CN102353791A

CN102353791A - 一种分离检测afp亚型的新方法

Info

Publication number: CN102353791A
Application number: CN2011101812120A
Authority: CN
Inventors: 倪润洲; 肖明兵; 陈不尤
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-06-30
Filing date: 2011-06-30
Publication date: 2012-02-15

Abstract

本发明应用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合免疫印迹技术定性检测血清样本中的肝癌特异性AFP亚型（HS-AFP）。包括以下组份：聚丙烯酰胺溶液；分离胶缓冲液；浓缩胶缓冲液；过硫酸铵溶液；上样缓冲液；阳极电泳缓冲液；阴极电泳缓冲液；蛋白印迹（转移）缓冲液；显色液；一抗（兔抗人AFPIgG）；二抗（HRP-羊抗兔IgG）；磷酸盐缓冲液（0.01MPBS）；硝酸纤维膜。其检测步骤包括：（1）制胶：自上而下2个浓度梯度分别为88.0g/L和50.0g/L；（2）加样电泳；（3）转移；（4）包被；（5）抗原抗体反应；（6）显色，肉眼观察AFP区带分布情况。

Description

一种分离检测AFP亚型的新方法

技术领域

本发明属于医学生物技术领域，涉及一种肝癌特异性AFP亚型（Hepatoma-specific Alpha-fetoprotein Isoform，HS-AFP）分离检测法，具体为应用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合免疫印迹技术定性检测血清样本中的HS-AFP。人外周血中HS-AFP的增加与原发性肝癌的发生发展存在密切关联，运用该方法检测外周血中HS-AFP，对原发性肝癌的诊断、鉴别诊断、肝癌监测、手术预后判断及肝硬化癌变预测均具有较高价值。

背景技术

肝癌是最常见恶性肿瘤之一，其预后在很大程度上取决于能否得到早诊早治。肝癌

的诊断包括影像学的定位诊断和肝癌标志物的定性诊断。许多早期肝癌缺乏典型的影像学改变，此时定性诊断尤为重要。在我国肝癌发病的高危人群为慢性肝病尤其是乙肝后肝硬化患者，对这部分肝癌高危人群定期进行肝癌标志物检测对肝癌的早期诊断具有重要价值。血清甲胎蛋白（AFP）是公认最佳肝癌标志物，对肝癌的筛选、诊断以及复发监测均有重要价值。但许多小肝癌AFP浓度较低，出现AFP假阴性，而良性肝病有时也可出现AFP升高假阳性。因此单靠检测AFP水平不能满足临床需要。为进一步提高AFP对肝癌的诊断价值，许多学者对AFP亚型进行了研究，发现AFP存在糖链异构体。不同AFP糖链异构体与植物凝集素的亲和力不同，据此利用植物凝集素亲和电泳可将AFP分离出不同的亚型。肝癌患者血清中岩藻糖化的AFP增多，后者可与扁豆凝集素（lens culinaris agglutinin A）有亲和作用，被命名为AFP-L3。近年来国外不少学者对AFP-L3对肝癌的诊断价值进行了研究，证实AFP-L3升高（占总AFP 15%以上）主要见于肝癌。良性肝病尽管会出现总AFP升高，但AFP-L3很少升高。AFP-L3在临床发现肝癌9～12个月之前即可出现阳性， AFP-L3还与患者的转移及生存期相关。因此，AFP-L3对肝癌的诊断、鉴别诊断以及病情监测价值远比血清AFP浓度为高。AFP亚型的另一种分离方法是根据不同AFP亚型间等电点的差别采用等电聚焦电泳法进行分离。Burditt等用等电点聚胶电泳将血清AFP分为4条区带，发现区带III和IV为肝癌特异性区带。Ho等也发现2条不同等电点的肝癌特异性区带，有助于AFP升高的良性肝病与肝癌的鉴别诊断。目前用于AFP亚型的检测方法都根据AFP糖链异构体与植物凝集素亲和力或等电点的差异而进行的。不但方法繁琐，更由于亲和电泳所需凝集素和等电聚焦电泳所需两性电解质价格都非常昂贵，故AFP亚型检测未能在临床上推广应用。

