이 당단백질은 총 혈액 단백질의 0.4 ~ 2.6%를 차지하며 혈장 내 유리 헤모글로빈에 결합한다(18). 합토글로빈은 이황화결합을 갖는 2개의 α-/β-서브유닛으로 구성되며, β-서브유닛만이 Asn 184, 207, 211 및 241에서 4개의 N-당쇄화 부위를 함유한다(19). 간암, 위암, 전립선암, 난소암 및 췌장암과 같은 다양한 암에서 이 급성기 단백질의 당쇄화 변화가 많은 연구에서 보고되었다(20-25).
본 발명자들은 종래 연구에서 위암 바이오마커 연구를 위해 합토글로빈을 표적으로 하고 LC/MS를 사용하는 세 가지 다른 유형의 접근법을 수행했다.
첫 번째, 유리된 당쇄 분석은 각 당쇄의 상세한 구성 정보를 제공하며, 이 정보를 통해 위암 환자에서 어떤 당쇄가 변했는지 분석하여 질병 진단에 이용할 수 있다(22). 그러나, 유리 당쇄 분석은 효소처리 및 당쇄 정제, 농축과정 등 다단계 실험과정으로 인해 전처리에 많은 시간이 소요된다.
다음으로, 온전한 합토글로빈의 전분자량 측정을 통한 당사슬 모니터링에 의한 암진단마커 분석방법 개발을 수행하였다. 온전한 당단백질 분석은 당쇄 유리과정 및 농축과정이 필요하지 않기 때문에 시료 제조시 유리하며 당쇄 분리에 따른 당쇄의 손실이 없이 거시적인 관점에서 당쇄 모니터링을 수행할 수 있으며, 당단백질에 대한 직관적인 정보를 산출하고 민감도와 특이도가 높은 질병 당쇄 마커를 간단하고 빠르고 경제적으로 탐지 가능하여 질병진단에 적용할 수 있다(26). 그러나, 질량분석 결과는 표적 당단백질의 다수의 당쇄화 부위 및 다양한 당쇄의 이질성으로 인해 대용량 시료에서 분석의 재현성을 확보하기가 어렵다.
셋째, 고감도 위암 바이오마커 발견을 통한 진단법 개발을 위해 당펩타이드를 이용하여 합토글로빈에 대해 부위-특이적 분석을 수행하였다. 비특이적 단백질 분해효소를 통한 표적 당단백질의 당펩타이드 분석은 아마도 부위-특이적 당쇄화 연구 및 당쇄 바이오마커 발견에 가장 좋은 방법일 것이다. 실제 당쇄화 부위 및 당쇄 이질성(heterogeneity) 정보는 당펩타이드 분석을 통해 동시에 확인할 수 있다. 또한, 부위-특이적 당쇄화 정보는 고감도 및 고특이적 질병 바이오마커의 발견을 용이하게 해준다(27). 그러나, 일반적으로 프로네이즈 E와 같은 비특이적 단백질 분해효소로 수행되는 당단백질의 부위-특이적 분석은 시료 전처리가 복잡하며 예측할 수 없는 다양한 펩타이드 서열이 생성되기 때문에 데이터 해석이 가장 어렵고 많은 시간이 필요하여 질병진단에 적용하는 것에 한계가 있다.
10-1530210 "Ｎ-당쇄화된 당펩타이드를 이용한 위암 진단용 마커 조성물" 10-1484969 "Ｎ-당쇄화된 당펩타이드를 이용한 암 진단방법" 10-1452730 "신규한 위암 진단방법" 10-1825647 "당단백질의 전분자량 측정을 통한 당사슬 모니터링에 의한 암 진단마커 분석방법"
Jung KW et al., Cancer Res Treat. 2019;51(2):431-437 Bray F et al., CA Cancer J Clin. 2018;68(6):394-424 Wagner AD et al., Cochrane Database Syst Rev. 2010(3):CD004064 Shin CH et al., Chin J Cancer Res. 2016;28(5):503-510 Yang D et al., J Gastrointest Oncol. 2011;2(2):77-84 Matsuoka T et al., World J Gastroenterol. 2018;24(26):2818-2832 Hart GW et al., Cell. 2010;143(5):672-676 Moremen KW et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 2012;13(7):448-462 An HJ et al., Curr Opin Chem Biol. 2009;13(5-6):601-607 Pinho SS, Reis CA. Nat Rev Cancer. 2015;15(9):540-555 Ozcan S et al., Cancer Prev Res (Phila). 2014;7(2):226-235 Hua S et al., J Chromatogr A. 2013;1279:58-67 Hua S et al., J Proteome Res. 2014;13(2):961-968 Kim EH et al., Int J Proteomics. 2011;2011:601937 Zhang Y et al., Clin Proteomics. 2014;11(1):18 Clark D, Mao L. Dis Markers. 2012;33(1):1-10 Yuan W et al., J Proteome Res. 2018;17(8):2755-2766 Schaer DJ et al., Front Physiol. 2014;5:415 Langlois MR, Delanghe JR. Clin Chem. 1996;42(10):1589-1600 Takahashi S et al., Glycoconj J. 2016;33(3):471-482 Zhu J et al., J Proteome Res. 2019;18(1):359-371 Lee SH et al., Mol Biosyst. 2016;12(12):3611-3621 Mandato VD et al., Anticancer Res. 2012;32(10):4353-4358 Fujita K et al., Prostate. 2014;74(10):1052-1058 Morishita K et al., Clin Chim Acta. 2018;487:84-89 Kim JH et al., Oncotarget. 2017;8(7):11094-11104 Lee J et al., Anal Bioanal Chem. 2018;410(6):1617-1629 Hakomori SI et al., Glycoconj J. 2012;29(8-9):565-566 Zhang S et al., Glycobiology. 2016;26(7):684-692 Matsumoto K et al., Cancer Sci. 2008;99(8):1611-1617 Bones J et al., J Proteome Res. 2011;10(3):1246-1265 Bones J et al., Anal Chem. 2010;82(24):10208-10215 Gomar JJ et al., Arch Gen Psychiatry. 2011;68(9):961-969 Laxman B et al., Cancer Res. 2008;68(3):645-649 Mamtani MR et al., BMC Bioinformatics. 2006;7:442
본 발명은 대용량 시료에 대하여 빠르고 정확한 위암 가능성 분석이 가능한, 좀 더 민감하고 특이적인 위암 바이오마커를 제공하려는 것을 목적으로 한다.
