KR20090036066A

KR20090036066A - 렉틴 침전법을 이용한 당단백질의 동정 방법

Info

Publication number: KR20090036066A
Application number: KR1020070123231A
Authority: KR
Inventors: 고정헌; 김용삼; 유향숙; 유종신; 오세정; 김철호; 손옥례
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2007-10-08
Filing date: 2007-11-30
Publication date: 2009-04-13
Also published as: US8119356B2; US20100255500A1; KR100953090B1; WO2009048196A1; JP2010540956A; JP5544640B2

Abstract

본 발명은 종양 발생 및 전이과정에서 당질변화를 보이는 당단백질을 검출해내는 방법으로서, 좀더 상세하게는 당단백질의 N-연결형 당쇄 중 종양의 발생과 전이에 관여한다고 알려진 특정 당쇄를 이용하여 질량분석 방법으로 당단백질을 찾아내는 방법에 관한 것이다.

당단백질, 당쇄, 렉틴

Description

렉틴 침전법을 이용한 당단백질의 동정 방법{An identification method of glycoproteins using a specific lectin precipitation}

단백질의 기능을 분석하기 위한 방법으로는 오래전부터 전기영동 방법의 일종으로 2차원 전기영동 방법이 많이 사용되어 왔으나 최근 들어 MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight)와 같은 질량분석기기의 발달과 N-말단 아미노산 서열 결정이 쉬워지면서 포스트 게놈(Post-Genome) 시대의 기능 분석 방법으로서 프로테오믹스(proteomics)가 등장하였다. 그러나 프로테오믹스는 다이내믹하게 움직이는 생체에 대하여 정지된 한 시점이 선택적으로 분석되므로 복잡한 신호 전달의 결과로 발생하는 것으로 알려진 종양에 대한 연구에는 어느 정도 한계를 지니고 있으며, 실제 단순 염색에 의해 새로운 스팟(spot)의 출현보다는 신호전달의 결과물로서 단백질 발현량의 증가나 단백질의 번역 후 변형(post- translational modification)이라는 양상으로 나타나는 것이 일반적이다.

특히 2차원 전기영동 상에서 펼쳐지는 단백질 중 신호전달과 관련되는 단백질은 대단히 소량이어서 단순 염색에 의해서는 고도화된 분석이 어려운 실정이다. 이러한 어려움을 극복하고 분석 상의 차이점을 번역 후 변형의 관점에서 광범하게 확인할 수 있는 분야가 단백질의 당질화(glycosylation)이다. 대조군과 비교할 때 일반적인 전기영동으로는 스팟(spot)의 차이를 발견할 수 없는 경우에도 당쇄의 변화를 렉틴(lectin)으로 분석하면 더 세밀하게 달라진 양상을 관찰할 수 있다.

최근 들어 이런 당쇄의 변화를 이용하는 분석을 프로테오믹스와 대비하여 "글리코믹스(glycomics)"라 하며, 이는 이미 진행되고 있는 프로테오믹스의 분석 상의 어려움을 극복한 한 단계 진전된 분석방법으로서, 번역 후 변형 중 단백질의 당질화 변화를 추적하는 것이다.

발암 및 전이의 과정에서 일어나는 세포 생물학적 변화를 보면, 세포막 표면에 존재하는 많은 종류의 당단백질이나 당지질에 암 유전자(oncogene)와 같은 특정 신호의 명령으로 "잘못된 당질화(aberrant glycosylation)"로 인한 당쇄(sugar chain)의 변화가 일어나 세포 간의 접착(adhesion), 인식(recognition)에 변화를 일으켜 세포의 암화 및 암 전이가 발생한다(Hakomori and Kannagi, 1983, J. Natl . Cancer Inst ., 71:231-251; Feizi, 1985, Nature, 314:53-571). 단백질이 소포체(endoplasmic reticulum)에서 만들어질 때 당단백질의 경우 소포체에서 기본적인(core) 당쇄가 만들어진다. 이어 세포 내 당질화 공장인 골지체로 이동하여 세포 내·외부의 여러 자극과 신호에 따라 여러 당쇄가 부가되는데 잘 알려진 당쇄 가지와 이를 촉매하는 당전이효소를 표현한 것이 도 1이다. 외부 영향에 의해 특정 암 유전자 ras, raf, 전사인자 ets 등의 신호전달을 거쳐 도 1의 여러 당전이효소가 활성화된다. 여러 효소 중 N-연결형 당쇄의 아스파라긴(Asn)에 가까운 쪽으로 퓨코스(fucose)를 부가하는 당전이효소 FUT8은 최근에 정제된 효소로서 암의 전이와 연관되어 부각되고 있다. 당단백질 중 퓨코실레이션(fucosylation)과 연관하여 암의 발전단계에 따라 발현이 증가하거나 당질부위의 변화를 보여주는 표식 인자로 α-피토프로테인(α-fetoprotein;"AFP"), 안티트립신(antitrypsin) 등이 이미 알려져 있다(Miyoshi, E., Ko, J. H. et al . (1999) Biochim . Biophys . Acta 1473:9-20). 최근에 이 퓨코실레이션에 관여하는 효소 FUT8이 일본의 다니구치(N. Taniguchi) 등에 의해 정제되고 그 cDNA 서열이 밝혀졌으며 특히 α1,6-FucT의 과발현 세포주(hepatoma Hep3B-FT)를 면역결핍 생쥐(athymic nude mice)의 비장(spleen)에 주사하여 간 조직에서 암전이 정도를 검증한 결과 놀랍게도 대조군 세포(Hep3B)에 비하여 암 조직이 거의 발견되지 않았다(Miyoshi,E., Ko, J. H. et al . (1999) Cancer Research 59:2237-2243). 이 N-연결형 당쇄의 안쪽에 붙은 퓨코스(fucose)는 렉틴 LCA에 의해 인식되는데 그 특이성은 높지 않아 렉틴 Con A처럼 N-연결형 당쇄의 코어 부분을 확인하는데 주로 쓰인다.

