JPH03199968A - 大便中のランブル鞭毛虫特異的抗原，それに対する単一特異性抗体，およびランブル鞭毛虫症の診断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、大便中の高純度、のランブル鞭毛虫（シアル
シア・ランプリア、　Ｇｉａｒｄｉａ　Ｉａｍｂｌｉａ
　）特異的抗原（ＧＳＡ６５）、およびそれに対る、特
異的なポリクローナル単一特異性抗体に関る、。さらに
本発明は、ランブル鞭毛虫によって起こるヒト感染症の
診断法に関る、。

（従来の技術） ランブル鞭毛虫はヒトの小腸に生息る、原生動物である
寄生虫である。これは、米国において明らかにされた飲
料水媒介の下痢を引き起こす最も一般的な原因であり、
特に、子供に下痢が広範囲で大発生している場合は、シ
アルシア（Ｇｉａｒｄｉａ）で汚染された水、およびヒ
トからヒトへの伝染によって生じる。この疾病はランブ
ル鞭毛虫症と呼ばれている。

ランブル鞭毛虫症は、従来、大便中、または観梅法で小
腸から取出された物質中のランブル鞭毛虫の包嚢もしく
は栄養体を顕微鏡で検出る、ことによって診断されてい
る。卵と寄生虫（０＆Ｐ）についての大便の顕微鏡検査
によるランブル鞭毛虫感染の診断法は１面倒な方法であ
る。シアルシア検出の感度を高めるために、大便試料を
調製る、ための種々の標準法が実施された後でも、０＆
Ｐの顕微鏡検査の感度は、各調製物を調べる顕微鏡検査
員の熟練度に左右される。大便検査の診断成功率は、大
体５０〜７０％である。その上、感染性の包嚢は、シア
ルシアに感染しているにもかかわらず。

必ずしも排泄されないので、確実な診断結果が得られな
い大便検査を多数しなければならない。

近年、ランブル鞭毛虫症の診断法の感度を改善る、努力
がなされている。これらの努力の中心は。

主として、抗シアルシア抗体の血清学的検査と。

患者の大便試料中のシアルシア抗体の検出である。

血清学的試験は、シアルシアの診断にはほとんど価値が
ないことが立証されている。その理由は。

陽性の抗シアルシア抗体の力価と、活性ジアルジア感染
症の存在との間にほとんど相関関係がないからである。

微生物の抗原との交差反応も問題を起こしている。

大便の抗体検出試験は血清学的方法よりは成功しており
、　Ｃｒａｆｔ、　Ｊ、Ｃ，ら（Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、　
Ｄｉｓ、１４５：４９９−５０４．１９８２年）は、大
便中のジー・ランプリア（Ｇ、ｌａｍｂｌｉａ）特異的
抗原の検出に、ジー・ランプリア包嚢に対して調製した
ラビット抗血清によるカウンター免疫電気泳動法を利用
る、ことを報告している。Ｖｉｎａｙａｋ、　Ｖ、　Ｋ
、ら（Ｐｅｄｉａｔｒ、　Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｄｉｓ、、　４　：　３８３−３８６．１９８５年）は
、患者の大便中のシアルシア抗原に関る、ＣＩＢ試験で
、培養で増殖させた栄養体に対る、ラビット抗血清を利
用る、ことを教示している。Ｕｎｇａｒ、　Ｌ、　Ｐ、
ら（Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｄｉｓ、、　１４９　：　９０−９７．１９８４年）は
、大便中のシアルア抗原を検出る、ための抗原捕獲酵素
結合免疫吸着検定法（Ｅ！ＬＩＳＡ）の遂行において、
培養物中で増殖させた栄養体に対して調製したラビット
とヤギの抗血清を使用る、ことを説明している。Ｇｒｅ
ｅｎ。

１３、　Ｌ、ら化ａｎｃｅｔ、　ｉｉ　：　６９１−６
９３．１９８５年）は、培養で増殖させた栄養体と包嚢
に対して調製した抗血清を用いて、抗原捕獲ＢＬＩＳＡ
法を同様に説明してＭｉｃｒｏ、、　２７：　４３１−
４３５．１９８９年）；および５ｔｉｂｂｓ。

Ｈ，Ｈ，ら（Ｊ、　ＣＩｉｎ９Ｃｌ１ｎ９．．２６：１
６６５−１６６９．１９８８年）は、ごく最近、シアル
シアの感染の検出に用いる免疫検定法を報告している。

感度が良好であるにもかかわらず、上記の試験法にはい
くつかの問題がある。第一に、これらの試験法では１通
常全ランブル鞭毛虫の栄養体および／または包嚢に対る
、。ポリクローナル多特異性抗体が使用され、そしてこ
の抗体と、他の胃腸寄生虫との交差反応関係が起こる。

さらに、これらのポリクローナル多特異性抗体に基づく
検定法で標的とされるほとんどの抗原は、０＆Ｐ顕微鏡
検査用もしくは大便培養用の大便試料の収集、移送。

および貯蔵に用いる従来の実験室用の固定液と培地に対
して不安定である。このため、このような免疫検定法は
、未処理の大便試料を使用る、必要があり、そのため既
存の大便収集法に制限が課される。

本発明の発明者は、ランブル鞭毛虫症の診断に有用な大
便中のランブル鞭毛虫特異的抗原（ＧＳＡ　６５）の同
定をすでに報告している（Ｒｏｓｏｆｆ、　Ｊ、　Ｄ、
ら。

Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏ、、　２３（５）：９０
５−９１０．　１９８６年（■））。

さらに、その抗原は物理的および化学的に特徴付けられ
る（Ｒｏｓｏｆｆ、　　Ｊ、　　Ｄ、ら、　　Ｊ、ＣＩ
ｉｎｌＣｌｌｎｌ、、　　２４（６）：１０７９−１０
８３．１９８６年（■））。上記の刊行物の報告にもか
かわらず、これらの報告に記載された一般的な方法は、
　ＧＳＡ６５を得るための手順の主要部分を教示してい
ない。以下に詳細に述べるこれらの主要な工程によって
、当業者は、　ＧＳＡ　６５を単離し、そしてそれに対
る、単一特異性のポリクローナル抗体を充分に調製る、
ことができる。上記各刊行物の開示事項を１本願に援用
して１本願の開示部分によって９両列行物の欠陥を明ら
かにる、。

（発明の要旨） 本発明によって１本発明の発明者は、　＠乳類ジー・ラ
ンプリアの包嚢に対る、哺乳類起質の抗体によって、糖
タンパクＧＳＡ　６５の解離安定性（ｄｉｓｓｏｃｉａ
ｔｅｓｔａｂｌｅ）複合体を発見した。この複合体は本
発明の１つの態様を構成る、。

第２番目の態様として１本発明の発明者は、この安定な
複合体が次のようにして形成されるのを見い出した。Ｇ
ＳＡ　６５抗原の不純溶液を、＠乳類ジー・ランプリア
包嚢に対る、抗体が結合した基質と接触させて、結合複
合体からなる沈降素を形成し；基質から不純物を洗い出
し；その基質を約６５〜８０℃で約３０〜６０分間乾燥
し；そしてその後この基質を酸性の水性アルコール混合
物と接触させて結合複合体を部分的に変性させて、安定
なＧＳＡ　６５−ジー・ランプリア包嚢抗体複合体を含
有る、沈降素を生成させることによって形成される。

得られた安定なＧＳＡ　６５−包嚢抗体複合体は、＠乳
類に、特異的な免疫反応を起こさせるのに利用され得る
。この反応によって、　ＧＳＡ　６５抗原に対して単一
特異性であるポリクローナル抗体が産生される。これら
のポリクローナル単一特異性抗ＧＳＡ６５抗体は１本発
明の１つの態様である。

０ 本発明のさらに別の態様には、これらのポリクローナル
抗体を、＠乳類のジー・ランプリア感染の検定に用いる
ことと、それに基づくキットが含まれる。

本発明の別の態様では、これらのポリクローナル抗体は
、基質に固定化して、特異的な免疫吸着性基質を生成る
、ことができる。その基質は、最初に、存在る、ＧＳＡ
　６５抗原を純粋な形で選択的に単離る、。またこの抗
原は本発明の別の態様である。

本発明は、ランブル鞭毛虫症の糞便診断に有用なランブ
ル鞭毛虫特異的抗原（ＧＳＡ　６５）であって。

該抗原は、その分子量が約６５．０００であって、トリ
プシン、キモトリプシンおよびプロテアーゼによるタン
パク分解消化に抵抗性を有る、。

本発明は、精製した形のランブル鞭毛虫特異的抗原（Ｇ
ＳＡ　６５）の調製法であって、該方法は。

大便溶出液由来のランブル鞭毛虫特異的抗原（ＧＳＡ　
６５）　、　ランブル鞭毛虫の包嚢、またはランブル鞭
毛虫の栄養体と、汚染物とを含有る、部分的１ に精製した混合物を、該抗原に対して単一特異性の抗体
が結合されている基質を有る、免疫吸着カラムにかけて
、該抗原が該抗体に対して特異的なリガンドであること
から、該抗原を該基質に特異的に結合させること； 該カラムから汚染物を洗い落とすこと；そして生成した
ランブル鞭毛虫特異的抗原が、カラムに吸着しているの
をカラムから回収る、こと；を包含る、。

本発明は、ランブル鞭毛虫特異的抗原（ＧＳＡ　６５）
に対る、単一特異性抗血清の調製法であって、該方法は
。

ヒト大便由来のランブル鞭毛虫の包嚢に対る、免疫血清
を哺乳類中で調製る、こと； 該免疫血清由来の抗体を基質のマトリックス内に沈着さ
せること； 該基質を、ランブル鞭毛虫特異的抗原を含む哺乳類の大
便を含有る、溶液で処理し、その結果。

