JPH06100604B2 - α−フェトプロテインの分画検出試薬キットおよび分画検出方法 - Google Patents
α−フェトプロテインの分画検出試薬キットおよび分画検出方法Info
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- JPH06100604B2 JPH06100604B2 JP12396985A JP12396985A JPH06100604B2 JP H06100604 B2 JPH06100604 B2 JP H06100604B2 JP 12396985 A JP12396985 A JP 12396985A JP 12396985 A JP12396985 A JP 12396985A JP H06100604 B2 JPH06100604 B2 JP H06100604B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、腫瘍マーカーである体液中のα−フエトプロ
テイン（以下AFPと称する）または細胞培養液上清中のA
FPを分画・検出するための検出試薬キツトおよび体液中
または細胞培養液上清中のα−フエトプロテインの分画
検出方法に関する。
テイン（以下AFPと称する）または細胞培養液上清中のA
FPを分画・検出するための検出試薬キツトおよび体液中
または細胞培養液上清中のα−フエトプロテインの分画
検出方法に関する。
（従来の技術） 腫瘍のマーカー物質である体液中のα−フエトプロテイ
ンを分画・検出することについては従来から検討されて
いる。ブレボロビツチ（Breborowicz）ら＊）および宮
崎ら＊＊）は、レクチン含有アガロースゲルなどで１次
元の電気泳動を行つて、レクチン親和性の異なるAFPを
分離し、さらに抗AFP抗体を含有するアガロースゲルで
１次元目とは直角の方向に２次元目の電気泳動を行な
い、分離されたAFPの各スポツトを色素を用いた非特異
的蛋白染色により検出してい。〔＊）スカンジナビアン
ジヤーナルオブイムノロジー（Scand.J.Immunol.）14、
15〜20（1981）〕、〔＊＊）肝臓22、1559〜1568（198
1）〕しかしながら、この方法は感度が低く、低濃度AFP
の試料のレクチン親和性による分離結果を定量的に評価
することは不可能であつた。この点を改良するために、
本発明者らは、分離されたAFPと抗AFP抗体の複合物から
なるピークをプロテインＡ−酵素複合体を用いて特異的
に染色する方法を開発した〔エレクトロフオレシス（El
ectrophoresis）４、371−373（1983）〕。この方法で
は0.5ngのAFPを検出できるが、レクチン親和電気泳動に
用いるのにはまだ充分な感度ではなく、また、これらの
方法は電気泳動を２回行うため長時間を要し、多数の検
体を同時に処理することも困難であつた。
ンを分画・検出することについては従来から検討されて
いる。ブレボロビツチ（Breborowicz）ら＊）および宮
崎ら＊＊）は、レクチン含有アガロースゲルなどで１次
元の電気泳動を行つて、レクチン親和性の異なるAFPを
分離し、さらに抗AFP抗体を含有するアガロースゲルで
１次元目とは直角の方向に２次元目の電気泳動を行な
い、分離されたAFPの各スポツトを色素を用いた非特異
的蛋白染色により検出してい。〔＊）スカンジナビアン
ジヤーナルオブイムノロジー（Scand.J.Immunol.）14、
15〜20（1981）〕、〔＊＊）肝臓22、1559〜1568（198
1）〕しかしながら、この方法は感度が低く、低濃度AFP
の試料のレクチン親和性による分離結果を定量的に評価
することは不可能であつた。この点を改良するために、
本発明者らは、分離されたAFPと抗AFP抗体の複合物から
なるピークをプロテインＡ−酵素複合体を用いて特異的
に染色する方法を開発した〔エレクトロフオレシス（El
ectrophoresis）４、371−373（1983）〕。この方法で
は0.5ngのAFPを検出できるが、レクチン親和電気泳動に
用いるのにはまだ充分な感度ではなく、また、これらの
方法は電気泳動を２回行うため長時間を要し、多数の検
体を同時に処理することも困難であつた。
そこで、本発明者らはさきにレクチン含有アガロースゲ
ルを用いた１次元電気泳動を行ない、これにより分離し
たレクチン親和性の異なるAFPを第２次元目の電気泳動
を実施することなく、抗AFP抗体を結合させたニトロセ
ルロース膜に電気転写またはブロツテイングによる抗体
親和転写をすることにより検出でることを見出した。
〔生物物理化学第28巻、第２号、第21頁および第28巻、
第５号、第13頁（1984）〕かかる方法は、上記の電気泳
動を２回行う方法に比べ簡単でしかもAFPを感度よく検
出できるが、まだ実用的レベルには達してはいなかつ
た。