한편, 당전이효소 GnT-V는 당단백질의 기본적인 당쇄에 N-아세틸글루코사민을 β1,6의 위치로 부가하는 반응을 촉매하는 효소로 암의 침윤(invasion)과 전이(metastasis)에 직접 연관성이 있는 것으로 알려져 있다(Dennis et al ., 1987, Science, 236:582-5853). 일반적으로 당단백질은 단백질이 합성된 후 소포체(endoplasmic reticulum)에서 아주 기본적인 당쇄가 만들어진 후 골지체로 이동하여 세포의 다양한 생명현상의 결과로 여러 당전이효소에 의해 당의 부가가 이루어지는데 1차적으로 만들어지는 N-아세틸글루코사민 당전이효소 여섯 가지(I-Ⅵ)가 촉매하여 얻어지는 당쇄들을 도 1에서 보여주고 있으며, 이중 β1,6-N-아세틸글루코사민 당쇄를 만드는 GnT-V가 암의 발생과 전이에 가장 많이 관여한다고 알려져 있다. GnT-V 효소는 골지체에 위치하며, 목표 단백질들은 당쇄에 변화를 받아 세포 표면이나 밖으로 분비된다. 이때 당단백질은 대상세포의 표면 단백질과 인식(recognition), 접착(adhesion)에 관여하여 암을 유발하게 된다.

1987년 데니스 등이 이런 β1,6의 가지가 암 조직이나 암의 전이가 일어날 때 높은 정도로 발생함을 보고하면서 GnT-V의 생물학적 의미가 부각되었다(Dennis et al ., 1987, Science, 236:582-5853). 세포 표면 단백질인 gp130이 GnT-V의 주 목표 단백질 중의 하나인데 β1,6 N-아세틸글루코사민 부가와 전이 활성에 상관관계가 있음이 밝혀졌으며, 또한 GnT-V가 적중(결손, knock-out)된 배아줄기세포주(embryonic stem cell line)를 생쥐에서 구축하고, 상기 생쥐에 폴리오마바이러스(polyomavirus)의 중간(middle) T 항원(이하 "PyMT"라 약칭한다) 바이러스성 암유전자를 도입하여 암을 유발시키면 정상 생쥐에 PyMT만을 과발현시킨 생쥐에 비하여 PyMT에 의해 유도되는 암의 성장과 전이가 크게 억제됨을 확인하였고(Granovsky et al ., 2000, Nature Med ., 6:306-312), 동물 내에서 β1,6의 가지화가 쥐 유방 암에서 높은 전이성을 보여주었다. 이렇듯, 효소 GnT-V는 조직에 관계없이 암의 전이 과정에 관여하여 높은 전이 활성을 보이는 것으로 예측되고 있는데, 사람의 폐암세포 및 쥐의 신장에서 정제된 이래, cDNA 클로닝, 게놈상의 구조 및 프로모터 영역의 해석이 이루어졌다(Gu et al ., 1993, J Biochem, 113:614-619; Soreibah et al ., 1993, J Biol . Chem ., 268:15381-15385; Kang et al ., 1996, J. Biol . Chem ., 271:26706-26712). 본 발명자들도 전사인자인 ets-1이 GnT-V의 발현에 크게 관여함을 보고하였다(Ko, et al ., 1999, J. Biol . Chem ., 274(33):22941-22948). 항암제를 이용한 종양의 치료가 한계에 부닥치며 많은 연구는 암의 조기 발견이나 예방의 방법, 즉 조기 발견(early-detection) 마커를 찾는 쪽으로 그 패러다임이 바뀌고 있다.