우리는 이미 합토글로빈의 비정상적인 당쇄화가 위암의 특징이라는 것을 밝혔다. 배경 기술에 기재한 이전의 세 가지 접근법은 각각 특징적인 장점으로 인하여 연구 단계의 표적 단백질의 당쇄화 분석에는 유용하지만 실험과정과 데이터 해석이 복잡하여 대용량 임상 진단에는 적합하지 않거나, 대용량 시료에 효율적인 방법이라도 재현성 확보의 어려움이 존재하는 등 실제 임상 진단 단계에서 활용하기에는 부족한 부분이 존재한다. 이 한계를 극복하기 위해, 우리는 혈청 합토글로빈 표적에 대한 중간-상하향 글라이코프로테오믹스(middle-up-down glycoproteomics) 방법을 발명하고 임상 시료를 분석하여 위암 바이오마커를 발견했다. 본 발명의 중간-상하향 글라이코프로테오믹스 방법을 간단히 설명하면, 먼저 면역 친화성 크로마토그래피를 사용하여 혈청 시료로부터 표적 당단백질로서 합토글로빈을 정제하고 트립신으로 절단하였다. 이와 같은 시료 제조공정 후, 시료 농축, 정제 및 건조 공정 없이 합토글로빈 시료를 직접 분석기기에 주입하여 시료 전처리에 소요되는 시간과 노동력을 최소화하였다. 트립신 처리한 Hp 당펩타이드는 다이페닐 컬럼이 있는 UHPLC 시스템에 의해 분리되었고 고해상도 Q-TOF MS에 의해 추가로 분석되었다. Hp 당펩타이드 데이터의 빠른 해석을 위해, 데이터 처리 전에 Hp의 N-당쇄 프로파일링과 당펩타이드 부분의 서열을 결합하여 인 실리코(in- silico) Hp 당펩타이드 라이브러리를 구축했다. 본 발명자들은 또한 이 플랫폼을 대형 임상 시료 세트(건강한 대조군 47명, 위암 환자 43명)에 적용했고 높은 AUC를 가진 잠재적 위암 바이오마커를 발견했다. Hp는 하나의 당쇄화 부위를 갖는 2개의 펩타이드 및 2개의 당쇄화 부위를 갖는 하나의 펩타이드와 같이 총 세 개의 당펩타이드로 분해되었다. Hp 당펩타이드는 N-당쇄 및 트립신 처리된 펩타이드의 이론적인 질량으로 구성된 인-실리코 Hp 당펩타이드 라이브러리를 통해 성공적으로 확인되었으며, 당펩타이드의 강도에 근거하여 총 33개의 잠재적 바이오마커를 찾았다. 또한, 잠재적 당펩타이드 바이오마커를 기반으로 한 결합 바이오마커의 ROC(Receiver Operation Characteristic) 곡선은 각각 0.974, 0.931, 0.980의 AUC(Area Under the Curve)로 계산되어 건강한 대조군과 위암 환자 사이의 차이가 두드러졌다.
본 발명의 다중 당쇄화 자리를 가진 단백질을 표적으로 하는 중간-상하향 접근법의 특징은 단순한 시료 준비와 탠덤 MS 분석은 필요하지 않은 손쉬운 데이터 처리가 가능하고, 트립신 처리 및 인-실리코 라이브러리로 인해 쉽고 빠른 데이터 해석 또한 가능하다. 또한, 부위 특이적 정보를 통해 복수의 잠재적 바이오마커를 도출할 수 있으며, 다중 바이오마커에 의해 생성된 결합 바이오마커는 높은 AUC를 기대할 수 있다. 따라서, 본 발명의 중간-상하향 당단백질 프로파일링은 빠르고 대량 처리 가능한 임상 애플리케이션으로 바이오마커 발견을 위한 강력한 플랫폼이 될 수 있다.
본 발명은
1) MVSHHN 184LTTGATLINEQWLLTTAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 184 당쇄화 자리에 (Hex)4(HexNAc)3(NeuAc)1이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 4226.930인 당펩타이드,
2) MVSHHN 184LTTGATLINEQWLLTTAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 184 당쇄화 자리에 (Hex)4(HexNAc)4(NeuAc)1이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 4430.009인 당펩타이드,
3) MVSHHN 184LTTGATLINEQWLLTTAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 184 당쇄화 자리에 (Hex)5(HexNAc)4(Fuc)1(NeuAc)1이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 4738.120인 당펩타이드,
4) MVSHHN 184LTTGATLINEQWLLTTAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 184 당쇄화 자리에 (Hex)6(HexNAc)4(NeuAc)1이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 4754.115인 당펩타이드,
5) MVSHHN 184LTTGATLINEQWLLTTAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 184 당쇄화 자리에 (Hex)5(HexNAc)4(NeuAc)2가 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 4883.157인 당펩타이드,
6) MVSHHN 184LTTGATLINEQWLLTTAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 184 당쇄화 자리에 (Hex)5(HexNAc)4(Fuc)1(NeuAc)2가 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 5029.215인 당펩타이드,
7) MVSHHN 184LTTGATLINEQWLLTTAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 184 당쇄화 자리에 (Hex)6(HexNAc)5(Fuc)1(NeuAc)2가 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 5394.348인 당펩타이드,
8) MVSHHN 184LTTGATLINEQWLLTTAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 184 당쇄화 자리에 (Hex)6(HexNAc)5(Fuc)1(NeuAc)3이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 5685.443인 당펩타이드, 및
9) MVSHHN 184LTTGATLINEQWLLTTAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 184 당쇄화 자리에 당쇄가 결합된 형태의 모든 당펩타이드의 총합,
10) NLFLN 207HSEN 211ATAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 207 및 N 211 당쇄화 자리 중 하나 이상에 (Hex)4, (HexNAc)3, (NeuAc)1이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값이 3006.271인 당펩타이드,
11) NLFLN 207HSEN 211ATAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 207 및 N 211 당쇄화 자리 중 하나 이상에 (Hex)5, (HexNAc)4, (NeuAc)1이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값이 3371.403인 당펩타이드,
12) NLFLN 207HSEN 211ATAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 207 및 N 211 당쇄화 자리 중 하나 이상에 (Hex)9, (HexNAc)7, (NeuAc)3이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값이 5211.044인 당펩타이드,
13) NLFLN 207HSEN 211ATAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 207 및 N 211 당쇄화 자리 중 하나 이상에 (Hex)10, (HexNAc)8, (Fuc)1, (NeuAc)3이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 5722.234인 당펩타이드,
14) NLFLN 207HSEN 211ATAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 207 및 N 211 당쇄화 자리 중 하나 이상에 (Hex)10, (HexNAc)8, (NeuAc)4가 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 5867.271인 당펩타이드,
15) NLFLN 207HSEN 211ATAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 207 및 N 211 당쇄화 자리 중 하나 이상에 (Hex)10, (HexNAc)8, (Fuc)1, (NeuAc)4가 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 6013.329인 당펩타이드,
16) NLFLN 207HSEN 211ATAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 207 및 N 211 당쇄화 자리 중 하나 이상에 (Hex)11, (HexNAc)9, (Fuc)1, (NeuAc)4가 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 6378.461인 당펩타이드,