ルを用いた１次元電気泳動を行ない、これにより分離し
たレクチン親和性の異なるAFPを第２次元目の電気泳動
を実施することなく、抗AFP抗体を結合させたニトロセ
ルロース膜に電気転写またはブロツテイングによる抗体
親和転写をすることにより検出でることを見出した。
〔生物物理化学第28巻、第２号、第21頁および第28巻、
第５号、第13頁（1984）〕かかる方法は、上記の電気泳
動を２回行う方法に比べ簡単でしかもAFPを感度よく検
出できるが、まだ実用的レベルには達してはいなかつ
た。
（発明が解決しようとする問題点） したがつて、本発明が解決しようとする問題点は、低濃
度のAFPを含む少量のサンプルについてAFPをレクチン親
和性の差異によつて分画して高感度に検出するための、
検出試薬キツトおよび検出方法を見出すことである。
度のAFPを含む少量のサンプルについてAFPをレクチン親
和性の差異によつて分画して高感度に検出するための、
検出試薬キツトおよび検出方法を見出すことである。
（問題点を解決するための手段） かかる問題点は以下に述べる本発明（AFPの分画検出試
薬キツトおよびAFPの分画検出方法の２発明からなる）
により解決される。
薬キツトおよびAFPの分画検出方法の２発明からなる）
により解決される。
１）（ｉ）レクチン含有アガロースゲル （ii）抗AFP抗体結合ニトロセルロース膜 （iii）該レクチンと特異的相互作用を有する単糖また
はオリゴ糖の溶液 （iv）抗体AFP抗体とは異なる動物種由来の抗AFP抗体 （ｖ）（iv）で用いる動物種の免疫グロブリンに対する
抗体に酵素標識したものおよび （vi）（ｖ）の酵素によつて発色する基質からなるAFP
の分画検出試薬キツト。
はオリゴ糖の溶液 （iv）抗体AFP抗体とは異なる動物種由来の抗AFP抗体 （ｖ）（iv）で用いる動物種の免疫グロブリンに対する
抗体に酵素標識したものおよび （vi）（ｖ）の酵素によつて発色する基質からなるAFP
の分画検出試薬キツト。
２） レクチン含有アガロースゲルにて電気泳動を行な
つてAFPを分画したものをAFP抗体結合ニトロセルロース
膜にブロツテイングにより抗体親和転写し、転写された
ニトロセルロース膜を、使用したレクチンと特異的相互
作用を有する単糖又はオリゴ糖の溶液で洗浄し、しかる
後に該膜への結合に用いた抗AFP抗体とは異なる動物種
由来の抗AFP抗体を加え、さらに、上記の動物種の免疫
グロブリンに対する抗体に酵素標識したものを加え、つ
いで該酵素によつて発色する基質を加えることを特徴と
するAFPの分画検出方法。
つてAFPを分画したものをAFP抗体結合ニトロセルロース
膜にブロツテイングにより抗体親和転写し、転写された
ニトロセルロース膜を、使用したレクチンと特異的相互
作用を有する単糖又はオリゴ糖の溶液で洗浄し、しかる
後に該膜への結合に用いた抗AFP抗体とは異なる動物種
由来の抗AFP抗体を加え、さらに、上記の動物種の免疫
グロブリンに対する抗体に酵素標識したものを加え、つ
いで該酵素によつて発色する基質を加えることを特徴と
するAFPの分画検出方法。
以下、本発明の構成をさらに詳細に説明する。
（１） レクチン含有アガロースゲルによる電気泳動 レクチンとしては、コンカナバリン（Ａ（Con−Ａ）、
レンズマメレクチンＡ（LCA−Ａ）、赤血球凝集性イン
ゲンマメレクチン（Ｅ−PHA）などが用いられる。アガ
ロースゲルは通常のアガロース（Litex LSBなど）をpH
8.6、イオン強度0.025のベロナール緩衝液に溶解して作
成した厚さ1mm程度のゲルで、これにレクチンが含有さ
れる。レクチンの添加量としてはアガロースゲル1ml当
りCon−Ａで0.6〜1.0mg/ml、LCA−Ａで0.2mg/ml前後、
Ｅ−PHAで0.5mg/ml前後が適当である。試料溝の大きさ
は0.8×5mm程度が適当である。電気泳動は、15V/mの定
電圧下、５℃で行なわれるが、これにより体液（血清、
腹水等）中のAFPがゲル中で分画される。
レンズマメレクチンＡ（LCA−Ａ）、赤血球凝集性イン
ゲンマメレクチン（Ｅ−PHA）などが用いられる。アガ
ロースゲルは通常のアガロース（Litex LSBなど）をpH
8.6、イオン強度0.025のベロナール緩衝液に溶解して作
成した厚さ1mm程度のゲルで、これにレクチンが含有さ
れる。レクチンの添加量としてはアガロースゲル1ml当
りCon−Ａで0.6〜1.0mg/ml、LCA−Ａで0.2mg/ml前後、
Ｅ−PHAで0.5mg/ml前後が適当である。試料溝の大きさ
は0.8×5mm程度が適当である。電気泳動は、15V/mの定
電圧下、５℃で行なわれるが、これにより体液（血清、
腹水等）中のAFPがゲル中で分画される。
（２） 抗AFP抗体結合ニトロセルロース膜の作成 抗AFP抗体としては、アクタ メデイカ オカヤマ（Act
a Med.Okayama）1984年第38巻第409〜413頁に記載され