이에, 본 발명자들은 앞서 암이 유발된 세포에서 당전이효소 GnT-V에 의해 β1,6-N-아세틸글루코사민이 부가된 당단백질을 2차원 전기 영동을 이용하여 검출하고 이를 질량분석기로 아미노산 서열을 분석하여 당쇄 변화를 나타내는 여러 당단백질을 발굴 동정하여 보고하였다(Kim et al., 2004, Proteomics, 4(11):3353-3358; Kim et al ., 2006, Proteomics, 6(4):1187-1191). 그러나, 혈액 내에 있는 단백질의 상당비율은 당단백질로서 선행 발명에서 제시한 방법으로는 미량으로 존재하는 당단백질을 검출하는 데는 한계를 지니고 있을 뿐만 아니라 젤에 기반하여 단백질을 추출하여 동정하는데 있어서 ‘오류양성(false-positive)’이 유입될 개연성이 크다. 이런 한계를 극복하기 위하여 본 발명자들은 β1,6-N-아세틸글루코사민을 인지하는 렉틴 L-PHA를 이용하여 β1,6-N-아세틸글루코사민을 보유한 당단백 질을 모아 동정하는데 성공함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 암 발생 또는 전이에 관여하는 단백질의 당쇄 변화를 좀더 민감하게 검출해내는 방법을 제공하려는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 암 발생 또는 전이에 관여하는 단백질의 당쇄 변화를 좀더 간단한 방법으로 검출해내려는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 β1,6-N-아세틸글루코사민을 인지하는 렉틴 L-PHA를 이용하여 β1,6-N-아세틸글루코사민을 보유한 당단백질을 직접적인 방법으로 탐침함으로써 종래의 방법에 비해 간단하면서도 민감성이 높은 당단백질 검출 방법을 발명하였다.

본 발명은 암 발생 및 전이에 관여하는 당단백질에서 베타 1,6 N 아세틸글루코사민 가지 등의 '잘못된 당질화’를 보이는 당단백질을 렉틴 침전이라는 새로운 기법을 이용하여 극미량까지 간단하게 포집해낼 수 있는 새로운 방법을 제시하고 있으며, 이 방법은 수많은 당단백질에 대하여 모든 암 혹은 뇨, 혈액에까지 확대하여 적용할 수 있을 것이다.

본 발명은 암 발생 및 전이에 관여하는 당단백질의 당쇄 변화를 렉틴 침전법으로 민감하게 분석함으로써 암 진단에 이용 가능한 마커로서 당단백질을 제공한다.

본 발명은 암 발생 및 전이에 관여하는 당단백질의 당쇄 변화를 렉틴 침전법으로 민감하게 분석하는 방법에 관한 것이다.

상기 암은 대장암, 위암, 폐암, 간암, 자궁암, 유방암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 상기 종류의 암으로 제한되는 것은 아니며, 모든 종류의 암이 본 발명의 대상이 될 수 있다.

본 발명은 정상세포와 비교하여 암세포 및 전이된 세포에서 N-연결형 당단백질의 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄 가지가 변화된 당단백질만을 얻어내는 방법을 제공한다. β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄를 만드는 GnT-V는 조직에 관계없이 암의 발생과 전이에 관여하고, 상기 GnT-V에 의해 부가되는 β1,6-N-아세틸글루코사민 당쇄는 렉틴 피토해마글루티닌(Phytohemagglutinin)-L₄(본 발명의 상세한 설명, 청구범위, 도면 등에서 "L₄-PHA" 또는 "L-PHA"라 약칭한다)에 의해 검출되는데 이미 바이오틴 등의 리간드로 표지된 L-PHA를 스트렙타비딘과 같은 수용체가 붙어 있는 아가로스 구슬에 붙인 후 이어 단백질 용액을 가하면 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄 가지를 보유한 당단백질만을 집적(enrichment)하는 방법을 제공한다.

본 발명은 확보한 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄 가지 보유 당단백질에 트립신을 처리하고 이를 바로 고자장(7-테슬러)의 퓨리에변환 이온공명형 질량분석기(Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance; FT-ICR)를 이용하여 펩타이드 서열을 제시함으로써 미량의 당단백질을 동정하는 방법을 제공한다.