17) NLFLN 207HSEN 211ATAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 207 및 N 211 당쇄화 자리 중 하나 이상에 (Hex)11, (HexNAc)9, (Fuc)1, (NeuAc)5가 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 6669.557인 당펩타이드,
18) NLFLN 207HSEN 211ATAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 207 및 N 211 당쇄화 자리 중 하나 이상에 (Hex)12, (HexNAc)10, (Fuc)1, (NeuAc)4가 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 6743.593인 당펩타이드,
19) NLFLN 207HSEN 211ATAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 207 및 N 211 당쇄화 자리 중 하나 이상에 (Hex)12, (HexNAc)10, (Fuc)1, (NeuAc)5가 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 7034.689인 당펩타이드,
20) NLFLN 207HSEN 211ATAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 207 및 N 211 당쇄화 자리 중 하나 이상에 (Hex)12, (HexNAc)10, (Fuc)1, (NeuAc)6이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 7325.784인 당펩타이드,
21) NLFLN 207HSEN 211ATAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 207 및 N 211 당쇄화 자리에 당쇄가 결합된 형태의 모든 당펩타이드의 총합,
22) VVLHPN241YSQVDIGLIK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N241 당쇄화 자리에 (Hex)4(HexNAc)3이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 3051.453인 당펩타이드,
23) VVLHPN241YSQVDIGLIK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N241 당쇄화 자리에 (Hex)4(HexNAc)3(NeuAc)1이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 3342.549인 당펩타이드,
24) VVLHPN241YSQVDIGLIK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N241 당쇄화 자리에 (Hex)4(HexNAc)4(NeuAc)1이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 3545.628인 당펩타이드,
25) VVLHPN241YSQVDIGLIK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N241 당쇄화 자리에 (Hex)5(HexNAc)4(NeuAc)1이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 3707.681인 당펩타이드,
26) VVLHPN241YSQVDIGLIK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N241 당쇄화 자리에 (Hex)6(HexNAc)4(NeuAc)1이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 3869.734인 당펩타이드,
27) VVLHPN241YSQVDIGLIK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N241 당쇄화 자리에 (Hex)5(HexNAc)4(NeuAc)2가 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 3998.776인 당펩타이드,
28) VVLHPN241YSQVDIGLIK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N241 당쇄화 자리에 (Hex)5(HexNAc)4(Fuc)1(NeuAc)2가 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 4144.834인 당펩타이드,
29) VVLHPN241YSQVDIGLIK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N241 당쇄화 자리에 (Hex)6(HexNAc)4(NeuAc)2가 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 4160.829인 당펩타이드,
30) VVLHPN241YSQVDIGLIK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N241 당쇄화 자리에 (Hex)6(HexNAc)5(NeuAc)2가 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 4363.909인 당펩타이드,
31) VVLHPN241YSQVDIGLIK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N241 당쇄화 자리에 (Hex)6(HexNAc)5(NeuAc)3이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 4655.004인 당펩타이드,
32) VVLHPN241YSQVDIGLIK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N241 당쇄화 자리에 (Hex)6(HexNAc)5(Fuc)1(NeuAc)3이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 4801.062인 당펩타이드,
33) VVLHPN241YSQVDIGLIK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N241 당쇄화 자리에 당쇄가 결합된 형태의 모든 당펩타이드의 총합; 중 하나 이상이 선택된 위암 바이오마커에 관한 것이다.
또한, 본 발명은
(가) 상기 위암 바이오마커 1) 내지 9) 중 둘 이상의 조합;
(나) 상기 위암 바이오마커 10) 내지 21) 중 둘 이상의 조합; 및
(다) 상기 위암 바이오마커 22) 내지 33) 중 둘 이상의 조합; 중 하나 이상이 선택된 위암 바이오마커에 관한 것이다.
또한, 본 발명은
상기 (가), (나) 및 (다) 중 하나 이상을 선택하여 다변량 로지스틱 회귀 분석하고 이 결과값을 정상인 대조군 평균값과 비교하여 유의한 차이가 있는 경우 위암에 걸렸거나 위암에 걸릴 확률이 높은 것으로 판단하는 위암 바이오마커에 관한 것이다.
또한, 본 발명은
상기 1) 내지 33)의 위암 바이오마커 중 동일한 펩타이드를 포함하는
a) 1) 내지 9)의 바이오마커 전체;
b) 10) 내지 21)의 바이오마커 전체; 및
c) 22) 내지 33)의 바이오마커 전체; 중 하나 이상의 군을 다변량 로지스틱 회귀 분석하고 이 결과값을 정상인 대조군 평균값과 비교하여 유의한 차이가 있는 경우 위암에 걸렸거나 위암에 걸릴 확률이 높은 것으로 판단하는 위암 바이오마커에 관한 것이다.
또한, 본 발명은
a) 피검체 혈청에서 합토글로빈을 분리, 정제하는 단계;
b) 정제된 합토글로빈을 변성 및 알킬화하는 단계;
c) 변성 및 알킬화된 합토글로빈에 트립신을 처리하여 당펩타이드를 제조하는 단계;
d) 별도의 당펩타이드 분리 및 정제 단계 없이 당펩타이드를 UHPLC 질량분석기에 주입하여 질량분석하는 단계; 및
e) 당펩타이드 질량분석 결과를 정상인 대조군 혈청 내 합토글로빈에 대해 상기 a) 내지 d) 단계를 거쳐 얻은 당펩타이드 질량분석 결과와 비교하되, 상기 청구항 1에 기재된 하나 이상의 위암 바이오마커에 대한 질량분석 결과를 비교하여 유의한 차이가 있는 경우 피검체가 위암에 걸렸을 가능성 또는 위암에 걸릴 가능성을 판정하는 단계;를 포함하는, 위암 진단을 위한 기초 정보를 제공하기 위한 글라이코프로테옴 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 e) 단계가
(가) 청구항 1의 상기 마커 1) 내지 9) 중 둘 이상의 조합;
(나) 청구항 1의 상기 마커 10) 내지 21) 중 둘 이상의 조합; 및
(다) 청구항 1의 상기 마커 22) 내지 33) 중 둘 이상의 조합;에 대하여 질량분석 결과를 정상인 대조군과 비교하여 유의한 차이가 있는 경우 피검체가 위암에 걸렸을 가능성 또는 위암에 걸릴 가능성을 판정하는 단계:를 포함하는 위암 진단을 위한 기초 정보를 제공하기 위한 글라이코프로테옴 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 e) 단계가
(가) 청구항 1의 상기 마커 1) 내지 9) 전체의 조합;
(나) 청구항 1의 상기 마커 10) 내지 21) 전체의 조합; 및
(다) 청구항 1의 상기 마커 22) 내지 33) 전체의 조합; 중 하나 이상에 대하여 질량분석 결과를 정상인 대조군과 비교하여 유의한 차이가 있는 경우 피검체가 위암에 걸렸을 가능성 또는 위암에 걸릴 가능성을 판정하는 단계:를 포함하는 위암 진단을 위한 기초 정보를 제공하기 위한 글라이코프로테옴 분석방법에 관한 것이다.