たものが用いられる。これをアフイニテイ・クロマトグ
ラフイーで精製して用いる場合には、100μg/mlの抗体
を含む10mlのトリス塩酸緩衝液（pH7.5）にニトロセル
ロース膜（５×9.2cm）を30分間浸漬して結合させる。
高純度の抗体は、1mg当り200μｇ以上のAFPを結合する
が、純度の低い抗体でも、その力価に応じて使用量を増
加させることにより使用できる。
a Med.Okayama）1984年第38巻第409〜413頁に記載され
たものが用いられる。これをアフイニテイ・クロマトグ
ラフイーで精製して用いる場合には、100μg/mlの抗体
を含む10mlのトリス塩酸緩衝液（pH7.5）にニトロセル
ロース膜（５×9.2cm）を30分間浸漬して結合させる。
高純度の抗体は、1mg当り200μｇ以上のAFPを結合する
が、純度の低い抗体でも、その力価に応じて使用量を増
加させることにより使用できる。
ニトロセルロース膜に結合した抗AFP抗体は、グルタル
アルデヒドの蒸気に30分さらすことにより固定化され
る。未反応のアルデヒド基は水素化ホウ素ナトリウムに
より還元、不活性化される。
アルデヒドの蒸気に30分さらすことにより固定化され
る。未反応のアルデヒド基は水素化ホウ素ナトリウムに
より還元、不活性化される。
タンパク質のニトロセルロース膜への非特異的吸着を防
ぐためには、３％のゼラチンも用いられるが２％のツイ
ーン（Tween）20で２分、又は0.5％のツイーン20で30分
処理することにより同時に感度も増加させ得る。
ぐためには、３％のゼラチンも用いられるが２％のツイ
ーン（Tween）20で２分、又は0.5％のツイーン20で30分
処理することにより同時に感度も増加させ得る。
処理の終つた抗AFP抗体結合ニトロセルロース膜は、ト
リス塩酸緩衝液で洗浄後、減圧乾燥して４℃で保存す
る。
リス塩酸緩衝液で洗浄後、減圧乾燥して４℃で保存す
る。
（３） アガロースゲルから抗AFP抗体結合ニトロセル
ロース膜への転写 電気泳動処理の終つたアガロースゲルと、抗AFP抗体結
合ニトロセルロース膜とを密着させ、1cm2当り10g程度
の圧力を加えて20分程度放置することにより、AFPをア
ガロースゲルからニトロセルロース膜へ転写する。従
来、ここで電気転写が用いられていたが、毛細管現象に
よるブロツテイングを利用した本発明の抗体親和転写法
の方が感度が良い。転写後、使用したレクチンと特異的
相互作用を有する単糖又はオリゴ糖の溶液、すなわち、
Con−ＡおよびLCA−Ａに対しては0.2モルのα−メチル
−Ｄ−マンノシド、グルコース、マンノース、マルトー
スなどでニトロセルロース膜を洗浄する。とくに、Con
−Ａの場合は、α−メチル−Ｄ−マンノシドが適してい
る。これは、純度が低い抗AFP抗体を用いたときには、
ニトロセルロース膜の非特異発色によるバツクグラウン
ドが高いので、これを低減するために重要であり、ま
た、純度が高い抗AFP抗体を用いたときにも、分離され
たAFPのレクチン親和性の差によつて発色の濃度が異な
るという現象を避けることができる。
ロース膜への転写 電気泳動処理の終つたアガロースゲルと、抗AFP抗体結
合ニトロセルロース膜とを密着させ、1cm2当り10g程度
の圧力を加えて20分程度放置することにより、AFPをア
ガロースゲルからニトロセルロース膜へ転写する。従
来、ここで電気転写が用いられていたが、毛細管現象に
よるブロツテイングを利用した本発明の抗体親和転写法
の方が感度が良い。転写後、使用したレクチンと特異的
相互作用を有する単糖又はオリゴ糖の溶液、すなわち、
Con−ＡおよびLCA−Ａに対しては0.2モルのα−メチル
−Ｄ−マンノシド、グルコース、マンノース、マルトー
スなどでニトロセルロース膜を洗浄する。とくに、Con
−Ａの場合は、α−メチル−Ｄ−マンノシドが適してい
る。これは、純度が低い抗AFP抗体を用いたときには、
ニトロセルロース膜の非特異発色によるバツクグラウン
ドが高いので、これを低減するために重要であり、ま
た、純度が高い抗AFP抗体を用いたときにも、分離され
たAFPのレクチン親和性の差によつて発色の濃度が異な
るという現象を避けることができる。
（４） 第二抗体の結合 転写、洗浄の終つたニトロセルロース膜をAFPに対する
第二抗体の溶液で処理する。第二抗体としては、最初に
ニトロセルロース膜に結合させた抗AFP抗体とは別の動
物種のもの、たとえば第一抗体がウマであれば第二抗体
はウサギのものを用いる。この抗体は市販の抗AFPグロ
ブリンを250〜1000倍、好ましくは500倍にトリス塩酸緩
衝液（１％ゼラチン又は0.05％ツイーン20を含む）で希
釈したものを用いる。
第二抗体の溶液で処理する。第二抗体としては、最初に
ニトロセルロース膜に結合させた抗AFP抗体とは別の動