본 발명은 리간드가 결합된 L₄-PHA(Phytohemagglutinin-L₄)와 상기 리간드에 결합하는 리간드 수용체가 결합된 글라이칸 비드를 반응시켜 얻어지는 L₄-PHA-글라이칸 비드에 분석대상 시료를 가하여 반응시키고,

상기 반응으로부터 얻어진 당단백질을 겔 전기영동으로 전개한 다음 상기 당단백질을 겔에서 절개하고,

상기 절개된 당단백질을 젤 내부에서(in-gel) 절단을 수행한 후 질량분석을 통해 당단백질을 동정하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 글라이칸 비드가 아가로스 비드 또는 세파로스 비드인 것을 특징으로 하는, 당단백질을 동정하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 리간드 및 리간드 수용체가 바이오틴 및 아비딘인 것을 특징으로 하는, 당단백질을 동정하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 분석대상 시료가 자연 상태(native form) 또는 변성된 형태(denatured form)인 것을 특징으로 하는, 당단백질을 동정하는 방법에 관한 것이다. 상기 변성된 형태라 함은 환원된 형태를 포함하는 의미로 사용되었다.

또한, 본 발명은 상기 변성된 형태의 분석대상 시료는 β-머캅토에탄올, 요오드화 초산(Iodoacetic acid) 및 요오드화 초산아미드(Iodoacetamide)로 이루어진 그룹 중 선택된 1종으로 변성시킨 것임을 특징으로 하는, 당단백질을 동정하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 대조구 및 분석구의 세포 배양액을 각각 리간드가 결합된 L₄-PHA(Phytohemagglutinin-L₄)와 상기 리간드에 결합하는 리간드 수용체가 결합된 글라이칸 비드를 반응시켜 얻어지는 L₄-PHA-글라이칸 비드에 가하여 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄 가지의 차이를 보이는 당단백질을 분석 및 동정하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 정상 혈액과 환자 혈액을 각각 리간드가 결합된 L₄-PHA(Phytohemagglutinin-L₄)와 상기 리간드에 결합하는 리간드 수용체가 결합된 글라이칸 비드를 반응시켜 얻어지는 L₄-PHA-글라이칸 비드에 가하여 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄 가지의 차이를 보이는 당단백질을 분석하는 방법에 관한 것이다.

나아가, 본 발명은 기존에 발굴된 암 후보 마커들을 알부민이나 글로불린, 트랜스페린과 같이 혈액 내 다량존재하는 주요단백질의 간섭을 최소화하여 혈액에서 검증(validation)할 수 있는 방법의 기초가 될 수 있을 뿐만 아니라, 현재 혈액 내 검증의 최적 방법으로 알려져 있는 SISCAPA(Stable Isotope Standards and Capture by Anti-peptide Antibodies: Pearson et al , 2004, J. Proteome Res . 3, 235-44) 방법과 연계하여 검증의 효율화를 극대화할 수 있는 가능성을 지닌 분석방법에 관한 것이다.

암의 전이는 세포 간의 인식(recognition), 접착(adhesion)에 의한 것이며, 인식과 접착에 관여하는 당단백질은 세포의 표면에 있거나 분비되어 나오는 형태이므로, 암을 진단할 수 있는 초기 표식 인자들은 혈액이나 소변 등의 체액의 진단을 통해서 암 진단이 가능하다. 본 발명자들은 대장암 특이적인 종양표식 인자를 찾아내기 위하여 GnT-V 발현이 상대적으로 낮은 대장암 세포주 WiDr을 대조구로 사용하였으며, GnT-V를 과발현하는 세포주인 WiDr:GnT-V을 대장암의 모델 시스템으로 보고 세포주 수준에서 글리코믹스(Glycomics)를 수행하였다. 즉 전이된 암세포 배양액에 대하여 2차원 전기영동을 통한 분석을 시도하고, 각각 2장의 겔을 확보한 다음 한 장은 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색하고 다른 한 장은 렉틴 블럿팅(lectin blotting)을 수행하여, 정상세포와 비교하여 암 세포 및 전이된 세포에서 당쇄 변화를 일으키는 단백질을 선별(표 1 참조)하였다. 그러나, 이는 블럿팅 과정에서 비특이적 결합이 가능할 수가 있고, 블럿팅이라는 간접적인 과정을 거침으로 인하여, 동정된 단백질에 대해 검증하는 절차를 거쳐야하는 결점을 지니고 있다. 또한 일정 크기의 2차원 전기영동은 예를 들어 13㎝x13㎝의 경우 약 500여 개 정도의 단백질을 배열해 낼 수 있어 극미량의 단백질의 경우에는 동정해낼 수 없는 한계를 지니고 있다. 본 발명은 이러한 결점을 극복하기 위해, β1,6 N-아세틸글루코사민 가지를 보유한 단백질을 직접적으로 다량 발굴하는 방법으로서 이를 인식하는 렉틴을 이용한 직접적인 방법을 제시하고 있다.