ＧＳ＾６５抗原と、ヒト・ランブル鞭毛虫の包嚢に対る
、抗体との複合体を形成る、こと： ２ 該基質から不純物を洗い出すこと； 該基質を約３０〜６０分間乾燥る、こと；該乾燥基質を
、酸性の水性アルコール混合物で洗浄し、該結合した複
合体を部分的に変性し、安定なＧＳＡ　６５ランブル鞭
毛虫包嚢抗体沈降素を生成させること； 該沈降素を該基質から取出すこと； 該沈降素を哺乳類に導入る、こと；そしてランブル鞭毛
虫特異的抗原（ＧＳＡ６５）に対る、。

生成した単一特異性抗血清を含有る、哺乳類の血清を回
収る、こと。

を包含る、。

本発明は、哺乳類におけるランブル鞭毛虫症の糞便診断
法であって、該方法は。

大便試料の溶出液を調製る、こと； 該溶出液を、ランブル鞭毛虫に対る、単一特異性抗血清
と接触させて、ランブル鞭毛虫の存在下で複合体を得る
こと；そして 前記複合体の生成を検出る、こと； を包含る、。

３ 本発明は、ｌ１ｉｉ乳類におけるランブル鞭毛虫症の糞
便診断法であって、該方法は。

大便試料の溶出液を調製る、こと； 該大便試料の溶出液を、ランブル鞭毛虫に対る、単一特
異性抗血清でプレコートした固相基質に添加して、結合
体を得ること； 過剰の溶出液を固相基質から洗い出すこと；該結合体と
免疫反応性を有る、標識抗体を基質に添加して、該抗体
を結合体に結合させること；未結合の標識抗体を該基質
から洗い出すこと；そして。

該基質上の標識抗体を検出る、こと； を包含る、。

本発明の、単離された大便中のＧＳＡ　６５シアルシア
特異的抗原と、それに対る、単一特異性抗ＧＳＡ６５抗
体は、ランブル鞭毛虫症の糞便診断に有用である。この
ような抗原の同定と特性決定を行うことによって、大便
中のシアルシア抗原に対る、検定法を標準化る、ことが
できる。

その結果、迅速で正確な、ランブル鞭毛虫症の４ 診断法が得られる。この方法によれば、標準の０＆Ｐ試
験法によって陰性と判定されている大便中にＧＳＡ６５
を検出る、ことができる。さらに、　ＧＳＡ　６５は。

他の腸内原生動物との交差反応性をほとんど示さない。

また１本発明の方法は、大便試料の収集。

移送および貯蔵に用いられる従来の固定液および媒体に
よる悪影響を受けない。

本発明の他の特徴と利点は９発明の構成の下記説明と、
特許請求の範囲とから明らかになるであろう。

（以下余白） ５ （発明の構成） 前記刊行物（１）および（Ｉ［）に述べられているよう
に、ジー・ランプリア（ＷＢ菌株、　ＡＴＣＣ３０９５
７）。

トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ期
１μ状堕局所単離物ＨＭＣ−１、発明者の命名）、ペン
タトリコモナス・ホミニス（Ｐｅｎｔａｔｒｉｃｈｏｍ
ｏｎａｓ　ｈｏｌＩｌｉｎｉｓ。

Ｄｉａｍｏｎｄ菌株、　ＡＴＣＣ３００００）　、およ
びエンタモーバ・ヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ　
ｈｉｓｔｏｌ　ｔｉｃａ）（Ｎｌ■２００菌株、　ＡＴ
ＣＣ３０４５８）の栄養体の寄生虫培養は。

次の文献に記載されているように３７°Ｃで無菌状態で
行われた：　Ｅｉｎｆｅｌｄ、　Ｄ、Ｅ、ら（Ｉｎｆｅ
ｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ。

４６　：　３７７−３８３．１９８４年）；Ｔｏｒｉａ
ｎ、　Ｂ、Ｅ、ら、　　（Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｓ＋ｍｕｎ、　　４６：１５２−１５８．１９８４年
）；およびＤｉａｍｏｎｄ。

Ｌ、Ｓ、ら（Ｔｒａｎｓ、　ＲｏＳｏｃ、　Ｔｒｏ　、
　Ｍｅｄ　　Ｈ、７２：４３１−４３２　、１９７８年
）。培養物はすべて、抗生物質なしの培地で増殖された
。リーシュマニア・ドノバーニ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ
　ｄｏｎｏｖａｎｉ　）プロマスティボートは、　　５
ｔｅｖｅｎ　Ｒｅｅｄ　　（Ｉｓｓａｑｕａｈ　Ｈｅａ
ｌｔｈ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ６ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ｌ５ｓａｑｕａｈ、　Ｗａｓ
ｈ）から寄贈された。

カンデダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）は。

ゆるくふたをした垂直のホウケイ酸ガラス管内のサブロ
ー寒天上で２５℃にて増殖されたものを、ワシントン大
学のＰａｕｌａ　Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍから寄贈された。

ラビットポリクローナル抗血清は、下記の方法で見つけ
られた大便中の包嚢に対して調製された。

凍結された。新しい大便試料は、予め顕微鏡でジー・ラ
ンプリア陽性であることを確認された。これを、４〜５
倍の陽性の蒸留水中に懸濁させ、２層の寒冷紗で濾過し
、そして濾液を５００〜７００Ｘｇで５分間遠心分離し
た。上澄み液を捨て、そしてペレットを０．５％ツイー
ン（Ｔｗｅｅｎ）　８０を含有る、蒸留水に懸濁させて
脂質を除去した。遠心分離後の上澄み液が透明になるま
で、懸濁した物質を０．５％ツイーン８０溶液中で繰返
し洗浄した。次にペレットを蒸留水中に懸濁させ、同容
積の０．８５Ｍショ糖溶液の上に重層した。管を、５０
０Ｘｇで２０分間遠心分離にかけて、水−ショ糖の界面
から包嚢を取出し、蒸留水で繰返し洗浄し１次に９００
Ｘｇで７ ２分間遠心分離した。得られた包嚢を、　１．５　ｄの
ポリプロピレン製の管内の水溶液（２００Ｕのペニシリ
ンＧ、　２００μｇのストレプトマイシン、５０μｇの
ゲンタマイシン、および５μｇのアンホテリシンＢを１
１１Ｉｌ！当りに含有る、）中に４°Ｃで貯蔵した。

５Ｘ１０’紺胞／ｄの濃度の無傷の包嚢２戚とフロイン
ド不完全アジュバント２Ｉｄの混合物を、筋肉内の数箇
所に注射る、ことによって、ラビットを免疫化した。３
週間後、上記のラビットに、包嚢の投与量を増やしなが
ら（５Ｘ１０Ｓ包嚢／ｄの濃度のものを、０．１ｄ、０
．２ｍ、０．３ｄおよび０．４威投与）１週間に２回静
脈注射して追加免疫化を行った。最後の追加免疫の注射
をしてから１週間後、ラビットを麻酔にかけて、心臓穿
刺によって採血した。その血清を一２０°Ｃで貯蔵した
。ラビット以外の哺乳動物も、抗血清の調製に利用され
得る。

電気泳動法用の抗体の調製物を以下のようにして調製し
た。

（ｉ）大便溶出液。ジー・ランブリアト包嚢陽性の大便
と対照の大便を種々の診療所や私的な起源８ から収集した。約１ｇの非ホルマリン固定した（新しい
）大便を３−の蒸留水に添加し、撹拌しながら充分混合
し、そして９ＯＯＸｇで５分間遠心分離した。上澄液を
一２０°Ｃで貯蔵した。

Ｏｌ）ジー・ランプリアの包嚢。予め精製したジー・ラ
ンプリア包嚢を、２Ｘ１０’〜３Ｘ１０’包嚢／Ｉｄの
濃度で、０．１％トリトンＸ−１００含有の１０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６，８）中に懸濁させ、　Ｂｒａｎｓ
ｏｎ細胞破砕器による最少の８回の１０−．０パルスで
氷上にて音波処理した。包嚢調製物が完全に破砕された
ことを光学顕微鏡で確認した。音波処理をした調製物を
、　１２，０ＯＯＸ　ｇで６分間遠心分離し１次いで得
られた上澄み液のタンパク検定が、　Ｂｒａｄｆｏｒｄ
。

Ｍ、Ｎ、　（＾ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　７２：
２４Ｂ−２５４、１９７６年）の方法によって行なわれ
た。上澄み液を希釈し最終タンパク濃度を１〜２■／ｄ
として、使用る、時まで一２０’Ｃで貯蔵した。

（ｆｉｔ）ジー・ランプリア、ティ・バギナリス（Ｌ■
訂…旦ｓ）＋　　ピー・ホミニス（Ｐ、ｈｏｍｉｎｉｓ
　）およびイー・ヒストリチ力（ｔ！、　ｈｉｓｔｏ旦
旦並）の９ 栄養体。栄養体を対数期（ｌｏｇ　ｐｈａｓｅ）の末期
に収集した後、これを氷上で２０分間冷却し、　　８Ｏ
ＯＸｇで遠心分離してペレット化し、冷リン酸緩衝食塩
水（ＰＢＳ）または冷食塩水−１％グルコース中で４回
洗浄した。洗浄後、培養物を０．１％トリトンχ−１０
０を含有る、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）中に
懸濁させ　これを氷上で６回の１０４のバーストで音波
処理をした。音波抽出物を１２．０ＯＯｘ　ｇで６分間
遠心分離る、ことによって、この音波抽出物から得られ
た粒状物質を除去し、上澄み液をＢｒａｄｆ。