物種のもの、たとえば第一抗体がウマであれば第二抗体
はウサギのものを用いる。この抗体は市販の抗AFPグロ
ブリンを250〜1000倍、好ましくは500倍にトリス塩酸緩
衝液（１％ゼラチン又は0.05％ツイーン20を含む）で希
釈したものを用いる。
（５） 標識抗体の結合 第二抗体としてウサギ抗AFPグロブリン（IgG）を用いた
場合、これを検出するためにパーオキシダーゼで標識し
たヤギ抗ウサギIgG抗体を加える。この抗体は500倍〜20
00倍、好ましくは1000倍にトリス塩酸緩衝液で希釈して
用いる。
場合、これを検出するためにパーオキシダーゼで標識し
たヤギ抗ウサギIgG抗体を加える。この抗体は500倍〜20
00倍、好ましくは1000倍にトリス塩酸緩衝液で希釈して
用いる。
（７） AFPバンドの検出 AFPの検出にはパーオキシダーゼにより発色する基質を
加えれば良く、0.025％ジアミノベンジジン（0.05モル
トリス塩酸、pH7.6）及び0.005％過酸化水素、0.05％４
−クロロ−１−ナフトール（メタノール加トリス塩酸）
及び0.015％過酸化水素、又は0.02％４−メトキシ−１
−ナフトール（メタノール加トリス塩酸）及び0.005％
過酸化水素などが用いられる。発色したバンドは肉眼観
察又はデンシトメーターでの定量によりAFP濃度が測定
できる。
加えれば良く、0.025％ジアミノベンジジン（0.05モル
トリス塩酸、pH7.6）及び0.005％過酸化水素、0.05％４
−クロロ−１−ナフトール（メタノール加トリス塩酸）
及び0.015％過酸化水素、又は0.02％４−メトキシ−１
−ナフトール（メタノール加トリス塩酸）及び0.005％
過酸化水素などが用いられる。発色したバンドは肉眼観
察又はデンシトメーターでの定量によりAFP濃度が測定
できる。
したがつて、（ｉ）レクチン含有アガロースゲル、（i
i）抗AFP抗体結合ニトロセルロース膜、（iii）該レク
チンと特異的相互作用を有する単糖又はオリゴ糖の溶
液、（iv）該抗AFP抗体とは異なる動物種由来の抗AFP抗
体、（ｖ）（iv）で用いる動物種の免疫グロブリンに対
する抗体に酵素標識したものおよび（vi）（ｖ）の酵素
によつて発色する基質をセツトとして分折者に提供する
ことにより、AFPの検出が便利に行われる。
i）抗AFP抗体結合ニトロセルロース膜、（iii）該レク
チンと特異的相互作用を有する単糖又はオリゴ糖の溶
液、（iv）該抗AFP抗体とは異なる動物種由来の抗AFP抗
体、（ｖ）（iv）で用いる動物種の免疫グロブリンに対
する抗体に酵素標識したものおよび（vi）（ｖ）の酵素
によつて発色する基質をセツトとして分折者に提供する
ことにより、AFPの検出が便利に行われる。
（発明の効果） 本発明により、低濃度のAFPが少量のサンプルで検出可
能となつた。後述の実施例に示す最良の結果では、AFP4
ng/mlの試料３μを0.5×6mmの試料溝に添加すること
により検出されている。すなわちAFP4pg/mm2の存在を検
出できる。
能となつた。後述の実施例に示す最良の結果では、AFP4
ng/mlの試料３μを0.5×6mmの試料溝に添加すること
により検出されている。すなわちAFP4pg/mm2の存在を検
出できる。
従来の無処理ニトロセルロース膜への転写法では、血清
検体あるいはレクチンを含むゲルを用いての電気泳動の
ように多量の他の蛋白質が存在する時にはAFPの定量的
な転写ができなく、また、電気転写では感度が低かつた
が、本発明では前述のようにブロツテイングによる抗体
親和転写を採用しているのでAFPの定量的転写が可能と
なり、また、本発明では従来から知られている抗体親和
転写法に比し、転写後のニトロセルロース膜をレクチン
と相互作用を有する単糖またはオリゴ糖の溶液で洗條す
るので、レクチンの存在によりニトロセルロース膜上の
反応でレクチン結合性AFPがレクチン非結合性AFPに比べ
て発色が強くなるという問題もなくなり、また、純度の
低い抗AFP抗体を用いたときの発色段階における高いバ
ツクグランドを低減させることもできる。
検体あるいはレクチンを含むゲルを用いての電気泳動の
ように多量の他の蛋白質が存在する時にはAFPの定量的
な転写ができなく、また、電気転写では感度が低かつた
が、本発明では前述のようにブロツテイングによる抗体
親和転写を採用しているのでAFPの定量的転写が可能と
なり、また、本発明では従来から知られている抗体親和
転写法に比し、転写後のニトロセルロース膜をレクチン
と相互作用を有する単糖またはオリゴ糖の溶液で洗條す
るので、レクチンの存在によりニトロセルロース膜上の
反応でレクチン結合性AFPがレクチン非結合性AFPに比べ
て発色が強くなるという問題もなくなり、また、純度の
低い抗AFP抗体を用いたときの発色段階における高いバ
ツクグランドを低減させることもできる。