我们利用不连续缓冲系统聚丙烯酰胺凝胶电泳体系分离AFP亚型，结合免疫印迹技术检测肝癌特异性AFP。既省去了昂贵的植物凝集素和两性电解质，大大降低检测成本，又简化操作，具有价廉、简便及重复性好的优点，且无需特殊条件及仪器，使肝癌特异性AFP检测能在临床推广应用。该方法国内外均未见其他相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏特异、价廉、简便及重复性好的肝癌特异性AFP亚型检测方法。

本发明的目的是通过以下方法实现的：制备2个浓度梯度的聚丙烯酰胺凝胶，自上而下分别为88.0 g/L和 50.0 g/L，在每个加样孔中分别加入上样缓冲液及血清样品（混匀），以自然聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离肝癌特异性AFP亚型，再将AFP亚型从聚丙烯酰胺凝胶上转移至硝酸纤维膜，并与兔抗人AFP Ig G一抗反应，再加入HRP-羊抗兔Ig G二抗，最后以DAB显色。肉眼观察AFP区带分布情况。

本发明检测肝癌特异性AFP亚型方法，其包括以下组份：

（1）聚丙烯酰胺溶液：准确称取29.2 g聚丙烯酰胺，0.9 g亚甲基双丙烯酰胺，均放入100 ml的烧杯中，加入去离子水6 0ml，加热并搅拌使之完全溶解，倒入100 ml的容量瓶中，去离子水冲洗烧杯数次均倒入容量瓶中，定容至100 ml，过滤备用，冷藏保存。

（2）分离胶缓冲液：准确称取Tris 18.10 g，放入100 ml的烧杯中，加入去离子水50 ml及四甲基乙二胺(TEMED) 1.0 ml搅拌，用浓盐酸滴定至pH 8.30，去离子水定容至100 ml，冷藏保存。

（3）浓缩胶缓冲液：准确称取Tris 6.0 g，放入100 ml的烧杯中，加入去离子水50 ml及四甲基乙二胺(TEMED) 1.0 ml搅拌，用浓盐酸滴定至pH 6.80，去离子水定容至100毫升，冷藏保存。

（4）过硫酸铵溶液：准确称取0.14 g过硫酸铵，放入100 ml的烧杯中，加入去离子水50 ml搅拌溶解，避光冷藏保存。

（5）上样缓冲液：1.0 M Tris-HCl缓冲液(pH6.8)3.1 ml，5.0 ml甘油，1.0 g/L溴酚蓝0.5 ml，加去离子水至10 ml，冷藏保存。

（6）阳极电泳缓冲液：准确称取Tris 37.85g，吸取浓盐酸20.8 ml，放入500 ml的烧杯中，加入去离子水300 ml，搅拌使之完全溶解，去离子水定容至1000 ml。冷藏保存。

（7）阴极电泳缓冲液：准确称取Tris 22.8 g，硼酸45.0g，放入500 ml的烧杯中，加入去离子水300 ml，搅拌使之完全溶解，去离子水定容至1000 ml。冷藏保存。

（8）蛋白印迹（转移）缓冲液：准确称取甘氨酸2.90 g，Tris 5.80 g，放入100 ml的烧杯中，加入去离子水50 ml，搅拌使之完全溶解，倒入1000 ml的容量瓶中，加入200 ml无水甲醇，去离子水定容至1000 ml。冷藏保存。

（9）显色液：准确称取DAB 7.0 mg，放入100 ml的烧杯，加0.01 M PBS(pH7.4)10 ml，搅拌使之完全溶解，加入饱和硫酸镍铵0.2 ml。显色前加入H₂O₂ 20 μl。

（10）一抗为兔抗人AFP Ig G ：DAKO公司生产。

（11）二抗为HRP-羊抗兔Ig G：西安华美公司生产。

（12）磷酸盐缓冲液（0.01 M PBS）：称7.9 g NaCl，0.2 g KCl，0.24 g KH₂PO₄和1.8 g K₂HPO₄，溶于800 ml 蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，去离子水定容至1 L。冷藏保存。

（13）硝酸纤维膜：德国Protran TM公司生产。

本发明检测肝癌特异性AFP亚型步骤如下：

（1）制胶使用14ml体积垂直平板电泳槽，胶厚1mm，玻璃板间下端先以10.0 g/L琼脂糖封口，按下表所示量分别配制聚丙烯酰胺浓度分别为88.0g/L的分离胶及50.0g/L的浓缩胶，静置待凝。