Accession gi NO.	Identities	Peptides matched	Sequence Coverage^a (%)	Total Score^b	Mr/pI^c
177836	α-1-antitrypsin	8	31.1	380	46.7/5.5
532198	Angiotensinogen	5	14.6	237	53.2/5.8
123081	-hexosaminidase chain precursor	3	5.0	104	63.1/6.3
4503143	Cathepsin D preproprotein	8	23.5	459	44.6/6.1
3650498	Cathepsin X precursor	7	28.0	291	33.9/7.1
230581	Chain H, Immunoglobulin G1	6	17.9	314	49.7/8.5
21617867	Dipeptidyl aminopeptidase II	4	8.9	169	54.3/5.9
38327632	Discoidin receptor tyrosine kinase isoform b	2	3.1	96	97.2/6.1
4758116	Dystroglycan 1 precursor	2	3.0	140	97.6/8.7
77416865	Granulins precursor	4	7.4	182	63.5/6.4
5729877	Heat shock 70 kDa protein 8 isoform 1	9	17.0	278	70.9/5.4
20149594	Heat shock 90kDa protein 1, beta	7	11.3	229	83.3/5.0
11602963	Heparan sulfate proteoglycan perlecan	5	2.2	175	466.6/6.0
4504371	Hexosaminidase A preproprotein	8	17.0	470	60.7/5.0
106586	Ig kappa chain V-III	2	10.7	124	23.1/5.8
1944352	IgG Fc binding protein	5	3.2	242	572.1/5.1
14583014	laminin receptor-like protein 5	2	9.2	116	33.0/4.8
2842759	Legumain precursor	3	10.4	110	49.4/6.1
4557747	Met proto-oncogene precursor	11	9.1	512	155.5/7.0
4503899	N-acetylgalactosamine-6-sulfatase	5	14.9	309	58.0/6.3
4504061	N-acetylglucosamine-6-sulfatase	9	17.2	469	62.0/8.6
4505375	Neogenin homolog 1	5	4.7	248	160.0/6.1
32485152	Prolyl 4-hydroxylase	5	15.2	247	84.8/5.3
11386147	Prosaposin	8	19.9	392	58.1/5.1
4505989	Protective protein for -galactosidase	3	6.7	127	54.5/6.2
729008	Protein tyrosine kinase 6	3	5.1	76	101.1/6.4
15826840	Protein tyrosine kinase 7	9	11.5	477	118.4/6.7
5231228	Ribonuclease T2 precursor	5	22.6	247	29.5/6.7
11545839	Serine protease 22	2	11.0	117	33.7/7.6
135850	Tissue inhibitor of metalloproteinase-1	2	7.2	102	24.2/8.5
120749	Tumor-associated calcium signal transducer 1 precursor	2	11.8	163	34.9/7.4
4507677	Tumor rejection antigen-1 (gp96)	15	19.3	440	92.5/4.8
38026	Zn--2-glycoprotein	10	40.4	361	34.7/5.7

a; 단백질을 구성하는 전체 아미노산 중 질량분석기로 서열이 확인된 아미노산의 비율을 의미한다.

b; 전체 값(Total score)은 각 개별 펩타이드에서 얻어진 스코어 값의 합이며 각 스코어는 -10xLog(P)이다. 여기서 P는 NCBInr database에 대해서 blast하였을 때의 결과가 우연의 사건일 확률을 의미한다.

c; 상기 표 1에서 분자량 및 등전점 pI는 글리칸(glycan) 잔기를 계산에서 고려하지 않았을 때의 이론값이다.

β1,6 N-아세틸글루코사민 가지를 인식하는 L-PHA는 이 당쇄 가지에 특이성을 지니고 있지만 컬럼으로 제작시 pH를 이용하여 떼어내는 방법 외에는 천연의 기질이 극미량이라 다른 용출 방법이 없어 잘 이용되지 못해 왔다. 이를 극복하기 위하여 본 발명자들은 당단백질이 L-PHA에 결합한 상태에서 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동을 최소 전개하고 전개된 단백질들의 밴드를 바로 잘라낸 다음 트립신을 처리하고 이를 질량분석을 통해 발굴해 내었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 렉틴과의 반응을 이용한 β1,6 N-아세틸글루코사민 가지 보유 당단백질의 정제