（実施例） （ｉ） 抗体結合膜の調製 ヒトAFPに対する純化ポリクロナールウマ抗体（またはI
gG分画、とくにことわらない場合はウマ抗体）100μg/m
lを含むTBS（20mM Tris−HCl、pH7.5、500mM NaCl）10m
l溶液中でニトロセルロース膜（５×9.2cm、Bio−Rad L
ab製、以下NC膜という。）を処理した。30分間処理を行
なつた後、紙で膜をぬぐい、さらに膜を30分間グルタ
ルアルデヒド蒸気にさらした後、0.02％NaBH4−TBS溶液
で中和処理した。ついで、該膜にTBS洗滌、0.5％ツイー
ン−20のTBS溶液（またはゼラチンのTBS溶液、とくにこ
とわらない場合はツイーン−20のTSB溶液）によるブロ
ツク（30分間）、TBS洗條を行ない、該膜を真空乾燥
し、４℃で保存した。
gG分画、とくにことわらない場合はウマ抗体）100μg/m
lを含むTBS（20mM Tris−HCl、pH7.5、500mM NaCl）10m
l溶液中でニトロセルロース膜（５×9.2cm、Bio−Rad L
ab製、以下NC膜という。）を処理した。30分間処理を行
なつた後、紙で膜をぬぐい、さらに膜を30分間グルタ
ルアルデヒド蒸気にさらした後、0.02％NaBH4−TBS溶液
で中和処理した。ついで、該膜にTBS洗滌、0.5％ツイー
ン−20のTBS溶液（またはゼラチンのTBS溶液、とくにこ
とわらない場合はツイーン−20のTSB溶液）によるブロ
ツク（30分間）、TBS洗條を行ない、該膜を真空乾燥
し、４℃で保存した。
（ii） 電気泳動 バルビタール／バルビタールソーダのゲル緩衝液（イオ
ン強度0.025、pH8.6）で、レクチン添加のもとで、ゲル
ボンドフイルム（FMC製）上に調製した1mm厚のアガロー
スゲル板（１％Litex、LSB）中で以下の条件で電気泳動
を行なつた。すなわち、0.8×５×１サイズのサンプル
溝に適度に希釈したAFP試料４μを入れ、電子冷却泳
動槽中で、バルビタール／バルビタールソーダ（イオン
強度0.05、pH8.6）を電極緩衝液として15V/cmの定電圧
下５℃で行つた。なお、AFPの希釈はBPBを含むゲル緩衝
液で行い、BPBの最終濃度を0.05％に調製した。
ン強度0.025、pH8.6）で、レクチン添加のもとで、ゲル
ボンドフイルム（FMC製）上に調製した1mm厚のアガロー
スゲル板（１％Litex、LSB）中で以下の条件で電気泳動
を行なつた。すなわち、0.8×５×１サイズのサンプル
溝に適度に希釈したAFP試料４μを入れ、電子冷却泳
動槽中で、バルビタール／バルビタールソーダ（イオン
強度0.05、pH8.6）を電極緩衝液として15V/cmの定電圧
下５℃で行つた。なお、AFPの希釈はBPBを含むゲル緩衝
液で行い、BPBの最終濃度を0.05％に調製した。
（iii） 抗体親和転写 電気泳動後のアガロースゲルを、TBSを含浸させた抗体
結合NC膜と密着させ、ロ紙パツドを用いて1cm2当り10g
程度の圧力を20分加えることにより、AFPをアガロース
ゲルからニトロセルロース膜へブロツテイングにより転
写させた。0.2Mのα−メチル−Ｄ−マンノシドを加えた
緩衝液（0.05％ツイーン20−TBS溶液）10mlで２回洗條
後、30分間ヒトAFPに対するウサギ免疫グロブリン（DAK
O−イムノグロブリン製）で処理した。このウサギグロ
ブリンはトリス塩酸緩衝液（１％ゼラチン含有）で500
倍に希釈してある。処理した膜に対し、緩衝液を用いて
10分間洗條を２回行い、ついでこの膜を、緩衝液で1000
倍に希釈したアフイニテイクロマトで純化されたヤギの
抗ウサギIgG−HRP抗体10ml中で30分間処理した。
結合NC膜と密着させ、ロ紙パツドを用いて1cm2当り10g
程度の圧力を20分加えることにより、AFPをアガロース
ゲルからニトロセルロース膜へブロツテイングにより転
写させた。0.2Mのα−メチル−Ｄ−マンノシドを加えた
緩衝液（0.05％ツイーン20−TBS溶液）10mlで２回洗條
後、30分間ヒトAFPに対するウサギ免疫グロブリン（DAK
O−イムノグロブリン製）で処理した。このウサギグロ
ブリンはトリス塩酸緩衝液（１％ゼラチン含有）で500
倍に希釈してある。処理した膜に対し、緩衝液を用いて
10分間洗條を２回行い、ついでこの膜を、緩衝液で1000
倍に希釈したアフイニテイクロマトで純化されたヤギの
抗ウサギIgG−HRP抗体10ml中で30分間処理した。
得られた膜を0.025％3,3′−ジアミノベンチデイン テ
トラハイドロクロライドと0.005％H2O2の0.05Mトリス塩
酸溶液、0.05％４−クロロ−１−ナフトールのTBS溶液
（メタノールと0.015％H2O2添加）、または0.02％４−
メトキシ−１−ナフトールの0.05M Tris−HCl溶液（メ
タノールと0.005％H2O2添加）の中で30分間処理するこ