본 발명의 위암 바이오마커는 손쉬운 방법으로 짧은 시간 내에 고민감도, 고특이적 분석이 가능하여 대용량 시료의 분석에 유용하다.
도 1은 혈청 합토글로빈의 중간-상하향 글라이코프로테옴 접근법을 통한 위암 바이오마커 탐색의 전체적인 흐름도이다.
도 2는 10개의 시판 혈청 시료에서 추출한 합토글로빈 유래 3개의 당펩타이드의 피어슨 상관 계수(R)이다. (a) GP1, (b) GP2, (c) GP3.
도 3은 트립신 처리한 합토글로빈의 인-실리코 당펩타이드 라이브러리 생성에 대한 개요도이다.
도 4는 합토글로빈 당펩타이드의 대표 크로마토그램 및 MS 스펙트럼이다. (a) Hex5HexNAc4NeuAc2가 결합된 세 개의 당펩타이드의 총 화합물 크로마토그램, (b) GP1: MVSHHN184LTTGATLINEQWLLTTAK, (c) GP2: NLFLN207HSEN211ATAK 및 (d) GP3: VVLHPN241YSQVDIGLIK의 추출된 화합물 크로마토그램(왼쪽) 및 디컨벌루션된 스펙트럼.
도 5는 건강한 대조군과 위암 환자 시료 사이의 합토글로빈 N-당쇄화를 비교한 그래프이다.
도 6a, 6b, 6c는 합토글로빈 당펩타이드의 개별 및 조합 ROC 곡선이다. (a) GP1, (b) GP2, (c) GP3.
도 3, 도 4a, 4d, 4d, 도 6a, 6c의 당은 도형화하여 나타내었다. 원은 헥소스, 네모는 N-아세틸헥소사민, 삼각형은 퓨코스, 마름모는 N-아세틸뉴라민산을 나타내며, 헥소스 중 녹색 원은 만노스, 노란색 원은 갈락토스, 청색 네모는 N-아세틸글루코사민을 나타낸다. 빨간색 삼각형은 퓨코스 (Fuc), 보라색 마름모는 N-아세틸뉴라민산 (NeuAc)을 나타낸다.
아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
재료와 시약
시판 사람 혈청, 중탄산 암모늄(NH4HCO3) 및 아이오도아세트아마이드(IAA)는 Sigma-aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 서열분석 등급 변형 트립신과 DTT(dithiothreitol)는 Promega(Madison, WI, USA)에서 구입하였다. 항 인간 합토글로빈 항체는 Dako(Carpinteria, CA, USA)에서 구입하였다. LC/MS 분석에 사용된 다른 모든 용매는 Sigma-aldrich에서 구입하였고, 이 용매들은 분석등급 또는 그 이상이었다.
위암 환자 혈청 시료 및 건강한 정상인 혈청 시료
혈청 시료에 대한 임상 정보는 표 1에 나타내었다. 총 90개의 혈청 시료가 사용되었고, 47명의 건강한 대조군과 43명의 위암 환자(단계 IV, 선암 유형)로 구성되어 있다. 연구 설계 및 프로토콜은 대한민국 서울 삼성서울병원 기관심사위원회의 심의를 거쳐 승인되었다(IRB# SMC2015-07-146-001). 환자에 대한 위 내시경 및 생검에 근거하여 암 진단 및 단계 결정을 수행하였다. 건강한 대조군을 포함한 모든 참여 대상자는 한국인이었으며 혈청 시료 채취에 대하여 사전에 동의하였다. 시료는 -80℃에서 보관하였다.
혈청에서 합토글로빈 정제
종래 문헌에 기재된 방법대로 항-합토글로빈 면역친화 컬럼을 이용하여 혈청의 합토글로빈을 정제하였다(22). 간단히 설명하면, 각 혈청 시료 450 ㎕를 4.5 ㎖의 PBS(10 mM 인산 완충액, 2.7 mM 염화칼륨, 137 mM 염화나트륨, pH 7.4)로 희석한 다음 항-합토글로빈 면역친화 컬럼에 로딩하였다. 결합 반응 후, 결합하지 않은 것은 30 mL PBS로 씻어내고, Hp는 용출 완충액(0.1 M 글라이신, 0.5 M NaCl, pH 2.8)을 가하여 용출하였으며, 용출액은 중화 완충액(1.0 M Tris-HCl, pH 9.0)이 든 튜브에 넣었다. 용출액에서 계면활성제를 제거하기 위해 원심분리기 필터(MWCO 10,000, Amicon Ultra, Millipore; Billerica, MA, USA)를 사용하였고, 정제된 Hp는 Quanti-iT 어세이 킷트(Invitrogen; Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 정량하였다. Hp의 순도를 확인하기 위하여 용출액을 12.5% SDS-PAGE에 로딩하고 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였다. 정제된 각 시료는 -80℃에 보관하였다.
효소 처리
정제된 혈청 Hp (20 ㎍)을 완충액(50 mM NH4HCO3 및 10 mM DTT 함유)에 용해하였다. 완충액에 용해된 Hp를 95℃의 물에 10분간 두어 이황화결합을 감소시키고 Hp의 α-/β-서브유닛을 분리하였으며, 이후 50 mM IAA로 알킬화하여 이황화결합의 재결합을 억제하였다. 마지막으로, 트립신을 처리하고 혼합물은 37℃ 수조에서 16시간 동안 배양하였다.