表胶板配制中各溶液所取量（ml）

	聚丙烯酰胺溶液	分离胶缓冲液	浓缩胶缓冲液	过硫酸铵溶液
					分离胶	2.95	1.8	5.35
浓缩胶	0.7		1.0	2.3

（2）加样电泳取4 μl上样缓冲液及14 μl血清样品混匀，分别加入电泳胶板的每个加样孔。将电泳胶板放入电泳槽，在上槽中加入阴极电泳缓冲液，下槽中加入阳极电泳缓冲液，并将电泳槽放入4℃冰箱内接通电源，60 V稳压电泳约1 h后，调整电压为100 V，电泳3.5 h结束电泳。

（3）转移小心取下凝胶，在左下角做好标记，放入已加入转移缓冲液的培养皿内，摇床上平稳摇动，换液三次，每次摇动5分钟。在此之前约半小时事先用转移缓冲液浸透转移电泳槽、滤纸和硝酸纤维膜（NC膜）。在转移电泳槽的下层碳板（即阳极碳板）上按从下到上的顺序依次放好24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸。每层均要小心缓慢赶走气泡。轻轻放上阴极碳板。电泳槽放入4℃冰箱内接通电源，设置为稳流，按每平方厘米NC膜面积电流为1mA设置，转移3.5 h。

（4）包被转移结束后，取出NC膜置培养皿中，以0.01 M PBS洗膜三次，每次5 min。称取1.0 g脱脂奶粉，溶解于20 ml的0.01 M PBS中，倒入洗好的NC膜上，37℃水浴1 h。

（5）抗原抗体反应弃去牛奶，0.01 M PBS洗膜三次，每次5 min。加入1:100 稀释的兔抗人AFP IgG，置湿盒4℃冰箱过夜或37℃水浴1 h。再以0.01 M PBS 洗NC膜三次，每次5 min，再加入1:100 稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，37℃水浴1 h。

（6）显色以0.01 M PBS洗膜三次，每次5 min。置DAB显色液中避光显色3 min，弃去DAB显色液，流水冲洗终止反应。肉眼观察AFP区带分布情况。

本方法分离血清AFP亚型结果显示：不同患者血清AFP分离为1至数条区带，泳动最快的位于阳极端的AFP区带称之为AFP快带(F- AFP)，F-AFP在所有血清中均可出现，正常人和非肝癌患者往往仅有F-AFP，而肝癌患者血清中常可在其后方（阴极端）出现另一条AFP区带，而很少见于其他血清，称之为肝癌特异性AFP（HS-AFP）。少数肝病患者还会在HS-AFP的阴极侧出现染色很淡的其他AFP区带，出现率很低且无疾病特异性。应用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合免疫印迹技术高灵敏高特异地定性检测血清样本中的HS-AFP是该方法的一个最显著特色和创新。

本发明具有良好的稳定性，简便重复性好，成本低。

附图说明

图1 不同肝病患者血清AFP电泳分离区带图。

Claims

1.聚丙烯酰胺凝胶电泳结合免疫印迹技术检测血清样本中的肝癌特异性AFP亚型其特征在于包括以下组份：

（1）聚丙烯酰胺溶液：准确称取29.2 g聚丙烯酰胺，0.9 g亚甲基双丙烯酰胺，均放入100 ml的烧杯中，加入去离子水6 0ml，加热并搅拌使之完全溶解，倒入100 ml的容量瓶中，去离子水冲洗烧杯数次均倒入容量瓶中，定容至100 ml，过滤备用，冷藏保存；

（2）分离胶缓冲液：准确称取Tris 18.10 g，放入100 ml的烧杯中，加入去离子水50 ml及四甲基乙二胺(TEMED) 1.0 ml搅拌，用浓盐酸滴定至pH 8.30，去离子水定容至100 ml，冷藏保存；

（3）浓缩胶缓冲液：准确称取Tris 6.0 g，放入100 ml的烧杯中，加入去离子水50 ml及四甲基乙二胺(TEMED) 1.0 ml搅拌，用浓盐酸滴定至pH 6.80，去离子水定容至100毫升，冷藏保存；