とにより発色した。（とくに記さない場合は3,3′−ジ
アミノベンチデインを使用）抗体親和転写およびこれに
つづく処理は25℃で行つた。発色後、膜は水洗、デカリ
ン処理して、アタゴ製のクイツクデンシトメーターを用
い、500nmでデンシトメトリーを行つた。
トラハイドロクロライドと0.005％H2O2の0.05Mトリス塩
酸溶液、0.05％４−クロロ−１−ナフトールのTBS溶液
（メタノールと0.015％H2O2添加）、または0.02％４−
メトキシ−１−ナフトールの0.05M Tris−HCl溶液（メ
タノールと0.005％H2O2添加）の中で30分間処理するこ
とにより発色した。（とくに記さない場合は3,3′−ジ
アミノベンチデインを使用）抗体親和転写およびこれに
つづく処理は25℃で行つた。発色後、膜は水洗、デカリ
ン処理して、アタゴ製のクイツクデンシトメーターを用
い、500nmでデンシトメトリーを行つた。
（iv） 実験結果 抗体親和転写の効果を第１図に示す。第１図において、
▲は抗体結合NC膜にブロツテイングにより転写された、
日本AFP標準液（100ng AFP/mg牛血清アルブミン）中のA
FPを示し、●は比較のため抗体を結合していなNC膜に転
写した、日本AFP標準液（100ngAFP/mg牛血清アルブミ
ン）中のAFPを示し、また○も比較のために抗体が結合
していないNC膜に転写した精製AFP〔AFP不含血清に添加
（57ngAFP/mg血清タンパク）〕を示す。第１図の結果か
ら、抗体結合NC膜を用いてブロッテイングした場合
（▲）には、抗体を結合していないNC膜を用いた場合
（●及び○）に比較してAFPを高感度に検出し得ること
が判る。
▲は抗体結合NC膜にブロツテイングにより転写された、
日本AFP標準液（100ng AFP/mg牛血清アルブミン）中のA
FPを示し、●は比較のため抗体を結合していなNC膜に転
写した、日本AFP標準液（100ngAFP/mg牛血清アルブミ
ン）中のAFPを示し、また○も比較のために抗体が結合
していないNC膜に転写した精製AFP〔AFP不含血清に添加
（57ngAFP/mg血清タンパク）〕を示す。第１図の結果か
ら、抗体結合NC膜を用いてブロッテイングした場合
（▲）には、抗体を結合していないNC膜を用いた場合
（●及び○）に比較してAFPを高感度に検出し得ること
が判る。
また、上述した如く●と○では、使用したAFPを含む試
料中のタンパク質の種類及びタンイクパク質濃度が異な
っている。即ち、●ではタンパク質として牛血清アルブ
ミンを含有する日本AFP標準液を、また、○では血清タ
ンパク質を含有する精製AFP（タンパク質濃度は日本AFP
標準液の約２倍。）を試料としている。これらのことと
●と○の結果の比較から、抗体を結合していないNC膜を
用いる方法では、血清タンパク質が共存するとAFPの検
出がほとんど不可能となることが判る。
料中のタンパク質の種類及びタンイクパク質濃度が異な
っている。即ち、●ではタンパク質として牛血清アルブ
ミンを含有する日本AFP標準液を、また、○では血清タ
ンパク質を含有する精製AFP（タンパク質濃度は日本AFP
標準液の約２倍。）を試料としている。これらのことと
●と○の結果の比較から、抗体を結合していないNC膜を
用いる方法では、血清タンパク質が共存するとAFPの検
出がほとんど不可能となることが判る。
第２図に転写されたAFPを0.2Mα−メチル−Ｄ−マンノ
シドで洗條する効果を示す。○は洗條する場合、△は比
較のために洗條しない場合を示し、第２図からNC膜に結
合させる抗体が精製されていない場合には、洗條効果が
非常に大きいことが明らかである。
シドで洗條する効果を示す。○は洗條する場合、△は比
較のために洗條しない場合を示し、第２図からNC膜に結
合させる抗体が精製されていない場合には、洗條効果が
非常に大きいことが明らかである。
第３図に純化抗体を用いた場合Con−Ａの存在下で分離
されたAFPのCon−Ａ反応性およびCon−Ａ非反応性分子
種の染色強度に及ぼすα−メチル−Ｄ−マンノシド洗條
の効果を示した。洗條によりCon−Ａ反応性、非反応性
いずれも他の方法で求めた理論値に近い発色を示してい
る。とくに、洗條によりCon−Ａ非反応性分子種のもの
もCon−Ａ反応性分子種のものと同程度に染色されるよ
うになることは注目すべきことである。
されたAFPのCon−Ａ反応性およびCon−Ａ非反応性分子
種の染色強度に及ぼすα−メチル−Ｄ−マンノシド洗條
の効果を示した。洗條によりCon−Ａ反応性、非反応性
いずれも他の方法で求めた理論値に近い発色を示してい
る。とくに、洗條によりCon−Ａ非反応性分子種のもの
もCon−Ａ反応性分子種のものと同程度に染色されるよ
うになることは注目すべきことである。
第４図にAFPバンドの発色強度におよぼす、ブロツキン
グ剤のツイーン−20とゼラチンとの比較を示す。●は2.