합토글로빈 당펩타이드에 대한 LC-MS 분석
트립신 처리 후 6.0 ㎕의 Hp 펩타이드(2 ㎍ 단백질에 해당함)를 자동 시료주입장치로 컬럼 서모스탯, 자동 시료주입장치 및 2개 용매 펌프를 포함한 1290 infinity II UHPLC 시스템(Agilent Technologies, San Jose, CA)에 연결된 6550 iFunnel Q-TOF로 구성된 LC-MS 시스템에 직접 주입하였다. 먼저, 시료를 2.1 × 12.5 mm의 내경이 작은 가드 컬럼에서 탈염하고, 분리를 위해 2.1 × 100 mm의 빠른 해상도 고선명도 다이페닐 컬럼(Agilent Technologies)으로 전달했다. Hp 펩티드에 대한 빠른 용출 구배는 (A) 0.3% 포름산이 용해된 초순수 및 (B) 0.3% 포름산이 용해된 아세토니트릴의 이동상을 사용하여 200 Ω/분으로 적용되었으며, 27분 코스 전반에 걸쳐 5% 내지 95%로 증가하였다. 컬럼을 95% 용매 B로 10분 동안 씻은 후, 다음 시료를 분석하기 전에 3분 내에 재평형화하였다. 컬럼 온도는 분석 동안 30℃로 유지하였다. LC 분리 후, Hp 펩타이드를 초당 2 스펙트럼의 획득 속도로 m/z 500 내지 3,200의 질량 범위에 걸쳐 양이온 모드로 질량 분석기에 의해 이온화하였다.
데이터 처리, 당펩타이드 확인 및 통계 분석
모든 미가공 LC/MS 데이터는 MassHunter Qualitative Analysis 소프트웨어(version B.07.00 SP1, Agilent Technologies)에 포함된 분자 특성 추출 알고리즘으로 처리되었다. MS 피크를 신호 대 잡음비 5.0으로 여과하고 10ppm 질량 내성을 갖는 인-실리코 Hp 당펩타이드 라이브러리의 이론상 정확한 질량에 의해 디컨벌루션된 질량으로부터 당펩타이드 화합물을 밝혔다. 인-실리코 당펩타이드 라이브러리는 트립신 처리 펩타이드의 이론적 질량과 Hp의 이전 N-당쇄화 연구의 조합에 의해 구축된다(22). 위암 환자와 건강한 대조군 사이의 통계적 차이를 확인하기 위해 Microsoft Excel 2016 (Microsoft, Seattle, WA, USA)에 의한 개별 t-검정 분석을 사용하였고 모든 p-값을 양측 분석으로 적용하였다. 각각의 잠재적인 당펩타이드 바이오마커의 ROC(Receiver operation characteristic) 곡선 및 결합된 바이오마커에 대한 로지스틱 회귀 분석은 IBM SPSS Statistics(version 24, IBM, Armonk, NY, USA)에 의해 수행되었다. 계층적 클러스터링 탐색기(버전 3.5)를 사용하여 재현성을 확인했다.
결과 1: 임상진단 플랫폼을 위한 분석 전략
이 연구에서 우리는 빠른 임상 스크리닝을 위하여 표적 혈청 Hp의 부위별 당쇄화 프로파일링에 대한 중간-상하향 글라이코프로테옴 분석 플랫폼을 구축하였고 고감도, 고특이성 위암 바이오마커를 발견하기 위해 대량 임상 시료에 이를 적용하였다. 전반적인 흐름도는 도 1에 나타내었다. (i) 혈청 Hp를 면역친화 크로마토그래피로 농축 및 정제하였다. (ii) 정제된 Hp 시료는 트립신 처리하여 단백질을 절단하였다. (iii) 트립신 처리한 Hp 펩타이드는 당펩타이드 농축 및 정제 과정 없이 UHPLC/Q-TOF MS 시스템에 직접 주입하였다. (iv) 인-실리코 Hp 당펩타이드 라이브러리를 이용하여 당펩타이드를 확인하였다. (v) 상대적 정량 프로파일링을 통해 Hp 당펩타이드 바이오마커를 발견하였다. 시료는 트립신으로 처리하였는데, 트립신은 가장 일반적으로 사용되는 엔도펩티데이즈로서 아미노산 라이신(K) 및 아르기닌(R)의 카복시 측을 절단한다. 트립신 처리한 Hp는 하나의 당쇄화 부위를 갖는 2개의 펩타이드 및 2개의 당쇄화 부위를 갖는 1개의 펩타이드로 분해되어 다음과 같은 총 3개의 트립신 당펩타이드가 생성되었다: MVSHHN 184LTTGATLINEQWLLTTAK (GP1), NLFLN 207HSEN 211ATAK (GP2) 및 VVLHPN 241YSQVDIGLIK (GP3). 본 발명의 방법은 트립신으로 처리된 표적 당단백질의 정의된 펩타이드 서열로 인해, 데이터 처리 및 해석이 단순화될 수 있으며, 이는 임상 적용시 큰 강점 중 하나이다.
건강한 대조군(n = 47) 및 위암 환자(n = 43)로부터 유래한 혈청 Hp 시료를 항-합토글로빈 면역친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 모든 위암 환자는 IV기 및 선종 유형이었다. 판매 중인 인간 혈청으로부터 정제된 Hp 표준을 사용하여 10개의 독립적인 복제 시료를 제조하고 본 발명의 방법을 적용하여 분석의 재현성을 평가하였다. 10개의 복제 시료에서 GP1, GP2 및 GP3의 재현성 확인을 위해 계층적 클러스터링 탐색기 소프트웨어가 사용되었다. 도 2에서 볼 수 있듯이 피어슨 상관 계수(R) 값은 GP1(16쌍) 및 GP3(19쌍)의 경우 1이고, GP2(36쌍)의 경우 0.984에서 0.998로, 이 플랫폼의 재현성이 우수함을 나타낸다.