ｒｄの方法（前出）でタンパクについて検定した。

上澄み液を希釈して、最終タンパク濃度を１〜２■／−
とし、使用る、ときまで一２０’Ｃで貯蔵した。

（ｉｖ）大便溶出液由来のジー・ランプリア特異的抗原
。ジー・ランプリア陽性の患者由来の大便の溶出液中に
存在る、ジー・ランプリア特異的抗原を、アフィニティ
ークロマトグラフィーにかける前に下記方法で部分的に
精製した。大便（１０ｇ）を５００戚の蒸留水に懸濁さ
せ、　１０，０ＯＯＸｇで２０分間遠心分離した。ペレ
ットを捨て、上澄み液に５００ ％硫安沈澱を行ない９次いで１０．０００ｘ　ｇで２０
分間遠心分離した。上澄み液を捨て、ペレットを蒸留水
に懸濁させて、もとの体積にした。これに２回目の５０
％硫安沈澱を行ない、　１０，０ＯＯＸ　ｇで２０分間
遠心分離した。得られたペレットを蒸留水中に懸濁させ
９０．１％水酸化アンモニウム含有の蒸留水に対して、
充分に４℃で透析し１次いで凍結乾燥した。乾燥した物
質を、１５１Ｍフッ化フェニルメチルスルホニルと５ｍ
Ｍｆ’ＤＴＡを含有る、５０ｍＭ　ｌ−リス緩衝液（ｐ
Ｈ８，２）の５ＩＩｌ中に懸濁させ、アフィニティーク
ロマトグラフィーにかけるまで一２０°Ｃで貯蔵した。

ｌ気詠動抜 ポリクローナル抗包嚢抗血清によるＣＩＥを用いて、　
Ｄｉｒｅｃｔ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏ
ｏｒ　ａｎｉｓｍｓ　ＩｎＣ１１ｒ山徂り伽シ状競（Ｃ
ｏｏｎｒｏｄ、　Ｊ、Ｄ、　　ら、　Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ＋　Ｉｎｃ、　１９８３年）中の１０５〜１
１１頁にＫｅｎｎｙ＋Ｇ、Ｅ、が記載したようにして、
ジー・ランプリア包嚢陽性の大便試料中にジー・ランプ
リア特異的抗原が存在る、ことを証明した。電気泳動用
緩衝液１ （２０ｍＭ　Ｃｈｅｓ、　１６ｍＭ　Ｂｉｃｉｎｅ、　
０．０５％トリトンＸ−１００（ｐＨ８，８６）　）中
に０．９％アガロースを含有させたもの２．５ｄでスラ
イドガラス〔４３ｍ×４３ＩＩＩＩｌ＋もしくは１イン
チ×３インチ（２，５４ｃｍＸ７．６２ｃｍ）　）を覆
い、これを用いて、５ｍｍの間隔をあけた２つの３膿の
直径のウェルを、アガロース内にパンチして形成し、そ
して電場に平行に配向させた。陽極に最も近いウェルは
、　１０μ！のラビット抗包嚢抗血清、または単離され
た大便中のジー・ランプリア特異的抗原に対して調製さ
れたラビット単一特異性抗血清のいずれかで満たされた
。陰極に最も近いウェルは、ランブル鞭毛虫症の患者の
大便、もしくは対照の患者の大便の水性溶出液（１部の
大便に対して３部の蒸留水）１０μ！で満たされた。

５Ｖ／ｃｍのフィールドストレングスの電気泳動法を９
０分間行った。プレートが乾燥およびクーマシー・ブル
ーＲ−２５０で染色される前に、プレートをトリス緩衝
食塩水（１０ｍＭ　）リス、　１５０ｍＭ　ＮａＣ１（
ｐＨ７，２）　：ｌ中で２４時間洗浄し９次に蒸留水中
で２４時間すすいだ。

２ 単一特異性抗体を産生ずる抗原を、　Ａｘｅｌｓｅｎ＋
　Ｎ、Ｈ。

ら（Ｓｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　５ｕｐ
ｐ１．１＋　２　：　４７−７７゜１９７３年）によっ
て記載されているようにして、ライン免疫電気泳動法を
用いて単離した。スライドガラス（４３ｍｍ　Ｘ　４３
ｍｍ　）を、電気泳動用緩衝液に０．９％のアガロース
を含有させた液２，５ＩＲ１で覆った。

アガロースの上方の２／３を切取り、これをラビットの
抗包嚢抗血清のＩｇＧ画分を２，５％含有る、０、９％
アガロース１．６戚で置き換えた。トラフ（３×３５ｍ
ｎ）をアガロースの下方１／３に切入れ１次に。

これを、顕微鏡でジー・ランプリア陽性でありかつ抗包
嚢抗血清を用いて前述のようにしてＣＩＨによってジア
ルディア抗原陽性であることが予めわかった患者由来の
大便溶出液５０〜７０μ！で満たした。フィールドスト
レングス　ＩＶ／ｃｍの電気泳動を１５時間行った。抗
体−ＧＳＡ６５複合体／沈降素のラインがスライド上に
生成る、。

電気泳動を行った後、直ちにスライドガラスを。

Ｔｅｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ　）中で２回転振盪機を用い
。

２日間にわたって緩衝液を６回かえて洗浄した。

３ 次にスライドガラスを、蒸留水を用いて回転振盪機で１
日間、水を３回かえて洗浄した。

洗浄に続いて、スライドガラスをオーブン中６５〜８０
°Ｃで、アガロースが乾燥してうすいフィルムになるま
で乾燥した（３０〜６０分間）。空気乾燥は推奨できな
い。それは、オーブンによる乾燥の方が染色工程におい
てより耐久性を存る、表面が得られるからである。これ
らのスライドガラスは乾燥しすぎないよう注意しなけれ
ばならない。さもないとアガロースにひび割れが生じ１
時にはガラスから剥離る、。

オーブンによる乾燥に続いて、スライドガラスを染色溶
液〔酸９例えば酢酸もしくはトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）
　、好ましくは酢酸、１０〜２０％（Ｖ／Ｖ）　。

好ましくは１０％；メタノール、エタノールもしくはイ
ソプロパツールのようなアルコール、好ましくはエタノ
ール、３５〜５０％（Ｖ／Ｖ　）　、好ましくは４５％
；および蒸留水中に０．５％クーマシープルーＲ−２５
０Ｅ内で１０分間染色し２次に、脱色溶液〔酸。

例えば酢酸もしくはトリクロロ酢酸（ＴＣＡ　）　、好
４ ましくは酢酸、　１０〜２０％（Ｖ／Ｖ　）　、好まし
くは１０％；メタノール、エタノールもしくはイソプロ
パツールのようなアルコール、好ましくはエタノ−）Ｌ
ｔ、　３５〜５０％（Ｖ／Ｖ　）　、好ましくは４５％
；および蒸留水）中で、１〜２分間激しく振盪して脱色
した。純水による染色／脱色溶液（０，５％のクーマシ
ーブルーと水だけの溶液）は、抗ＧＳＡ　６５抗血清を
産生できるスライド調製物を生成しない。水による染色
では、抗体ＧＳＡ　６５沈降素をアガロース床中で目視
できるようにる、ことはできない。したがって、沈降素
の抽出は妨害されるかまたは不可能であるかのいずれか
である。さらに、たとえ「水による」染色ゲルから沈降
素を運よく充分に抽出しても、この物質が動物に注射さ
れる場合、この物質は抗原性を有さない。

ＧＳＡ　６５は高い溶解性を有る、ので、これが恐らく
、これが宿主に抗原を与える前に、これらの調製物中の
抗体から解離る、。「水による」染色ゲルで免疫化した
動物には、抗ＧＳＡ　６５の力価が全く認められない。

酢酸／エタノールによる染料は。

５ ＧＳＡ　６５／抗体沈降素複合体を不可逆的に変性る、
ため、複合体は解離せず、これを動物に注射した後でさ
えも不溶性のままのようである。この物質は不溶性のま
まであるので、これは動物の免疫系に充分に与えられ、
すぐれたＧＳＡ　６５抗体が生成る、。

大便溶出液中に存在る、。ジー・ランプリア特異的抗原
に対る、単一特異性抗血清は、　ＡｌｅｘａｎｄｅｒＡ
、Ｇ、ら（Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、、　１５−：
　３１３−３２１　、１９７７年）による記載の方法で
調製された。アガロース系免疫電気泳動用プレート（前
出）から、沈降素のアーク形が、　Ｎｏｒｒｉｌｄ、　
Ｂ、ら（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　８１　：４３
２−４４１　、１９７７年）によって記載されているよ
うにして２００のプレートから切取られた。最初の注射
を行うために、アガロース内の沈降素のアーク形をフロ
イント完全アジュバント中で乳濁させ。

これを２匹のニューシーラント白ラビットの頚部および
背中の上部の多数箇所に皮下注射した。３週間後、フロ
イント不完全アジュバント中に乳濁させた沈降素のアー
ク形の筋肉内注射を週１回行６ い、この注射を約３カ月続けた。ラビットを前述のよう
にして採血し、血清を一２０℃で貯蔵した。

抗血清の免疫グロブリンＧ　（ＩｇＧ）の分画は、　Ｇ
ｏｄｉｎｇ。

Ｊ、ＬＪ、　（Ｊ、　　Ｉａ＋ｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　　１３　：　２１５−２１６　。