세포주 자체의 GnT-V의 발현이 낮은 WiDr:Mock에 대응하여 암전이 활성이 높은 WiDr:GnT-V를 구축하고 이를 대장암의 모델 시스템으로 보고 무혈청 배지를 수거하였다. 앞선 여러 연구(Egeblad et al., 2002, Nature Rev . 2:161-174; Kannagi et al., 2004, Cancer Sci. 95(5):377-384)에서 암의 전이는 단백질 분해작용(proteolysis) 및 접착(adhesion)에 의한 것이며, 분해와 접착에 관여하는 당단백질은 세포의 표면에 있거나 분비되어 나오는 형태임이 밝혀졌으므로 무혈청 배지 배양액에 대하여 GnT-V에 의해 β1,6 N-아세틸글루코사민 가지를 보유한 당단백질을 정제하였다. 무혈청 배지를 수거하여 농축한 후, 1㎎의 단백질을 미리 아비딘-아가로스와 상온에서 한 시간 동안 반응시켜 아비딘 또는 아가로스와 비특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 제거하였다. 비특이적으로 결합한 단백질을 제거한 후 단백질을 L-PHA-바이오틴(Biotin)-아비딘(Avidin)-아가로스(Agarose) 복합체에 4℃에서 밤새 결합시켰다. 이 결합을 떼어내는 기질은 자연에 존재하는 만노오스에 1,6 N-아세틸글루코사민 가지가 부가된 당쇄일 가능성이 있으나, 이 당은 매우 고가이며 이를 실험적으로 검증한 보고는 현재까지 없는 실정이다. 다만 몇몇 그룹에서 산성 pH에 의해 화학적으로 떼어내는 방법을 시도하고 있으나 명백히 입증된 바 없으며 또한 낮은 pH에서는 단백질이 분해되거나 또는 비특이적 용출로 인해 동일하게 전체 단백질이 떨어지지 않는 결점을 지니고 있다. 따라서 이 복합체에 붙어있는 단백질을 비환원적 방법으로 용출시킬 수 있는 검증된 방법은 아직 없기 때문에 완전변성 후 분리된 단백질의 질량분석을 수행할 수밖에 없다. 우선 복합체를 과량의 PBS(Phosphate buffered saline)로 씻어준 다음, 이 복합체에 결합한 당단백질을 용액상태에서 10U의 트립신(Promega사)을 가하여 밤새 37℃에서 절단하였다. 절단된 펩타이드를 물과 아세토나이트릴로 추출한 후 원심 동결 건조기로 건조하고 7테슬러의 자력을 지닌 FT-ICR과 LTQ 매스 스펙트로미터를 이용하여 각 펩타이드의 서열을 결정하고 이 서열로부터 Mascot 프로그램(버전, 2.0)을 이용하여 단백질을 동정하였다(도 2 및 도 3).

이때 이용된 데이터베이스는 NCBInr 20051212(taxonomy;human, entries;103,913 human sequence entries)이다. 그 결과는 단백질의 2차 구조 (예를 들어 다이설파이드 결합 등)가 깨어지지 않은 비변성의 용액상태에서 트립신을 처리하였으므로 단백질 분해가 잘 일어나지 않았으며, 그 결과 용출된 펩타이드의 서열분석이 효과적으로 이루어지지 못하였다. 이미 선행연구에서 당단백질 "TIMP-1(Tissue inhibitor of metalloproteinase 1)"을 겔 상에서 동정해낸바 있으며 TIMP-1의 당쇄 변화를 검증해 낸 결과를 바탕으로, TIMP-1을 이 방법의 적절성을 판단하는 기준 단백질로 삼았다. 이를 기준으로 한 결과 본 실시예에서는 TIMP-1 단백질이 동정되지 않았으며, 당단백질이 아닌 일반 단백질이 비특이적 결합으로 인하여 과량 검출되었다.

< 실시예 2> 렉틴과의 반응 전에 단백질 시료의 환원 및 염 제거 과정을 통한 β1,6 N-아세틸글루코사민 가지 보유 당 단백질의 정제

실시예 1에서 렉틴의 일반 단백질에 대한 비특이적 결합을 감소시키고 민감도를 높이기 위해 농축된 배지에 베타-머캡토에탄올을 최종농도 1%(v/v)로 가하여 환원시키고, 염제거 컬럼을 이용하여 반응 후 남은 베타-머캡토에탄올과 염을 제거하였다(도 4). 1mg의 단백질에 대하여 실시예 1과 동일하게 렉틴 침전을 수행하고 질량분석을 통해 동정해 내었다. 그 결과 도 5와 같이 실시에 1에 비해서는 비교적 다량의 당단백질을 확보하기는 하였으나 낮은 값의 스코어를 나타내었을 뿐만 아니라 동정의 기준이 되는 TIMP-1도 검출되지 않았다.