결과 2: 부위 특이적 당펩타이드 탐지
트립신 처리한 Hp의 세 가지 당펩타이드는 인-실리코 Hp 당펩타이드 라이브러리를 갖는 MassHunter Qualitative Analysis 프로그램에서 분자 특성 추출 알고리즘에 의해 확인되었다. 인-실리코 Hp 당펩타이드 라이브러리는 Hp N-당쇄 프로파일링 및 트립신 처리한 펩타이드의 이론적 질량값 조합에 의해 구축되었다(도 3). N-당쇄 조성은 이전 연구에서 확인된 상위 41개의 N-당쇄를 사용하였으며, 이는 총 Hp N-당쇄 양의 99%를 차지한다. Hp의 서열은 UniProt 인간 단백질 데이터베이스 (P00738)를 참조하였고, Hp 펩타이드의 이론적 질량은 ExPASy의 PeptideMass 툴을 사용하여 계산되었다. 다른 절단에 의해 생성된 Hp에는 여러 가지 아이소폼이 있지만, 이 인-실리코 라이브러리는 표준 모티프를 사용하여 구성되었다. 41개의 N-당쇄 조성에 기반하여, 하나씩의 당쇄화 부위를 갖는 GP1(MVSHHN184LTTGATLINEQWLLTTAK)과 GP3(VVLHPN241YSQVDIGLIK)은 41개의 가능한 당쇄형태를 가진다. N297과 N211에 두 개의 당쇄화 부위를 가지는 GP2 (NLFLN207HSEN211ATAK)는 따라서 총 861개의 완전히 당쇄화된 조성이 가능하다(41C2). 그러나, 두 개의 당쇄화 부위에 존재하는 N-당쇄의 단당들의 합이 같다면(즉, Hex11HexNAc9Fuc1NeuAc5는 Hex6HexNAc5Fuc1NeuAc3 + Hex5HexNAc4NeuAc2 및 Hex5HexNAc4Fuc1NeuAc2 + Hex6HexNAc5NeuAc3)의 조합이 될 수 있다), 라이브러리에서 같은 조성으로 인식되는 동량의 질량값을 가진다. 따라서, 이렇게 겹치는 경우는 제외하였다. 당쇄화는 2개의 당쇄화 부위 중 하나에서만 발생할 수도 있으므로, 41개의 단일당쇄화된 조성물도 첨가되었다. 결과적으로 GP2는 라이브러리에서 총 416개의 가능한 당쇄화 형태를 가진다.
도 4a는 Hp 상에서 가장 풍부한 N-당쇄인 Hex5HexNAc4NeuAc2가 결합된 Hp의 대표적인 3개의 당펩타이드를 보여준다. GP2는 10분 내지 11분 사이에 용출되었고, GP3는 약 16분에 용출되었고,이어서 GP1은 17 내지 18분 사이에 용출되었다. 트립신 처리하여 생성된 Hp 펩타이드를 다이페닐 컬럼으로 분리하고 당쇄보다는 펩타이드의 특성에 따라 용출하였다. 따라서, 당쇄화가 상이하더라도, 동일한 서열을 갖는 펩타이드는 동일하거나 인접한 체류 시간에 동시 용출된다(도 4b, c, d의 왼쪽). 당펩타이드가 용출된 체류 시간의 MS 스펙트럼을 디컨벌루션하면 당펩타이드의 분자량을 확인할 수 있고, 이것은 하나 또는 두 개의 단당류 차이와 관련되는 것을 볼 수 있다(도 4b, c, d의 오른쪽). 크로마토그래피 및 MS 스펙트럼 둘 다에서, 대부분의 당펩타이드는 시알릴화 N-당쇄이고, Hex5HexNAc4NeuAc2는 가장 풍부한 당쇄형태였다. 당펩타이드 식별을 위한 인-실리코 라이브러리는 하나의 통합된 형태가 아닌 세 개의 개별 파일로 생성되었다. 따라서, 하나의 시료 데이터는 당펩타이드 식별을 위해 세 번의 데이터 처리를 필요로 하지만, 단일 라이브러리를 사용하여 모든 당펩타이드를 한 번에 분석하는 것보다 효과적이다. 전체 LC/MS 데이터에서 당펩타이드를 식별하는 데는 많은 시간이 걸리지만, 세 개의 당펩타이드가 용출되는 체류 시간은 고정되어 있으므로, 당펩타이드를 식별하기 위한 체류 시간을 지정할 수 있다(각각 2분 이내). 분자 특성 추출에 의해 당펩타이드 식별을 위한 체류 시간을 특정하는 것은 전체 데이터를 분석하는 것보다 시간이 현저히 적게 걸리기 때문에 대규모 임상 시료 분석에 유리하다. 또한, 세 개의 당펩타이드 라이브러리를 사용하여 전체 체류 시간 동안 당펩타이드 식별을 수행하였고, 상기 기재된 당펩타이드의 용출 시간을 제외하고는 당펩타이드가 체류 시간에서 검출되지 않았음을 확인하였다.
결과 3: 합토글로빈 당펩타이드의 당쇄화 변화
모든 참가자들에 대해 동일한 양의 Hp 시료가 제조되고 분석되었지만, 당펩타이드 조성의 수 및 총 글라이코폼의 양은 건강한 대조군과 위암 환자들 사이에서 상당히 달랐다. 평균적으로, 세 개의 당펩타이드로부터 3, 8 및 2개의 당쇄 조성이 더 확인되었고, 건강한 대조군과 비교하여 위암 환자에서 총량은 각각 30%, 26% 및 25% 증가하였다(도 5의 a와 b). Hp의 당쇄화 증가는 본 발명자들의 종전 연구인 Hp의 온전한 당단백질 분석을 이용한 위암 바이오마커 연구에서 관찰되었다(26). 또한, 간암 환자 혈청 유래 Hp의 부위-특이적 당쇄화에 대한 연구 결과, 당쇄 조성의 수가 증가한 것으로 나타났다(21). 당쇄화는 질병, 특히 암과 같은 생물학적 환경의 변화에 민감하고, 종양 진행, 증식 신호 전달, 혈관 신생 및 전이와 같은 중요한 역할을 수행한다(28). 따라서, 본 발명에서 확인된 혈청 Hp의 당쇄화 증가는 위암 환자의 중요한 특징이 될 수 있다.
Hp는 주로 헤모글로빈에 결합하지만, 이 결합은 헤모글로빈 서브유닛의 펩타이드 서열이 당쇄화 부위를 포함하지 않기 때문에 당쇄와 관련이 없다. 반면, Hp는 CD163, CD22, CCR2 및 CD11b/CD18을 포함하는 백혈구의 최소 네 개의 수용체와 결합하고, 이 리간드-수용체 상호작용은 당쇄화의 주요 기능 중 하나이다(29). 특히, 리간드-수용체 상호작용에 영향을 미치는 것으로 보고된 푸코실화 및 시알릴화의 경우, Hp의 모든 확인된 푸코실화 당펩타이드는 시알릴화도 되었으며, 위암 환자에서 이들의 표준화된 상대적 양(relative abundance)이 증가하였다(도 5의 c). 위암 환자의 GP1에서 푸코실화 및 시알릴화는 2.2배, GP2에서는 1.7배, GP3에서는 3.0배였고, t-검정 또한 통계적으로 유의하였다(p < 0.00001). Hp의 푸코실화 및 시알릴화된 당쇄는 종래 연구에서 sLex (sialyl-lewis x) 또는 sLea (sialyl-lewis a) 에피토프로 확인되었고(22), 이들 에피토프는 푸코실화 및 시알릴화의 말단구조이다. 이 sLe 에피토프는 암 진행과 관련이 있는 것으로 보고되었으며(31, 32), 이러한 결과는 Hp의 푸코실화 및 시알릴화 당쇄의 현저한 증가가 위암과 관련될 수 있음을 뒷받침한다.