１９７６年）によって記載されているようにして、プロ
ティンＡ−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　
ＰｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ、ニューシャーシー州、　
Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）を用いて行われた。

ジー・ランプリア陽性の大便溶出液中に見出された沈澱
可能な抗原のプロフィルを得るために。

交差免疫電気泳動法を利用した。これらの方法は。

大便抗原の電気泳動の移動度の特性付けと、単一特異性
抗血清と、栄養体および包嚢の調製物由来の抗原との公
差反応性の確認と、抗栄養体抗血清が、類似のシアルシ
ア抗原を大便溶出液から沈澱させることができるか否か
の決定とを行うのに使用した。Ａｘｅｌｓｅｎ、　Ｖ、
Ｈ，ら（Ｓｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

５ｕｐｐ１．１　、　２　：　４７−７７　、１９７３
年）によって記載されている交差免疫電気泳動法、縦列
交差免疫電気泳動法、および中間ゲル内交差免疫電気泳
動法が。

７ ０．９％アガロース含有電気泳動用緩衝液２．５ｄで覆
ったスライドガラス（４３Ｘ４３ｍｍ）上で実施された
。一番目の次元の電気泳動に対しては、５ｖ／１のフィ
ールドストレングスを６０分間適用した。

ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ　）　　（３μｇ）を抗原
に加え、そしてこれが移動標準として使われた。二番目
の次元の電気泳動の前に、２．５％のラビット抗血清と
０．２５％のラビット抗ＢＳＡ抗血清を含有る、ゲルを
１分離した抗原の調製物を含有る、１ｃｍ幅のストリッ
プの上に注ぎ、そして電気泳動を１５時間、ＩＶ／ｃｍ
で行った。洗浄と染色の方法はＣＩＨに用いた時と同様
である。

ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法（ＳＯ３−ＰＡＧＥ）が、免疫吸着カラム溶出液
中およびジー・ランプリア栄養体と包嚢の音波抽出物中
の、ジー・ランプリア特異性抗原の特性決定に利用され
た。５ＤＳ−ＰＡＧＥは、基本的には。

Ｌａｅｍｍｌｉ　、　Ｕ、に、　（Ｎａｔｕｒｅ　（ロ
ンドン）　、　２２７　：　６８０−６８５　、１９７
０年）によって記載されている方法と同様に行った。５
％の重層用（ｓｔａｃｋｉｎｇ）ゲルと８８ ％の分離用ゲルを用いた。免疫吸着カラムの画分。

栄養体の音波抽出物、および包嚢の音波抽出物が。

４％ドデシル硫酸ナトリウム、２０％のグリセロール、
１０％２−メルカプトエタノール、　０．００４％ブロ
モフェノールブルー、および０．２Ｍ　）リス塩化水素
緩衝液（ｐＨ６，８）からなる試料緩衝液と同容積で混
合され、これが試料スロットに添加される前に２分間煮
沸させた。電気泳動を行った後、いくつかの未染色のス
ラブがウェスタンプレッティングに用いられた。残りの
スラブは銀で染色され。

Ｍｅｒｒｉｌ、　Ｃ，Ｒ，ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ　　２１
１　罎１４３７．１９８１年）によって記載された方法
によってタンパク検出る、か、またはＴｓａｉ、　Ｃ，
Ｍ、ら（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１９：１１
５−１１９　、１９８２年）によって記載されている過
コウ素酸酸化−銀染色法によって炭水化物を検出した。

５Ｏ３−ＰＡＧＥで分離された抗原をニトロセルロース
紙に移行させることによって、ウェスタンブロッティン
グ法が行われた。Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、　Ｗ、Ｎ、　（Ａ
、Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ　、　１１２　　：　１９５−２０３　
、１９８１年）の方法で改９ 変したＴｏｗｂｉｎら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

頚：　６０７−６１０　、１９７９年）の方法で抗原を
分析した。

移行後、ニトロセルロースシートヲ、フロッキング緩衝
液（１６０ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ｔ！ＤＴ八四ナへ
リウム。

０．２５％ゼラチン、および０．１％ツイーン２０を含
有る、１０ｍＭ　ＴＥＳ　（Ｎ−トリス（ヒドロキシメ
チル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸）緩衝液（
ｐＨ７，３）　）中、室温で１時間インキュベートした
。シートを。

０．３２％ラビット抗血清を含有る、新しいブロッキン
グ緩衝液に移し、ゆっくり振盪しながら１時間インキュ
ベートし１次に０．５％のツイーン２０ヲ含有る、０、
０２Ｍ　ＰＢＳ　（ｐＨ７，６）　　（ＰＢＳ−Ｔ）中
で繰り返し洗浄した。シートを、０．１％の、ペルオキ
シダーゼ結合ヤギ抗ラビットＩｇＧ　　（Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ、　Ｉｎｃ、。

カリフォルニア州、デイビス）を含有る、新しいブロッ
キング緩衝液中に２５°Ｃで１時間放置し１次にＰＢＳ
中で６回洗浄した。０．０６％（Ｗ／Ｖ　”）　４−ク
ロロ１−ナフトール（Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣ
ｏ、、　　ミズーリ州。

セントルイス）と０．０１％過酸化水素を含有る、ＰＢ
Ｓを新しく調製し、そしてこの溶液にニトロセルロ０ −スシートを入れて発色させた。

アフィニティーで精製したＧＳＡ　６５を、　Ｍａｒｉ
ｎｓＣｏｌｏｉｄｓ社のＭａｒｉｎｅ　Ｃｏ１１ｏｉｄ
ｓ、　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ（Ｍａｒ
ｉｎｅ　Ｃｏ１１ｏｉｄｓ　、メイン州、ロックランド
。

１９８２年）に記載されているように、アガロースを用
いて等電点電気泳動法（ＩＥＰ　）により、以下のよう
に改変して分析した。１％ｌ５ｏＧｅｌアガロースと３
％両性電解質（ｌ５ｏｂｏｘ両性電解質〔ｐＨ３，０〜
１０．０）　　；　Ｍａｒｉｎｅ　Ｃｏ１１ｏｉｄｓ　
、メイン州、ロックランド〕とを含有る、アガロースゲ
ルを使用した。

ソルビトールのようなその他の添加剤は全く用いなかっ
た。このゲルを６５°Ｃで１１１１１の厚さに流延し。

４°Ｃで一夜貯蔵して使用した。

ＩＥＦは、熱的に制御されたｌ５ｏｂｏｘとＰＳ−２５
００プログラマブル電源（両方ともにＨｏｅｆｅｒ　５
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｓｔｒｕｓ＋ｅｎｔｓ社製、カ
リフォルニア州、サンフランシスコ）を用いて行った。

アプリケーションマスクによって、４μ！の試料を１０
〜２０分間ゲル表面と接触させたままで、実験前に試料
を吸着させた。陽極液としては０．５Ｍ酢酸を、陰極液
として１ は１．０　Ｍ　　Ｎａ０）１を使用した。試料は、最初
に、　５００Ｖで５分間電気泳動させた。次に、試料の
アプリケーションマスクを除き、　ＩＩ！Ｆを７讐の一
定電力で２５分間続けた。実験を終える前に、電圧を５
分間で２．００Ｑ　Ｖまで上げた。ゲルを直ちにｌ５ｏ
ｂｏｘから取出し、そしてトリクロロ酢酸中で沈澱させ
た。

製造業者によって推奨されているように、単一特異性ラ
ビット抗血清のＩｇＧ画分６０■を、２０戚のカップリ
ング緩衝液（０，５Ｍ　ＮａＣ１を含有る、０、１ＭＮ
ａＨＣＯ３（ｐＨ８，５）　）中の２ｇ（乾燥重量）の
ＣＮＢｒセファロース４Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に
結合させることによって、免疫吸着クロマトグラフィー
が行われた。

０．１Ｍグリシン含有のカップリング緩衝液４０ｄとと
もに、スラリーを一夜４°Ｃでインキュベートる、こと
によって、ゲル上の過剰の活性基はブロックされた。得
られたゲルを１０１ｄのカラムに移し。

これをカップリング緩衝液と、　　０．５Ｍ　ＮａＣＬ
を含有る、０、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）とで交互
に洗浄した。このゲルは、使用る、際にはＰＢＳ−Ｔ内
で洗浄した。前述のようにして調製した２部分的に２ 精製した大便溶出液由来のジー・ランプリア特異的抗原
と、ジー・ランプリア包嚢と栄養体の音波抽出物を、別
々の免疫吸着カラムにかけ、これらを２時間４℃で反応
させた。１００ｍｆのＰＢＳ−Ｔでカラムを洗浄る、こ
とによって、未吸着抗原を除去した。非特異的に吸着さ
れた抗原を、ＩＭＮａｌを含有る、ＰＢＳ−７５０−を
使って溶出した。次に、より強く結合したシアルシア抗
原を、３ＭＭａｒを含有る、ＰＢＳ−Ｔ　２５−で溶離
し、４℃で蒸留水に対して徹底的に透析し１次いで凍結
乾燥る、かもしくは限外濾過法で濃縮した。濃縮物は交
差免疫電気泳動法、　５Ｏ３−ＰＡＧＢ、およびウェス
タンブロッティング法で分析された。

１％グルコース含有の冷滅菌食塩水中で、はじめに、精
製したジー・ランプリア包嚢を洗浄し。

次いで培養された原性動物の栄養体をすべて、同じ液で
３回洗浄してから、免疫蛍光検定法は行われた。細胞の
濃度は無菌グルコース液１ｄ当り１０６個に調節され、
この液をｌＯμβずつ、マルチスポットのテフロン（Ｔ
ｅｆｌｏｎ、　Ｂ、　１．　ｎｕ　Ｐｏｎｔ　ｄｅ　Ｎ
ｅｍｏｕｒｓ３ ＆　Ｃｏ、Ｉｎｃ、　、プラウエア州、ウィルミントン
）で覆われた顕微鏡用スライドガラスに塗布し、空気中
で乾燥し１次いでこれをアセトン中で５分間固定した。