< 실시예 3> 렉틴 침전법에 이은 SDS - PAGE 를 통한 단백질 분해의 극대화 및 β1,6 N-아세틸글루코사민 가지 보유 당 단백질의 동정

실시예 1과 동일한 방법으로 무혈청 배지를 수거하여 농축한 후, 실시예 2와 같이 베타-머캡토에탄올을 최종 농도 1%로 넣어 환원시키고 염을 제거한 다음, 1㎎의 단백질을 미리 아비딘-아가로스에 상온에서 1시간 반응시켜 비특이적으로 아비딘이나 아가로스에 붙는 단백질을 제거하였다. 이어 실시예 1과 같은 과정을 거쳐 렉틴과 당단백질의 반응을 수행하고, 렉틴과 결합한 단백질을 1배의 SDS-PAGE 로딩용 완충용액에 넣고 끓여 주어 결합을 끊어내었다. 이어 8%의 SDS-PAGE 겔에 최소 전개한 다음 단백질 전체를 겔에서 절개한 후 젤 내부에서(in-gel) 절단을 수행하였다. 트립신으로 절단된 펩타이드는 아질런트 1100 나노플로우 시스템 (Agilent Technologies)으로 분리한 후 연동된 7 테슬러의 피니간 FTICR-LTQ 질량분석기(Thermo Electron)로 서열 분석하였다. 펩타이드의 결합과 크로마토그래픽 분리는 10㎝의 실리카 emitter(내경 75mm)에 역상 ReproSil-Pur C18-AQ 3m 레진(Ammerbuch-Entringen, 독일)이 충진된 것을 이용하였고 펩타이드의 시료 로딩은 오토샘플러(Surveyor)로 20㎖/min의 속도로 진행시켰고, 펩타이드는 C18(입자크기 5㎜)가 충진된 미세모세관 컬럼(길이 100 mm)를 이용하여 분리하였으며 이때 사용한 이동상은 0.1%의 개미산에 0%(A)와 100%(B)의 아세토나이트릴을 각각 다른 구배(15분간 B 5%, 3분간 B 20%, 47분간 B 50%로 올리고 최종 95%로 씻어주었다)를 주어 전개하였다. 용출된 펩타이드는 일렉트로스프레이하여 직접 질량분석기로 유입되었다. 질량분석 소프트웨어는 Xcalibur(Thermo Electron Version 1.4SR1)을 이용, 데이터에 따라 자동으로 MS와 MS/MS를 연동하여 분석하도록 수행하였다. 이렇게 하여 얻어낸 결과는 한 가지 예로서 도 7에 나타내었다. 이 방법을 이용한 결과 1) 모든 당단백질에 대해 신뢰성 있는 스코어 (P<0.05)로 많은 단백질을 동정해 낼 수 있었으며 2) 도 7에 보여주듯 TIMP-1을 높은 스코어로 확인해 낼 수 있었으며, 3) 기존의 렉틴 블럿팅 방법으로 동정된 단백질을 더 정확하게 동정해 냈을 뿐만 아니라(도 8), 4) 렉틴 블럿팅이 잡아낼 수 없는 미량의 단백질에 대하여도 높은 스코어로 동정해 낼 수 있었다(도 9).

< 실시예 4> 렉틴 침전법을 이용한 동정 방법의 질량분석 방법을 통한 확인

실시예 2의 방법과 실시예 3의 방법을 질량분석기로 직접 검증하기 위해 TIMP-1 단백질에서 질량분석에 잘 잡히는 펩타이드 서열(GFQALGDAADIR )에 대해 선택조사하였다. 도 10에 보는 바와 같이 GFQALGDAADIR 서열의 분자량은 약 1232 Da 이며 2가의 이온을 띠게 되면 약 617.31 m/z값을 나타내게 된다. 실시예 3의 결과 약 34분의 머무름 시간을 보인 피크가 GFQALGDAADIR의 서열을 갖는 TIMP-1의 피크임을 확인할 수 있었으나 실시예 2에서는 그 머무름 시간대에서 어떤 TIMP-1의 펩타이드를 확인할 수 없었다. 또한, 도 11의 경우와 같이 MRM(multiple reaction monitoring) 기법을 이용하여 m/z 617.31의 펩타이드와 이 펩타이드로의 조각 펩타이드를 선택적으로 추적하여 모니터링한 결과에서도 실시예 3에서는 m/z 617.31의 펩타이드 및 이 펩타이드로부터 잘려진 프래그먼트인 m/z 717.36 (+1)을 효과적으로 모니터링할 수 있었지만, 실시예 2의 경우는 두 펩타이드를 동정할 수 없었으며 이는 풍부한 단백질들의 비효율적 절단 및 펩타이드 용출에 기인함에 그 원인을 찾을 수 있었다. 따라서, 본 발명자들은 실시예 3의 방법이 1,6 N-아세틸글루코사민 가지가 부가된 단백질을 동정하는 최적화된 방법인 것으로 결론지었다.