결과 4: 합토글로빈 당펩타이드 분석을 통한 위암 바이오마커 탐색
Hp의 당쇄화 변화에 기초하여, 본 발명자들은 각 당펩타이드에서 건강한 대조군과 위암 환자 사이의 바이오마커를 조사하였다. 건강한 대조군과 위암 환자 사이의 당펩타이드 조성의 통계적 비교를 위해, 모든 시료에서 80% 이상의 빈도를 나타내는 풍부한 조성을 사용하여 개별 t-검정을 수행하였다(47명의 건강한 대조군 및 43명의 위암 환자). GP1에서 10, GP2에서 15, GP3에서 14개의 조성에는 통계적으로 유의한 차이(p < 0.001)가 있었으며 각 당펩타이드의 총량 역시 통계적으로 뚜렷한 차이를 보였다(표 3). 바이오마커를 발견하기 위해, 두 가지 기준 즉, p-값(p <0.0001) 및 빈도(모든 시료에서 90% 초과)에 의해 선택된 현저한 차이를 갖는 조성을 사용하여 ROC 곡선 분석을 수행하였다. 각 글라이코폼의 강도와 총량(표 2)의 강도를 사용하여 세 가지 다른 당펩타이드로부터 9개(GP1, AUC 0.757 - 0.895), 12개(GP2, AUC 0.741 - 0.848) 및 12개(GP3, AUC 0.730 - 0.901)의 잠재적 바이오마커를 얻었다. 각각의 당펩타이드의 AUC는 통계적으로 유의미하며, 바이오마커를 보완하고 개선하기 위해, 잠재적 당펩타이드 바이오마커를 사용하여 다변량 로지스틱 회귀 모델을 적용하고 결합된 ROC 곡선을 계산하였다(33-35). 정확도는 GP1, GP2, GP3 순으로 90%, 89%, 91%이며, AUC는 각각 0.974, 0.931, 0.980으로 극적으로 개선된 성능을 보였다(도 6a, 6b, 6c).
특히 위암 환자에서는 모든 잠재적 바이오마커가 증가했고 대부분의 조성은 단당 단위로 서로 연관되어 있었다. 단일 단당류 단위와 관련된 Hp 당쇄 조성의 변화는 위암에서 하나의 특정 당쇄 조성만이 독립적으로 변하기보다는 당쇄 합성 자체에 영향을 미친다는 것을 입증한다. 유리된 N-당쇄와 온전한 당펩타이드 분석을 사용한 이전의 Hp 연구와 비교했을 때, 중간-상하향 접근법은 부위 특이적 정보를 통해 더 많은 수의 잠재적 고감도 바이오마커 후보들을 제공할 수 있다.
Healthy Control
( n = 47) 		Gastric Cancer
(stage IV, n = 43)
Age (years) Median (range) 55 (31 - 76) 44 (33 - 77)
Gender Male 9 25
Female 38 15
Figure 112019093725842-pat00001
Hex = Hexose; HexNAc = N-acetylhexosamine; Fuc = Fucose; NeuAc = N-acetylneuraminic acid
Figure 112019093725842-pat00002
Hex = Hexose; HexNAc = N-acetylhexosamine; Fuc = Fucose; NeuAc = N-acetylneuraminic acid

Claims (7)

  1. a) 피검체 혈청에서 합토글로빈을 분리, 정제하는 단계;
    b) 정제된 합토글로빈을 변성 및 알킬화하는 단계;
    c) 변성 및 알킬화된 합토글로빈에 트립신을 처리하여 당펩타이드를 제조하는 단계;
    d) 별도의 당펩타이드 분리 및 정제 단계 없이 당펩타이드를 UHPLC 질량분석기에 주입하여 질량분석하는 단계; 및
    e) 당펩타이드 질량분석 결과를 정상인 대조군 혈청 내 합토글로빈에 대해 상기 a) 내지 d) 단계를 거쳐 얻은 당펩타이드 질량분석 결과와 비교하되, 아래 1) 내지 33)에 기재된 하나 이상의 위암 바이오마커에 대한 질량분석 결과를 비교하는 단계;를 포함하는, 위암 진단을 위한 기초 정보를 제공하기 위한 글라이코프로테옴 분석방법.