また免疫蛍光検定法による検定は、プラストシスティス
・ホミニス（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ　ｈｏｍｉｎｉ
ｓ）もしくはイー・ヒストリチ力の包嚢を含有る、大便
の塗抹と、ウシ由来の精製されたクリプトスピ第５版、
　Ａｐｐｌｅｔｏｎ−Ｃｅｎｔｕｒｙ−Ｃｒｏｆｔｓ、
　　コネチカット州、　Ｎｏｒｗａｌｋ　）によって記
載されている酢酸エチル−ホルマリン濃縮法でヒトの大
便から調製されたメニール鞭毛虫（Ｃｈｉｌｏｍａｓｔ
ｉｘ　ｍｅｓｎｉｌｉ　）の包嚢とについて行われた。

間接的な免疫蛍光検査法による検定は、−次と二次の抗
体の両者について１時間培養法（ｌｈ−ｉｎｃｕｂａｔ
ｉｏｎ　）を利用し、３７℃の湿潤室内で標準法で行わ
れた。使用された２次のフルオレセイン結合抗体は、１
：８０に希釈されたローダミン−アルブミン対比染料（
Ｄｉｆｃ。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　　ミシガン州、デトロイ
ト）を含有４ る、ＰＯ３中に、１：４０に希釈されたフルオレセイン
で標識されたヤギ抗うビッＨｇＧ　　（ＩｇＧ画分）（
Ｃａｐｐｅｌ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　Ｃｏｏｐｅｒ　Ｂ
ｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｉｎｃ１ペンシルベニア州、ウェ
ストチエスター）である。

スライドに蛍光マウンティング媒体（Ｄｉｒｃｏ）をの
せ、これをエビフルオレッセンス（ｅｐｉｆ　Ｉｕｏｒ
ｅｓｃｅｎｃｅ）を用いて見た。写真は、１９０倍で、
コダックのＢｋｔａｃｈｒｏｍｅ　１６０タングステン
フイルム（ＥａｓｔｍａｎＫｏｄａｋ　Ｃｏ、、ニュー
ヨーク州、ロチェスター）にとられた。

（以下余白） ５ （実施例） 実施例Ｉ ＧＳＡ　６５の単離 前述のようにして実施されるＣＩＯは、抗包嚢抗血清に
よって、シアルシア包嚢陽性大便中の抗原を検出できる
か否かを決定る、のに使用された。

第１図に示すように、明確に示された二重の沈降素ライ
ン（二重線）は、４０個のシアルシア包嚢陽性大便溶出
液のうち３６個から目視可能であった。

しかし、このラインは臨床的な症候のない患者由来の１
０個の包嚢陰性対照例では目視ができなか。

た。抗包嚢抗血清を用いた場合、沈降素ラインは。

洗浄と染色の前にはほとんど目視できなかった。

抗包嚢抗血清１ｇＧ画分を使用る、と、沈降素の二重線
の外観が単一線に変化した。抗包嚢抗血清を用いるＣＩ
Ｂによって陽性であることがわかっている３６個の大便
溶出液はすべて１表１に示すように。

単一特異性抗血清を用いるＣＩＨによって陽性であるこ
とを示し、そしてこれらは同じ特徴的な陽極の沈降素の
アーク形を示した。

６ 表１ の試験結果 ジー・ランプリアのみ；症候のある患者　　３６／４０
ジー・ランプリア以外の腸内寄生虫　　　　４／３１Ｃ
ＩＢで沈澱した抗原の電気泳動移動度と純度とを交差免
疫電気泳動法で評価した。顕微鏡とＣＩＢによってジー
・ランプリア以外であると予め確認された患者由来の１
０個の大便溶出液が、単一特異性抗ＧＳＡ　６５抗血清
に対る、。または抗包嚢抗血清のＩｇＧ画分に対る、交
差免疫電気泳動法に使用７ された場合、１．２６の移動度（１，０の値を指定され
たＢＳＡに対る、移動の距離）を有る、単一のピークが
観察された。この沈降素のピークの高さは、試料ごとに
異なり、大便中の抗原量の変動を反映しているようであ
った。上記と同じ１０個の大便溶出液を用いて、ラビッ
ト抗栄養体抗血清もしくは前免疫（ｐｒｅｉｍｍｕｎｅ
）ラビット血清が交差免疫電気泳動法に用られた場合、
沈降素のピークは全く観察されなかった。抗包嚢抗血清
を用いる。タンデム交差免疫電気泳動法による。これら
の大便溶出液の比較分析によって、各大便試料由来の沈
澱性抗原は免疫学的に同一であること、すなわち、異な
る大便由来の免疫沈澱物は、単一の凹凸のあるライン中
で融合し、全くスパー（ｓｐｕｒ）が認められないこと
が明らかになった。抗包嚢抗血清を用いて。

ジー・ランプリア陽性大便溶出液を、中間ゲル中の単一
特異性抗血清との中間ゲル交差免疫電気泳動にかけると
、単一の沈降素のピークが生成した。

これは単一特異性抗血清と抗包嚢抗血清とが同じ抗原を
沈澱させていることを示唆している。

８ 大便由来の抗原の近似の分子量を測定る、ために、また
はこの抗原がジー・ランプリアの包嚢と栄養体内で同定
できるかどうかを決定る、ために。

培養で増殖した栄養体由来の音波抽出物、精製した包嚢
の音波抽出物、および包嚢陽性大便溶出液由来の部分的
に精製された抗原を、別々に単一特異性抗血清のＩｇＧ
画分で調製したセファロースアフィニティーカラムを通
過させた。５Ｏ３−ＰＡＧＨの後。

再濃縮されたアフィニティーカラムの溶出液をウェスタ
ンブロッティング法に付したところ、溶出液全体が第２
図に示すように同一のバンドパターンを有る、ことが明
らかになった。各々が分子量的６２．０００〜７０．０
００のバンドを示し、主要なものは６５、０００で、こ
の主要バンドの上下に６２．０００〜６８．０００の分
子量を有る、うすいスミヤリング（ｓｍｅａｒ　ｉｎｇ
）がある。したがって、この抗原をＧＳＡ　６５　（Ｇ
ｉａｒｄｉａｓｔｏｏｌ　ａｎｔｉｇｅｎ　６５）と呼
ぶ。単一特異性抗血清に対る、アフィニティーカラムの
溶出液の交差免疫電気泳動は、包嚢陽性の大便溶出液を
用いて認められたのと同じ電気泳動移動度（１，２６）
の沈降素の９ ピークを有る、ことが明らかとなった。栄養体と包嚢の
両者の粗製音波抽出物も、単一特異性抗血清を用いて、
　ＣＩＩＩ！と交差免疫電気泳動法とで検出る、のに充
分なＧＳＡ　６５を含有る、ことが分かった。

実施例２ 特異性の試験 ＧＳＡ　６５の種特異性を１種々の原生動物を有る、患
者由来の大便溶出液、その他の寄生虫病の患者由来の大
便溶出液、培養された原生動物の様々な種、および培養
されたシー・アルビカンス（Ｃ，ａｌｂｉｃａｎｓ）の
様々な種に対して、　ＣＩＢによって評価した。特異性
は、すべての場合において、先に調製した単−特異性抗
ＧＳＡ　６５抗血清を用い、前述の免疫蛍光法で評価し
た。その結果を表２に示す。

（以下余白） ０ 表２ ジー・ランプリア（栄養体） ピー・ホミニス　　（栄養体） ティー・バギナリス　（栄養体） イー・ヒストリチ力　（栄養体） エル・ドノバニ　（プロマスティボート）シー・アルビ
カンス （酵母と発芽管０；ｅｒｍ　ｔｕｂｅｓ））＋ 注＝ａ＋：陽性反応；−：陰性反応 ４９個のジー・ランプリア陰性大便溶出液（対照）の全
部は、　ＧＳＡ　６５に対る、単一特異性抗血清を用い
、　ＣＩＥＩによって、　ＧＳＡ　６５の存在について
検定された（上記表１）。他の非シアルシア原生動物お
よび嬬虫である寄生虫を有る、患者由来の３１個の１ 大便溶出液のうち、４個はＧＳＡ　６５抗原に対して陽
性であった。これらの陽性の大便のうち、１つは大腸ア
メーバ（Ｂｎｔａｍｏｅｂａ　ｃｏｌｉ）を含有し、１
つはイー・ヒストリチ力を含有し、そして２つは小形ア
メーバ（Ｂｎｔａｍｏｅｂａ　ｎａｎａ）を含有してい
た。

しかし、５個のイー・ヒストリチ力陽性の大便のうち４
個は、４個のイー・コリ　（Ｅｌ、ｃｏｌｉ）含有大便
のうち３個および６個のイー・ナナ（Ｂ、　ｎａｎａ）
含有大便のうち４個と同様に、　ＣＩＥｔ陰性であった
。

胃腸に症候がある患者由来の１８個の大便溶出液は。

顕微鏡検査によって腸内寄生虫に対して陰性であった。

この１８個の大便溶出液のうち２個がＧＳＡ　６５の存
在について陽性であった。培養されたピー・ホミニス、
イー・ヒストリチ力、ティー・バギナリス、シー・アル
ビカンスおよびエル・ドノバーニブロマスティゴートの
音波抽出物のＣＩＢによる試験した結果は、　ＧＳＡ　
６５に対して陰性であった。