따라서, 본 발명의 방법은 현재까지의 2차원 전기영동의 분석한계를 넘어 극미량의 당질 변화를 나타내는 단백질을 포집해 낼 수 있는 새로운 기법을 제시하고 있다.

도 1은 N-연결형 당쇄와 당전이효소가 촉매하여 얻어지는 당쇄, 그리고 렉틴 L-PHA가 인식하는 당쇄 가지를 나타낸 모식도이다.

도 2는 실시예 1의 방법을 개략화한 도면이다.

도 3은 실시예 1의 방법에 따라 동정된 단백질들을 나타낸 것으로 많은 비 당단백질이 검출될 뿐 아니라 기준이 되는 Timp-1 단백질이 검출되지 않은 것을 제시한 것이다.

도 4는 실시예 2의 방법을 개략화한 도면이다.

도 5는 실시예 2의 방법에서 나온 결과로서 비교적 당단백질이 많이 나오나 스코어 값이 비교적 낮고 또한 기준이 되는 Timp-1 단백질이 나타나지 않은 결과를 보여 주고 있다.

도 6은 실시예 3의 방법을 개략화한 도면이다.

도 7은 실시예 3의 결과로서 높은 스코어 값과 기준이되는 Timp-1단백질이 나타난 예를 제시하고 있다.

도 8은 실시예 3의 방법과 선행 렉틴 블럿에서 겹치게 나온 사례를 제시한 것이다.

도 9는 실시예 3의 방법을 통해 선행 렉틴 블럿에서 동정하지 못한 당단백질을 동정해낸 결과를 제시한 것이다.

도 10은 질량분석 스펙트럼을 통해 실시에 2와 3을 비교한 것으로 실시예 3에서만 해당하는 펩타이드의 스펙트럼(34.36분)을 보여주고 있다.

도 11은 질량분석의 MRM(Multiple Reaction Monitoring)을 통해 해당 Timp-1 펩타이드가 실시에 3에서만 잘 나타나고 있음을 제시한 그림이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> An identification method of glycoproteins using a specific lectin precipitation <130> jhko-0711-lectinaffi2 <150> KR10-2007-100916 <151> 2007-10-08 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Phe Gln Ala Leu Gly Asp Ala Ala Asp Ile Arg 1 5 10

Claims

리간드가 결합된 L₄-PHA(Phytohemagglutinin-L₄)와 상기 리간드에 결합하는 리간드 수용체가 결합된 글라이칸 비드를 반응시켜 얻어지는 L₄-PHA-글라이칸 비드에 분석대상 시료를 가하여 반응시키고,

상기 반응으로부터 얻어진 당단백질을 겔 전기영동으로 전개한 다음 상기 단백질을 겔에서 절개하고,

상기 절개된 당단백질을 젤 내부에서(in-gel) 절단을 수행한 후 질량분석을 통해 당단백질을 동정하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 글라이칸 비드는 아가로스 또는 세파로스 비드인 것을 특징으로 하는, 당단백질을 동정하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 리간드 및 리간드 수용체는 바이오틴 및 아비딘인 것을 특징으로 하는, 당단백질을 동정하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 분석대상 시료는 자연 상태(native form) 또는 변성된 형태(denatured form)인 것을 특징으로 하는, 당단백질을 동정하는 방법.
제4항에 있어서,

상기 변성은 β-머캅토에탄올, 요오드화 초산(Iodoacetic acid) 및 요오드화 초산아미드(Iodoacetamide)로 이루어진 그룹 중 선택된 1종으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 당단백질을 동정하는 방법.
대조구 및 분석구의 세포 배양액을 각각 리간드가 결합된 L₄-PHA(Phytohemagglutinin-L₄)와 상기 리간드에 결합하는 리간드 수용체가 결합된 글라이칸 비드를 반응시켜 얻어지는 L₄-PHA-글라이칸 비드에 가하여 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄 가지의 차이를 보이는 당단백질을 검출하는 방법.
정상 혈액과 환자 혈액을 각각 리간드가 결합된 L₄-PHA(Phytohemagglutinin-L₄)와 상기 리간드에 결합하는 리간드 수용체가 결합된 글라이칸 비드를 반응시켜 얻어지는 L₄-PHA-글라이칸 비드에 가하여 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄 가지의 차이를 보이는 당단백질을 검출하는 방법.