（4）过硫酸铵溶液：准确称取0.14 g过硫酸铵，放入100 ml的烧杯中，加入去离子水50 ml搅拌溶解，避光冷藏保存；

（5）上样缓冲液：1.0 M Tris-HCl缓冲液(pH6.8)3.1 ml，5.0 ml甘油，1.0 g/L溴酚蓝0.5 ml，加去离子水至10 ml，冷藏保存；

（6）阳极电泳缓冲液：准确称取Tris 37.85g，吸取浓盐酸20.8 ml，放入500 ml的烧杯中，加入去离子水300 ml，搅拌使之完全溶解，去离子水定容至1000 ml冷藏保存；

（7）阴极电泳缓冲液：准确称取Tris 22.8 g，硼酸45.0g，放入500 ml的烧杯中，加入去离子水300 ml，搅拌使之完全溶解，去离子水定容至1000 ml冷藏保存；

（8）蛋白印迹（转移）缓冲液：准确称取甘氨酸2.90 g，Tris 5.80 g，放入100 ml的烧杯中，加入去离子水50 ml，搅拌使之完全溶解，倒入1000 ml的容量瓶中，加入200 ml无水甲醇，去离子水定容至1000 ml冷藏保存；

（9）显色液：准确称取DAB 7.0 mg，放入100 ml的烧杯，加0.01 M PBS(pH7.4)10 ml，搅拌使之完全溶解，加入饱和硫酸镍铵0.2 ml，显色前加入H₂O₂ 20 μl；

（10）一抗为兔抗人AFP Ig G ：DAKO公司生产；

（11）二抗为HRP-羊抗兔Ig G：西安华美公司生产；

（12）磷酸盐缓冲液（0.01 M PBS）：称7.9 g NaCl，0.2 g KCl，0.24 g KH₂PO₄和1.8 g K₂HPO₄，溶于800 ml 蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，去离子水定容至1 L，冷藏保存；

（13）硝酸纤维膜：德国Protran TM公司生产。

2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳结合免疫印迹技术检测血清样本中的肝癌特异性AFP亚型其特征在于包括以下步骤：

（1）制胶：使用14ml体积垂直平板电泳槽，胶厚1mm，玻璃板间下端先以10.0 g/L琼脂糖封口，按下表所示量分别配制聚丙烯酰胺浓度分别为88.0g/L的分离胶及50.0g/L的浓缩胶，静置待凝；

（2）加样：电泳取4 μl上样缓冲液及14 μl血清样品混匀，分别加入电泳胶板的每个加样孔，将电泳胶板放入电泳槽，在上槽中加入阴极电泳缓冲液，下槽中加入阳极电泳缓冲液，并将电泳槽放入4℃冰箱内接通电源，60 V稳压电泳约1 h后，调整电压为100 V，电泳3.5 h结束电泳；

（3）转移：小心取下凝胶，在左下角做好标记，放入已加入转移缓冲液的培养皿内，摇床上平稳摇动，换液三次，每次摇动5分钟，在此之前约半小时事先用转移缓冲液浸透转移电泳槽、滤纸和硝酸纤维膜（NC膜），在转移电泳槽的下层碳板（即阳极碳板）上按从下到上的顺序依次放好24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸，每层均要小心缓慢赶走气泡，轻轻放上阴极碳板，电泳槽放入4℃冰箱内接通电源，设置为稳流，按每平方厘米NC膜面积电流为1mA设置，转移3.5 h；

（4）包被：转移结束后，取出NC膜置培养皿中，以0.01 M PBS洗膜三次，每次5 min；

称取1.0 g脱脂奶粉，溶解于20 ml的0.01 M PBS中，倒入洗好的NC膜上，37℃水浴1 h；

（5）抗原抗体反应：弃去牛奶，0.01 M PBS洗膜三次，每次5 min，加入1:100 稀释的兔抗人AFP IgG，置湿盒4℃冰箱过夜或37℃水浴1 h，再以0.01 M PBS 洗NC膜三次，每次5 min，再加入1:100 稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，37℃水浴1 h；

（6）显色：以0.01 M PBS洗膜三次，每次5 min，置DAB显色液中避光显色3 min，弃去DAB显色液，流水冲洗终止反应，肉眼观察AFP区带分布情况。