陽性の対照としてのジー・ランプリア栄養体の音波抽出
物を試験した結果、予想どおり、沈降素のラインを得た
。

２ 免疫蛍光の試験では、単一特異性抗血清が精製したジー
・ランプリア包嚢と強く反応した。包嚢の壁が明るく蛍
光を発し、この蛍光によって内部形態がみえなくなった
。包嚢の壁の蛍光は、包嚢を前免疫血清と反応させた場
合、無視できる程度になった。シアルシア栄養体は、ア
フィニティークロマトグラフィーとＣＩＨによってＧＳ
Ａ　６５を含有していることを示した事実にもかかわら
ず、これは単一特異性抗血清もしくは前免疫血清と反応
させた場合に蛍光を発しなかった。単一特異性抗血清は
、イー・ヒストリチ力、ピー・ホミニス、ティー・バギ
ナリスおよびジー・アルビカンスの培養栄養体とは反応
しなかった。イー・ヒストリチ力とエンタモエバ・ハー
トマンニー（Ｆ！ｎｔａｍｏｅｂａｈａｒｔｍａｎｎｉ
　）の両者の包嚢を含有る、大便の塗抹；およびシー・
メスニリの包嚢；クリブトスポリジウムの卵母細胞；お
よびビー・ホミニスの調製品も非反応性であった。

実施例３ ３ 特性決定実験の前に、アフィニティーで精製したＧＳＡ
　６５の純度を、　５Ｏ３−ＰＡＧＢ、次いでウェスタ
ンブロッティング法および銀染色法で評価した。ニトロ
セルロースシートを、抗栄養体抗血清と単一特異性抗Ｇ
ＳＡ　６５抗血清で発色させて、　ＧＳＡ　６５に添加
した栄養体抗原が非特異的に結合してアフィニティーカ
ラムから溶出されたか否か評価した。第４図に示すよう
に、　ＧＳＡ　６５に特徴的な単一の拡散したバンドが
分子量６５．０００の位置に現われた。ポリアクリルア
ミドゲルの過ヨウ素酸シッフ銀染色試験によっても１分
子量６５．０００の範囲に単一の暗染色領域が現われた
。いずれの方法も汚染物は全く認められなかった。

実施例４ ＧＳＡ　６５の特性決定 ＧＳＡ６５の化学的性質は、タンパク分解消化、煮沸、
過ヨウ素酸酸化、およびレクチン結合の各試験で決定さ
れた。この抗原は１０分間煮沸され、その熱安定性を評
価した。酸化性条件下での安定性を、下記に示すように
過ヨウ素酸塩で処理して評４ 価した：　１００ｍＭ　Ｎａ１Ｏ，溶液を、　２０ｍＭ
酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）中で調製し、その３０μｌを
、ポリプロピレン製遠心分離管中の抗原３０μｌ添加し
た。対照には３０μｌの緩衝液だけを入れた。酸化反応
は、４℃で２４時間暗所で行われた。反応は、３０μ矛
の０．５ＭＮａＢＨ＜によって直ちに停止され１次にＮ
２雰囲気下で２時間乾燥した。ＧＳＡ　６５のタンパク
分解感度は。

トリプシン、キモトリプシンおよびプロテアーゼ（すべ
てＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　　ミズー
リ州、セントルイスより人手）とともにインキュベート
る、ことによって決定された。トリプシンとキモトリプ
シンは、　　０，１Ｍ　　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，
０）中２００μｇ／−の酵素濃度で使用された。ＧＳＡ
　６５を３７℃で２４時間消化した。プロテアーゼは、
１ｍＭＣａＣＩｚを含有る、０、１Ｍ　　）リス塩酸（
ｐＨ８，０）中１０ｍｇ／−の濃度で使用された。ＧＳ
Ａ　６５を３７℃で１５分間インキュベートし１次に６
０℃で２４時間消化した。対照には０．１Ｍ）リス塩酸
だけを入れた。

消化はすべて３分間沸騰させて停止した。これらの処理
の効果を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリ５ アクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＯ３−ＰＡＧＥ＞　
、次に単一特異性ラビット抗ＧＳＡ　６５抗血清による
ウェスタンプロット法を実施して評価した（後述）。

第５図に示すように、アフィニティーで精製したＧＳＡ
　６５は、トリプシン、キモトリプシンもしくはプロテ
アーゼによってタンパク分解の消化を行った後も、これ
は不安定にはならなかった。タンパク分解の消化後も、
　ＧＳＡ　６５は単一特異性抗血清との反応性を保持し
ていた。消化物はすべて未消化の対照と同じウェスタン
ブロッティングパターンを保持していた。ＧＳＡ　６５
は、過ヨウ素酸酸化処理の後は不安定であったが、沸騰
後は安定であった。ＧＳＡ　６５をＮａ１Ｌで酸化し、
　ＮａＢＬで還元した後、　ＧＳＡ　６５は免疫反応性
を失い、免疫プロット法では検知できなかった。沸騰後
、　ＧＳＡ　６５は、免疫反応性と、ウェスタンプロッ
トにおける電気泳動移動度とを保持していた。対照は、
免疫反応性。

移動度、または分子量に変化を示さなかった。

ＧＳＡ　６５の炭水化物の組成を、前述のレクチン結合
試験で評価した。ＧＳＡ６５の試料（５μｇ）をニ６ トロセルロース試験片（１，５Ｘ　１．５ｃｍ）に塗布
した。そのニトロセルロース片を、　ＴＢＳ−Ｃ３［１
０ｍＭ）リス塩酸、　１５０ｍＭ　ＮａＣ１（ｐＨ８，
０）　、　１０％　ウシ胎児血清〕中、２３℃で１２時
間インキュベートして。

残りの結合部位をブロックした。このＴＢＳ−Ｃ３溶液
を、コンカナバリンＡ−ペルオキシダーゼ、ヒマアグル
チニンーベルオキシダーゼ（ＲＣＡ−１＞　、またはコ
ムギ胚芽アグリチニンーベルオキシダーゼ（すべてＳｉ
ｇｍａ社より入手）それぞれの、　　５ｍＭＣａＣ］。

と５　ｍＭ　ＭｇＣ１ｚを含有る、ＴＢＳ−Ｃ３中の５
０μｇ　／ｍｌ濃度の新しく調製した溶液で置換した。

各ストリップを２３℃で３０分間インキュベートし１次
いでＴＢＳＣ８中で５分間ずつ３回洗浄して、未結合の
レクチン−ペルオキシダーゼ結合体を除去した。新しく
調製した溶液である。０．０６％（ｗ／ｖ）の４−りｏ
ｏ−１ナフトール（Ｓｉｇｍａ　）と０．０１％の過酸
化水素を含有る、０、１Ｍ）　！Ｊス緩衝液に各ストリ
ップを添加る、ことによって、結合したペルオキシダー
ゼが検定された。反応混合物に１００ｍＭの濃度で適切
な競合る、糖類を加えて結合の特異性を評価した。

７ レクチン結合性の試験では、　ＧＳＡ　６５はＲＣＡと
結合したが、コンカナバリンＡ−ペルオキシダーゼとコ
ムギ胚芽アグルチニンーペルオキシダーゼとは結合しな
かった。ＲＣＡとの結合性は特異的であり。

反応混合物に１００ｍＭ　Ｏ−（”）−ガラクトースを
添加る、ことによってブロックる、ことができた。

第６図に見られるように、アガロース等電点電気泳動ゲ
ルにおいて、　ＧＳＡ　６５は低ｐＨの標準物とともに
移動したが、単一のよく集中したバンドに分離る、こと
はできなかった。代わりに、　ＧＳＡ　６５によって、
　ｐＨ５，４から最低のｐＨを有る、タンパク標準〔ア
ミルグルコシダーゼ（ｐＨ３，６）　：］よりはるかに
低いｐＨ領域まで広くよごれていた。最も強いバンドは
ｐＨ４以下に見られ、　ＧＳＡ　６５は非常に酸性であ
ることを示している。このよごれ（ｓｍｅａｒｉｎｇ）
は実験ごとに再現性があった。ｐＨ８準はすべてうまく
分離し、クーマシープルーＲ−２５０で非常に濃く染色
された。

ＧＳＡ　６５のタンパク分解劣化と沸騰に対る、抵抗性
と、過ヨウ素酸酸化に対る、感度は、この抗原８ が炭水化物を含有る、ということを示唆している。

ＧＳＡ６５は、高度に水溶性であり、硫酸アンモニウム
とトリクロロ硫酸中で沈澱し、ポリアクリルアミドゲル
中で過ヨウ素酸−シッフ試薬で非常に濃く染色され、糖
タンパクとして挙動る、。５Ｏ３−ＰＡＧＢとＩＢＦの
バンドパターンによってＧＳＡ　６５が糖タンパクであ
ることが確認された。特異なグリコシド化のために、糖
タンパクは種々の電荷／重量比を有し、そしてこのタン
パクは純粋なタンパクがほとんどの電気泳動で示す特徴
的な単一バンドに分離できないことが多かった（Ｓｈａ
ｒｏｎ、　Ｎ、、　ＣｏｍｐｌｅｘＣａｒｂｏｈｙｄｒ
ａｔｅｓ、　　Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ、マサチ
ューセッツ州、レディング、　　１９７５年）。ＧＳＡ
　６５は、ウェスタンプロットとアガロースＩＢＦゲル
において。

特徴的な糖タンパクのフィンガープリントを示した。

炭水化物とタンパクの検定結果は、　ＧＳＡ　６５が高
度にグリコジル化されていることを示唆している。

ＧＳＡ　６５は、はぼ１：４の炭水化物／タンパクの重
量比を有し、これは９〜１０個のアミノ酸当りほぼ９ １個のヘキソース単糖に換算される。これは多くのムチ
ン類に見られるグリコジル化比に匹敵る、。

（以下余白） ０ 実施例５ 貯蔵条件下にふけるＧＳＡ　６５の安定性ＣＩＢによっ
てＧＳＡ　６５陽性であると予め確認されたランブル鞭
毛虫包嚢陽性の大便溶出液は、ホルマリンによる固定と
長期間の貯蔵に対して耐性であった。ホルマリンで固定
した未処理のＧＳＡ　６５陽性の大便は４℃または、−
２０℃で６ケ月間貯蔵後。

ＣＩ［！により特徴的な沈降素のアーク形を与えた。

沈降素のアーク形は、陰性の対照では観察されなかった
。

実施例６ ＧＳＡ　６５の糞便診断検定 ヒト大便試料の水抽出物中のＧＳＡ　６５を次のように
して検出した。大便試料（１００μｌ）を、界面活性剤
と防腐剤とが入ったトリス緩衝液を含有した試料希釈緩
衝液（Ａｌｅｘｏｎ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、　Ｉｎｃ
ｌ　カリフォルニア州、マウンテンビューが３ｐｅｃｉ
ｍｅｎ旧１ｕｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒとして市販してい
る）で希釈して（１：２０ｖ／ｖ）大便溶出液を調製し
た。大便溶出液（２００μＩｌ）を、好ましくはポリス
チレン製の免疫検１ 元管に入れて、単一特異性抗ＧＳＡ　６５抗体でプレコ
ートした。抗ＧＳＡ　６５抗体でプレコートされた検定
管は、　Ａｌｅｘｏｎ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、　Ｉｎ
ｃ、、カリフォルニア州、マウンテンビューからＰｒｅ
ｃｏａｔｅｄ　５ｔａｒ　Ｔｕｂｅｓ■として市販され
ている　（Ｓｔａｒ管は、　Ｎｕｎｃ、　Ｉｎｃ、の登
録商標である）。次に、この検定管の内容物を。

約２０〜２５℃で、好ましくは２２℃で１時間インキュ
ベートした。他の固相基質１例えば膜も、この検定法を
実施る、のに利用できる。

インキュベートした後、１０倍に濃縮した界面活性剤入
りリン酸緩衝液を含有した希釈された免疫検定洗浄用緩
衝液（Ａｌｅｘｏｎ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、　Ｉｎｃ
、　、カリフォルニア州、マウンテンビューからＩｍｍ
ｕｎｏ−ａｓｓａｙ　Ｗａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒとして市
販されている）３−ずつで３回、未結合物質を管から洗
い出した。ウシ胎児血清と防腐剤が入ったリン酸緩衝液
で希釈された酵素である西洋ワサビペルオキシダーゼ（
２００ｔｔ　１　）　（ＡｌｅｘｏｎＢｉｏｍｅｄｉｃ
ａｌ、　Ｉｎｃ、　、カリフォルニア州、マウンテンビ
ューからＥｎｚｙｍｅ−ＡｎｔｉｂｏｄｙＣｏｎｊｕｇ
ａｔｅとして市販されている）に結合した抗２ ＧＳＡ　６５抗体を管に添加した。次いで内容物を約２
０〜２５℃、好ましくは２２℃で１時間インキュベート
した。余分な未結合の抗ＧＳＡ　６５−ＨＲＰ物質を管
から洗い出し、上記の免疫検定洗浄用緩衝液を用いて。

この緩衝液３ｍｉ！で４回洗浄し、管をゆっくりと動か
した。

最後の洗浄に続いて、管を２〜３分間逆に転倒させた。

Ｐｅｒｏｘｉｄｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（過酸化水素の入った
クエン酸リン酸緩衝液）とローフェニレンジアミン（Ｏ
ＰＤ）錠剤（両者ともにＡｌｅｘｏｎ　Ｂｉｏｍｅｄｉ
ｃａｌ、　Ｉｎｃ、　、カリフォルニア州、マウンテン
ビューが市販している）とで調製した（緩衝液４−に１
錠）　ＯＰＤ／過酸化酵素基質溶液（２００μｍ）を、
管に加え、２０〜２５℃。

好ましくは２２℃で１０分間インキュベートした。最終
工程として、管に５０μｌの希酸溶液（２Ｎ硫酸）（Ａ
ｌｅｘｏｎ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、　Ｉｎｃ、、カリ
フォルニア州、マウンテンビューからＤｉｌｕｔｅ　Ａ
ｃ１ｄ　５ｏｌｕｔｉｏｎとして市販されている）を添
加して反応を停止させた。

抗ＧＳＡ　６５　ＨＲＰに結合した酵素は、大便試料中
のＧＳＡ　６５抗原の存在に依存る、が、前記基質と反
応３ し、目視で認められるような黄色を呈る、。明確な黄色
もしくは黄褐色の反応は、大便試料中にＧＳＡ６５が存
在る、ことを示し９色強度は大便中のＧＳＡ６５の濃度
に比例る、。陰性の反応の場合には発色しない。

）１ｏ１ｙ　Ｆａｍｉｌｙ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌと５ａｃ
ｒｅｄ　Ｈｅａｒｔ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌで１９８６年７
月から１９８７年８月に収集した９３個のランブル鞭毛
虫０＆Ｐ陽性の臨床試料を用いて、最初に免疫検定法の
感度を試験した。これら９３個の試料全部が、免疫検定
法を用いた目視試験で強い陽性であった。これらの試料
のうち、８７個は、光学濃度（０、Ｄ、ＨＤｙｎａｔｅ
ｃ”　ＭＲ５８０分光光度計でオフスケール）が２．０
０より大であり残りの６個は１．００より大であった（
黄色域で０．４００．　Ｄ、まで目視で容易に検知でき
る）。９３個の試料の０゜Ｄ、平均値は１．９５であっ
た。表３で示されるように、顕微鏡試験、または大便の
硬さによる大便試料中に存在る、包嚢もしぐは栄養体の
量と、この試験で得られた最終の光学濃度による大便試
料中に存在る、包嚢もしくは栄養体の量との間には、相
関関係はな４ かった。陰性である対照の４個の大便試料（その内、２
個は２重に試験を行った）は、検定後に着色゛が目視さ
れなかった。これらのそれぞれの０．　Ｄ。

は０．１６８．０．１６４．０．１６３．０．１ｇ３．
０．１４９　右よび０．１５８であった。

（以下余白） ５ へｄ呻 ６ 表３における用語は５次の意味を有る、。

まれ＝２２ｍｍカバーグラス当り１〜５゜時々＝２２ｍ
ｍカバーグラス当り６〜１０゜少量＝２２ｍｍカバーグ
ラス当り１１〜２０゜中程度＝２２１１ＩＩ１１カバー
グラス当り２１〜４０゜多数〈豊富）　＝２２ｍｍカバ
ーグラス当り〉４０゜これらの満足すべき結果によって
、　ＲｅｆｕｇｅｅＳｃｒｅｅｎｉｎｇ　Ｃ１１ｎｉｃ
における臨床試験に発展した。

１９８７年８月から１０月にかけて２０８個の患者の大
便試料を集めた。これらの試料のうち１６個が０＆Ｐ検
査と免疫検定法で陽性であり、６個が０＆Ｐ試験では陰
性であって免疫検定法では陽性であり、１個が０＆Ｐ検
査で陽性で免疫検定法で陰性であった。

眼で見て陽性と判定された２２個の試料の平均光学濃度
は１．３６であった。８個は０．Ｄ、が２．００より大
であり、１０個は０．Ｄ、が１．００より大で、残りの
４個は０、４７４〜０．．６５９の範囲であった。眼で
見て陰性と判定された１８６個の試料の光学濃度の平均
値と標準偏差は０．１８０（±０．０４）であった。ス
ポカンの試験用試料と同様に、顕微鏡で観察した包嚢も
しく７ は栄養体の計数と、免疫検定カラー発色の強度との間の
相関関係はわずかであった。結果を表３に示す。　さら
に、０＆Ｐ検査によって、シアルシア以外の１５種の腸
内寄生虫を含むことが判明した５１個の大便試料を、　
Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏ５
ｐｉｔａｌで１９８７年８月〜１０月に収集した。これ
らの試料は。

表４に示す免疫検定法の交差反応性試験に用いられた。

これらの試料のうち２７個は、　ＲｅｆｕｇｅｅＳｃｒ
ｅｅｎｉｎｇ　Ｃ１１ｎｉｃから集められ、残りの２４
個は他の診療所で見つけられた患者から集めた。集めた
５１の試料のうち２個だけ陽性反応が認められた。

これら２個の試料の検定光学濃度はそれぞれ１．１２８
と１．１５７であった。残りの４９個の陰性試料の光学
濃度の平均値と標準偏差は、０．１８１　（±０．０３
６）であった。

（以下余白） ８ 表４ （その１） 交差反応性試験パネルに提示されたランブル鞭毛虫以外
の全寄生虫の総合リスト ９ 表４ （その２） 鉤虫（Ｈｏｏｋｗｏｒｍ） ０／８ 表４に示すように、２つの場合だけ陽性反応が記録され
た。これらの反応は、同じ寄生虫を含む各カテゴリーの
いくつかの他の試料との反応性がないために、真の交差
反応よりもむしろランブル鞭毛虫症０ が潜在している場合を恐らく示している。陽性を示した
上記の２つの場合は、同時にランブル鞭毛虫症に感染し
たメンバーを有る、ファミリー由来のものであった。