    1) MVSHHN 184LTTGATLINEQWLLTTAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 184 당쇄화 자리에 (Hex)4(HexNAc)3(NeuAc)1이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 4226.930인 당펩타이드,
    2) MVSHHN 184LTTGATLINEQWLLTTAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 184 당쇄화 자리에 (Hex)4(HexNAc)4(NeuAc)1이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 4430.009인 당펩타이드,
    3) MVSHHN 184LTTGATLINEQWLLTTAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 184 당쇄화 자리에 (Hex)5(HexNAc)4(Fuc)1(NeuAc)1이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 4738.120인 당펩타이드,
    4) MVSHHN 184LTTGATLINEQWLLTTAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 184 당쇄화 자리에 (Hex)6(HexNAc)4(NeuAc)1이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 4754.115인 당펩타이드,
    5) MVSHHN 184LTTGATLINEQWLLTTAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 184 당쇄화 자리에 (Hex)5(HexNAc)4(NeuAc)2가 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 4883.157인 당펩타이드,
    6) MVSHHN 184LTTGATLINEQWLLTTAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 184 당쇄화 자리에 (Hex)5(HexNAc)4(Fuc)1(NeuAc)2가 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 5029.215인 당펩타이드,
    7) MVSHHN 184LTTGATLINEQWLLTTAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 184 당쇄화 자리에 (Hex)6(HexNAc)5(Fuc)1(NeuAc)2가 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 5394.348인 당펩타이드,
    8) MVSHHN 184LTTGATLINEQWLLTTAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 184 당쇄화 자리에 (Hex)6(HexNAc)5(Fuc)1(NeuAc)3이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 5685.443인 당펩타이드, 및
    9) MVSHHN 184LTTGATLINEQWLLTTAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 184 당쇄화 자리에 당쇄가 결합된 형태의 모든 당펩타이드의 총합,
    10) NLFLN 207HSEN 211ATAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 207 및 N 211 당쇄화 자리 중 하나 이상에 (Hex)4, (HexNAc)3, (NeuAc)1이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값이 3006.271인 당펩타이드,
    11) NLFLN 207HSEN 211ATAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 207 및 N 211 당쇄화 자리 중 하나 이상에 (Hex)5, (HexNAc)4, (NeuAc)1이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값이 3371.403인 당펩타이드,
    12) NLFLN 207HSEN 211ATAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 207 및 N 211 당쇄화 자리 중 하나 이상에 (Hex)9, (HexNAc)7, (NeuAc)3이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값이 5211.044인 당펩타이드,
    13) NLFLN 207HSEN 211ATAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 207 및 N 211 당쇄화 자리 중 하나 이상에 (Hex)10, (HexNAc)8, (Fuc)1, (NeuAc)3이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 5722.234인 당펩타이드,
    14) NLFLN 207HSEN 211ATAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 207 및 N 211 당쇄화 자리 중 하나 이상에 (Hex)10, (HexNAc)8, (NeuAc)4가 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 5867.271인 당펩타이드,
    15) NLFLN 207HSEN 211ATAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 207 및 N 211 당쇄화 자리 중 하나 이상에 (Hex)10, (HexNAc)8, (Fuc)1, (NeuAc)4가 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 6013.329인 당펩타이드,
    16) NLFLN 207HSEN 211ATAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 207 및 N 211 당쇄화 자리 중 하나 이상에 (Hex)11, (HexNAc)9, (Fuc)1, (NeuAc)4가 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 6378.461인 당펩타이드,
    17) NLFLN 207HSEN 211ATAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 207 및 N 211 당쇄화 자리 중 하나 이상에 (Hex)11, (HexNAc)9, (Fuc)1, (NeuAc)5가 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 6669.557인 당펩타이드,
    18) NLFLN 207HSEN 211ATAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 207 및 N 211 당쇄화 자리 중 하나 이상에 (Hex)12, (HexNAc)10, (Fuc)1, (NeuAc)4가 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 6743.593인 당펩타이드,
    19) NLFLN 207HSEN 211ATAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 207 및 N 211 당쇄화 자리 중 하나 이상에 (Hex)12, (HexNAc)10, (Fuc)1, (NeuAc)5가 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 7034.689인 당펩타이드,
    20) NLFLN 207HSEN 211ATAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 207 및 N 211 당쇄화 자리 중 하나 이상에 (Hex)12, (HexNAc)10, (Fuc)1, (NeuAc)6이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 7325.784인 당펩타이드,
    21) NLFLN 207HSEN 211ATAK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N 207 및 N 211 당쇄화 자리에 당쇄가 결합된 형태의 모든 당펩타이드의 총합,
    22) VVLHPN241YSQVDIGLIK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N241 당쇄화 자리에 (Hex)4(HexNAc)3이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 3051.453인 당펩타이드,
    23) VVLHPN241YSQVDIGLIK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N241 당쇄화 자리에 (Hex)4(HexNAc)3(NeuAc)1이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 3342.549인 당펩타이드,
    24) VVLHPN241YSQVDIGLIK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N241 당쇄화 자리에 (Hex)4(HexNAc)4(NeuAc)1이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 3545.628인 당펩타이드,
    25) VVLHPN241YSQVDIGLIK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N241 당쇄화 자리에 (Hex)5(HexNAc)4(NeuAc)1이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 3707.681인 당펩타이드,
    26) VVLHPN241YSQVDIGLIK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N241 당쇄화 자리에 (Hex)6(HexNAc)4(NeuAc)1이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 3869.734인 당펩타이드,
    27) VVLHPN241YSQVDIGLIK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N241 당쇄화 자리에 (Hex)5(HexNAc)4(NeuAc)2가 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 3998.776인 당펩타이드,
    28) VVLHPN241YSQVDIGLIK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N241 당쇄화 자리에 (Hex)5(HexNAc)4(Fuc)1(NeuAc)2가 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 4144.834인 당펩타이드,
    29) VVLHPN241YSQVDIGLIK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N241 당쇄화 자리에 (Hex)6(HexNAc)4(NeuAc)2가 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 4160.829인 당펩타이드,
    30) VVLHPN241YSQVDIGLIK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N241 당쇄화 자리에 (Hex)6(HexNAc)5(NeuAc)2가 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 4363.909인 당펩타이드,
    31) VVLHPN241YSQVDIGLIK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N241 당쇄화 자리에 (Hex)6(HexNAc)5(NeuAc)3이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 4655.004인 당펩타이드,
    32) VVLHPN241YSQVDIGLIK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N241 당쇄화 자리에 (Hex)6(HexNAc)5(Fuc)1(NeuAc)3이 결합한, 이론적 단일동위원소 질량값 4801.062인 당펩타이드,
    33) VVLHPN241YSQVDIGLIK의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N241 당쇄화 자리에 당쇄가 결합된 형태의 모든 당펩타이드의 총합; 중 하나 이상이 선택된 위암 바이오마커.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 e) 단계는 당펩타이드 질량분석 결과를 정상인 대조군 혈청 내 합토글로빈에 대해 상기 a) 내지 d) 단계를 거쳐 얻은 당펩타이드 질량분석 결과와 비교하되, 아래 (가) 내지 (다) 중 하나 이상에 대한 질량분석 결과를 비교하는 단계;를 포함하는, 위암 진단을 위한 기초 정보를 제공하기 위한 글라이코프로테옴 분석방법.
    (가) 상기 위암 바이오마커 1) 내지 9) 중 둘 이상의 조합,
    (나) 상기 위암 바이오마커 10) 내지 21) 중 둘 이상의 조합,
    (다) 상기 위암 바이오마커 22) 내지 33) 중 둘 이상의 조합.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 (가), (나) 및 (다) 중 하나 이상을 선택하여 다변량 로지스틱 회귀 분석하고 이 결과값을 정상인 대조군 평균값과 비교하는 단계;를 포함하는 위암 진단을 위한 기초 정보를 제공하기 위한 글라이코프로테옴 분석방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 1) 내지 33)의 위암 바이오마커 중 동일한 펩타이드를 포함하는
    ㄱ) 1) 내지 9)의 바이오마커 전체;
    ㄴ) 10) 내지 21)의 바이오마커 전체; 및
    ㄷ) 22) 내지 33)의 바이오마커 전체; 중 하나 이상의 군을 다변량 로지스틱 회귀 분석하고 이 결과값을 정상인 대조군 평균값과 비교하는 단계;를 포함하는 위암 진단을 위한 기초 정보를 제공하기 위한 글라이코프로테옴 분석방법.
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