0％ツイーン20によるブロツクを示し、○は3.0％ゼラチ
ンによるブロツクを示す。第４図から明らかな如く、ブ
ロッキング剤としてツイーン20を用いたときの方が、ゼ
ラチンをブロッキング剤として用いた場合よりもAFPバ
ンドの発色強度が高くなっていることが判る。このこと
から、ブロッキング剤としてゼラチンを用いることもで
きるが、ツイーン20の方が優れていることが判る。
グ剤のツイーン−20とゼラチンとの比較を示す。●は2.
0％ツイーン20によるブロツクを示し、○は3.0％ゼラチ
ンによるブロツクを示す。第４図から明らかな如く、ブ
ロッキング剤としてツイーン20を用いたときの方が、ゼ
ラチンをブロッキング剤として用いた場合よりもAFPバ
ンドの発色強度が高くなっていることが判る。このこと
から、ブロッキング剤としてゼラチンを用いることもで
きるが、ツイーン20の方が優れていることが判る。
第１表にIgG分画および純化抗体を用いた場合のそれぞ
れについて単糖類および二糖類による洗條効果を示す。
尚、表１中、AFP−0/AFP−０＋AFP−１は、Con−Ａ非結
合性のAFP（AFP−０）／全AFP〔Con−Ａ非結合性のAFP
（AFP−０）＋Con−Ａ結合性のAFP（AFP−１）〕の値を
示し、この値が増加するということは、AFP−０の強度
がAFP−１に対して相対的に増加していることを表す。
れについて単糖類および二糖類による洗條効果を示す。
尚、表１中、AFP−0/AFP−０＋AFP−１は、Con−Ａ非結
合性のAFP（AFP−０）／全AFP〔Con−Ａ非結合性のAFP
（AFP−０）＋Con−Ａ結合性のAFP（AFP−１）〕の値を
示し、この値が増加するということは、AFP−０の強度
がAFP−１に対して相対的に増加していることを表す。
第１表の結果から明らかな如く、IgG分画の場合には、
洗條によりバツクグラウンドが低下しており、また、Ig
G分画および純化抗体いずれの場合にも、洗條によりAFP
−０の強度がAFP−１に対して相対的に増加しているこ
と、即ち、AFP−0/AFP−０＋AFP−１の値が増加してい
ることが認められる。
洗條によりバツクグラウンドが低下しており、また、Ig
G分画および純化抗体いずれの場合にも、洗條によりAFP
−０の強度がAFP−１に対して相対的に増加しているこ
と、即ち、AFP−0/AFP−０＋AFP−１の値が増加してい
ることが認められる。
第５図にHRP反応における種々の基質による発色を示
す。AFPとしては日本AFP標準を用い、AFPの最低レベル
は4pg/mm2であつた。反応時間は４−メトキシ−１−ナ
フトールの場合２分、他の場合30分であつた。これか
ら、本発明によるAFP検出が非常に高感度であることが
明らかである。
す。AFPとしては日本AFP標準を用い、AFPの最低レベル
は4pg/mm2であつた。反応時間は４−メトキシ−１−ナ
フトールの場合２分、他の場合30分であつた。これか
ら、本発明によるAFP検出が非常に高感度であることが
明らかである。
第１図は抗体結合NC膜を用いた場合と、抗体を結合して
いないNC膜を用いた場合とのAFP転写効果の違いを示す
図であり、第２図は純化していない抗AFP抗体をNC膜に
結合させた際、転写されたAFPをα−メチル−Ｄ−マン
ノシドで洗條する場合と、洗條しない場合とのAFP検出
効果の違いを示す図であり、第３図はCon−Ａ親和電気
泳動によるAFPの分離に及ぼすα−メチル−Ｄ−マンノ
シド（MM）洗條の影響を示す図である。第３図におい
て、＋MMは洗條した場合、−MMは洗條しない場合を示
す。第４図は、ツイーン−20とゼラチンのブロツク剤と
しての効果の違いを示す図であり、第５図は種々の発色
剤を用いた場合の感度を示す図である。
いないNC膜を用いた場合とのAFP転写効果の違いを示す
図であり、第２図は純化していない抗AFP抗体をNC膜に
結合させた際、転写されたAFPをα−メチル−Ｄ−マン
ノシドで洗條する場合と、洗條しない場合とのAFP検出
効果の違いを示す図であり、第３図はCon−Ａ親和電気
泳動によるAFPの分離に及ぼすα−メチル−Ｄ−マンノ
シド（MM）洗條の影響を示す図である。第３図におい
て、＋MMは洗條した場合、−MMは洗條しない場合を示
す。第４図は、ツイーン−20とゼラチンのブロツク剤と
しての効果の違いを示す図であり、第５図は種々の発色
剤を用いた場合の感度を示す図である。
Claims (5)
- 【請求項１】（ｉ）レクチン含有アガロースゲル （ii）抗α−フエトプロテイン抗体結合ニトロセルロー
ス膜 （iii）該レクチンと特異的相互作用を有する単糖また
はオリゴ糖の溶液 （iv）該抗α−フエトプロテイン抗体とは異なる動物種
由来の抗α−フエトプロテイン抗体 （ｖ）（iv）で用いる動物種の免疫グロブリンに対する
抗体に酵素標識したものおよび （vi）（ｖ）の酵素によつて発色する基質からなるα−
フエトプロテインの分画検出試薬キツト。 - 【請求項２】該レクチンがコンカナバリンＡ、レンズマ
メレクチンＡまたは赤血球凝集性インゲンマメレクチン
である特許請求の範囲第１項記載の分画検出試薬キツ
ト。 - 【請求項３】該単糖がα−メチル−Ｄ−マンノシツド、
グルコースまたはマンノースである特許請求の範囲第１
項記載の分画検出試薬キツト。 - 【請求項４】該オリゴ糖がマルトースである特許請求の