前記のＳｐｅｃｉｍｅｎ　Ｄｉｌｕｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆ
ｅｒの、いくつもの通常の大便固定液と大便移送媒体と
を安定化る、性能を、これら試薬の、免疫検定法との適
合性を決定る、のに利用した。各試薬は、その希釈後の
ｐｌが≧７．０であれば適合性であるとみなした。この
ようなｐＨでは９診断試験の結果に対して重要な抗原−
抗体相互反応が許容できる速度で起こる。ＳＡＦ固定液
、１０％ホルマリンおよびＣａｒｙ−Ｂｌａｉｒ媒体は
、希釈後のｐｌが７．０〜７．５であり、免疫検定法に
適合していた。ＰＶＡは、その希釈後のｐｕが低い（６
，０〜６．５）ために。

免疫検定法に拒絶反応をおこした。

処理されたシアルシア０＆Ｐ陽性の大便試料３０個全部
が、すべての処理カテゴリーにおける免疫検定法により
明らかに陽性であった。上記の列挙した試薬のいずれか
で大便を処理しても、免疫検定感度は有意には変化しな
かった。分光学的には１列挙した試１ 薬で処理した同一の大便の間で光学濃度値において小さ
な減少が観察された。最高の性能を示す試薬は。

ＰＢＳ−Ｔ対照とＣａｒｙ−Ｂｌａｉｒ媒体とであり、
これらにぴったり続いてＳＡＦ固定液と１０％ホルマリ
ンとがある。

各試薬での処理カテゴリーにおける３０個の試料のそれ
ぞれの０．Ｄ、の平均値と標準偏差（平均値±Ｓ、　Ｄ
、　）は、　ＰＢＳ−Ｔ　　（１，７３０±０．４４９
　）　　：　Ｃａｒｙ−Ｂｌａｉｒ媒体（１、６６７±
０．４７８）　　；ＳＡＰ固定液（１，６５８±０．４
９７）　　；および１０％ホルマリン（１，５５６±０
．４９５）であった。

陰性である６個の対照は、観察可能な色を発色せず。

光学濃度の平均値が０．１６４であった。試料がＣａｒ
ｙ−Ｂｌａｉｒ移送媒体、　ＳＡＦ固定液もしくは１０
％ホルマリンで処理された時、検定感度の低下は無視可
能な程度であった。陽性の試料は、全処理カテゴリーに
おいて１：１，０００を越える試料を希釈率でも目視で
認めることができた。

（以下余白） ２ （発明の要約） ランブル鞭毛虫特異的抗原（ＧＳＡ６５）、それに対る
、単一特異性抗体、および哺乳類におけるランブル鞭毛
虫症の糞便診断法が開示されている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、３種のランブル鞭毛虫陽性の大便溶出液を、
抗包嚢抗血清を用いてＣ１８分析した結果を示す図であ
る。 第２図は、ランブル鞭毛虫の栄養体の音波抽出物（Ａレ
ーン）、ランブル鞭毛虫の包嚢の音波抽出物（Ｂレーン
）、および精製された、ランブル鞭毛虫陽性の大便溶出
液（Ｃレーン）それぞれと。 単一特異性抗６Ｓ八６５抗血清とを反応させて得られた
。アフィニティー精製ＧＳＡ　６５調製物の免疫プロッ
トを示す図である。 第３図は、アフィニティーで精製したＧＳＡ　６５の５
Ｏ３−ＰＡＧＥウェスタンプロットを示す図である。Ｃ
レーンにはタンパクの分子量標準品；ｂレーンには０．
３２７％の単一特異性ラビット抗ＧＳＡ　６５抗血清に
よって検出されたＧＳＡ　６５　；そして、Ｃレーンに
３ は０．３２％のラビット抗全ランブル鞭毛虫栄養体抗血
清で検出されたＧＳＡ　６５がそれぞれ含有されている
。 第４図は、タンパク分解処理したＧＳＡ　６５の５Ｏ３
ＰＡＧＢウエスタンプロツトを示す図である。ａとｂの
レーンには、未消化（対照）のＧＳＡ　６５が含有され
；Ｃレーンにはトリプシンで消化したＧＳＡ　６５が含
有され；Ｃレーンにはキモトリプシンで消化したＧＳＡ
６５が含有され；そして、Ｃレーンにはプロテアーゼで
消化したＧＳＡ　６５が含有されている。 第５図は、０４２％の単一特異性ラビット抗ＧＳＡ６５
抗血清で検出される。熱処理されたＧＳＡおよび酸化さ
れたＧＳＡ　６５の５Ｏ３−ＰＡＧＢウェスタンプロッ
トを示す図である。Ｃレーンには、未処理（対照）のＧ
ＳＡ　６５が含有され：ｂレーンには１０分間煮沸させ
たＧＳＡ　６５が含有され；そしてＣレーンには過ヨウ
素酸塩で処理され１次にＮａＢＨ４で還元されたＧＳＡ
６５が含有されている。 第６図は、アフィニティーで精製したＧＳＡ　６５を含
有る、ゲルの等電点電気泳動法による分析結果４ を示す図である。Ｃレーンにはクーマシーブルーで染色
されたタンパク標準品が含有され；ｂレーンには光回折
箱内で撮影した。　ＧＳＡ　６５のトリクロロ酢酸によ
る沈澱物が含有されている。中括弧はＧＳＡ　６５が不
鮮明になる酸性ｐＨ領域を示す。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ランブル鞭毛虫症の糞便診断に有用なランブル鞭毛
   虫特異的抗原（ＧＳＡ６５）であって、該抗原は、その
   分子量が約６５，０００であって、トリプシン、キモト
   リプシンおよびプロテアーゼによるタンパク分解消化に
   抵抗性を有する、ランブル鞭毛虫特異的抗原。 ２、精製した形のランブル鞭毛虫特異的抗原（ＧＳＡ６
   ５）の調製法であって、 大便溶出液由来のランブル鞭毛虫特異的抗原（ＧＳＡ６
   ５）、ランブル鞭毛虫の包嚢、またはランブル鞭毛虫の
   栄養体と、汚染物とを含有する部分的に精製した混合物
   を、該抗原に対して単一特異性の抗体が結合されている
   基質を有する免疫吸着カラムにかけて、該抗原が該抗体
   に対して特異的なリガンドであることから、該抗原を該
   基質に特異的に結合させること； 該カラムから汚染物を洗い落とすこと；そして生成した
   ランブル鞭毛虫特異的抗原が、カラムに吸着しているの
   をカラムから回収すること；を包含する、調製法。 ３、請求項２に記載の方法により調製した精製ランブル
   鞭毛虫特異的抗原（ＧＳＡ６５）。 ４、ランブル鞭毛虫特異的抗原（ＧＳＡ６５）に対する
   単一特異性ポリクローナル抗体。５、ランブル鞭毛虫特
   異的抗原（ＧＳＡ６５）に対する単一特異性抗血清の調
   製法であって、 ヒト大便由来のランブル鞭毛虫の包嚢に対する免疫血清
   を哺乳類中で調製すること； 該免疫血清由来の抗体を基質のマトリックス内に沈着さ
   せること； 該基質を、ランブル鞭毛虫特異的抗原を含む哺乳類の大
   便を含有する溶液で処理し、その結果、ＧＳＡ６５抗原
   と、ヒト・ランブル鞭毛虫の包嚢に対する抗体との複合
   体を形成すること； 該基質から不純物を洗い出すこと； 該基質を約３０〜６０分間乾燥すること； 該乾燥基質を、酸性の水性アルコール混合物で洗浄し、
   該結合した複合体を部分的に変性し、安定なＧＳＡ６５
   ランブル鞭毛虫包嚢抗体沈降素を生成させること； 該沈降素を該基質から取出すこと； 該沈降素を哺乳類に導入すること；そして ランブル鞭毛虫特異的抗原（ＧＳＡ６５）に対する、生
   成した単一特異性抗血清を含有する哺乳類の血清を回収
   すること、 を包含する、調製法。 ６、前記酸性の水性アルコール混合物が、約１０〜２０
   ％の酢酸と、約３５〜５０％のエタノールとを含有する
   、請求項５に記載の方法。 ７、ランブル鞭毛虫特異的抗原（ＧＳＡ６５）に対する
   単一特異的抗血清で覆われた固相の基質。 ８、哺乳類におけるランブル鞭毛虫症の糞便診断法であ
   って、 大便試料の溶出液を調製すること； 該溶出液を、ランブル鞭毛虫に対する単一特異性抗血清
   と接触させて、ランブル鞭毛虫の存在下で複合体を得る
   こと；そして 前記複合体の生成を検出すること； を包含する、糞便診断法。 ９、前記単一特異性血清が固体の基質に結合され、前記
   検出が、該基質を、前記複合体と免疫反応性を有する標
   識抗体で処理することを包含する、請求項８に記載の方
   法。 １０、哺乳類におけるランブル鞭毛虫症の糞便診断法で
   あって、 大便試料の溶出液を調製すること； 該大便試料の溶出液を、ランブル鞭毛虫に対する単一特
   異性抗血清でプレコートした固相基質に添加して、結合
   体を得ること； 過剰の溶出液を固相基質から洗い出すこと；該結合体と
   免疫反応性を有する標識抗体を基質に添加して、該抗体
   を結合体に結合させること；未結合の標識抗体を該基質
   から洗い出すこと；そして、 該基質上の標識抗体を検出すること； を包含する、糞便診断法。