範囲第１項記載の分画検出試薬キツト。 - 【請求項５】レクチン含有アガロースゲルにて電気泳動
を行つてα−フエトプロテインを分画したものを抗α−
フエトプロテイン抗体結合ニトロセルロース膜にブロツ
テイングにより抗体親和転写し、転写されたニトロセル
ロース膜を、使用したレクチンと特異的相互作用を有す
る単糖又はオリゴ糖の溶液で洗浄し、しかる後に該膜へ
の結合に用いた抗α−フエトプロテイン抗体とは異なる
動物種由来の抗α−フエトプロテイン抗体を加え、さら
に、上記の動物種の免疫グロブリンに対する抗体に酵素
標識したものを加え、ついで該酵素によつて発色する基
質を加えることを特徴とするα−フエトプロテインの分
画検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12396985A JPH06100604B2 (ja) | 1985-06-06 | 1985-06-06 | α−フェトプロテインの分画検出試薬キットおよび分画検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12396985A JPH06100604B2 (ja) | 1985-06-06 | 1985-06-06 | α−フェトプロテインの分画検出試薬キットおよび分画検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61292062A JPS61292062A (ja) | 1986-12-22 |
| JPH06100604B2 true JPH06100604B2 (ja) | 1994-12-12 |
Family
ID=14873795
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12396985A Expired - Lifetime JPH06100604B2 (ja) | 1985-06-06 | 1985-06-06 | α−フェトプロテインの分画検出試薬キットおよび分画検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06100604B2 (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19806185C2 (de) * | 1998-02-02 | 1999-11-18 | Biogenes Gmbh | Immunoassay und Testkit zur Bestimmung von fucosyliertem Protein in einer biologischen Probe |
| WO2003088990A1 (en) * | 2002-04-15 | 2003-10-30 | American National Red Cross | Plasma protein-binding ligands |
| CN100588942C (zh) * | 2006-09-13 | 2010-02-10 | 北京热景生物技术有限公司 | 检测肝癌甲胎蛋白异质体的预装离心柱及含有该离心柱的试剂盒 |
| WO2009048196A1 (en) * | 2007-10-08 | 2009-04-16 | Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology | An identification method of glycoproteins using a specific lectin precipitation |
| CN102353791A (zh) * | 2011-06-30 | 2012-02-15 | 倪润洲 | 一种分离检测afp亚型的新方法 |
| US10527615B2 (en) | 2012-04-27 | 2020-01-07 | Konica Monolta, Inc. | Antigen detection method which uses lectin and comprises enzyme treatment step |
| JP6414078B2 (ja) | 2013-12-27 | 2018-10-31 | コニカミノルタ株式会社 | 診断用情報の分析方法およびそのためのキット |
| EP3088895A4 (en) | 2013-12-27 | 2017-08-09 | Konica Minolta, Inc. | Method for analyzing information for diagnosis and kit therefor |
| WO2015194350A1 (ja) | 2014-06-20 | 2015-12-23 | コニカミノルタ株式会社 | 標識化レクチンを用いるサンドイッチ型アッセイおよびそのためのキット |
-
1985
- 1985-06-06 JP JP12396985A patent/JPH06100604B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61292062A (ja) | 1986-12-22 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |