CN113024651A - 阿尔茨海默病生物标志物及其应用 - Google Patents
阿尔茨海默病生物标志物及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113024651A CN113024651A CN201911360241.6A CN201911360241A CN113024651A CN 113024651 A CN113024651 A CN 113024651A CN 201911360241 A CN201911360241 A CN 201911360241A CN 113024651 A CN113024651 A CN 113024651A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- apolipoprotein
- subtype
- globulin
- intermediate alpha
- serum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 title claims abstract description 83
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 title abstract description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 48
- 102000002572 Alpha-Globulins Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 108010068307 Alpha-Globulins Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 34
- 102000018757 Apolipoprotein L1 Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 108010052469 Apolipoprotein L1 Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 108010027018 Apolipoproteins M Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 21
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 102100037320 Apolipoprotein A-IV Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 102100035792 Kininogen-1 Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108010073614 apolipoprotein A-IV Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 101710111227 Kininogen-1 Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102000004211 Platelet factor 4 Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108090000778 Platelet factor 4 Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 230000008859 change Effects 0.000 claims abstract description 4
- 102000018623 Apolipoproteins M Human genes 0.000 claims abstract 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 24
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 claims description 15
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 5
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 claims description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 2
- 101001091590 Homo sapiens Kininogen-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100030304 Platelet factor 4 Human genes 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 claims description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 claims description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 2
- 101150072844 APOM gene Proteins 0.000 claims 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 3
- 102100037324 Apolipoprotein M Human genes 0.000 description 21
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 14
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 13
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 10
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002610 neuroimaging Methods 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000010176 18-FDG-positron emission tomography Methods 0.000 description 1
- ZCXUVYAZINUVJD-AHXZWLDOSA-N 2-deoxy-2-((18)F)fluoro-alpha-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H]([18F])[C@@H](O)[C@@H]1O ZCXUVYAZINUVJD-AHXZWLDOSA-N 0.000 description 1
- 208000000044 Amnesia Diseases 0.000 description 1
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 1
- 101710095646 Apolipoprotein M Proteins 0.000 description 1
- 102000006402 Endocrine-Gland-Derived Vascular Endothelial Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010044063 Endocrine-Gland-Derived Vascular Endothelial Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101000609413 Homo sapiens Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 Proteins 0.000 description 1
- 101000582950 Homo sapiens Platelet factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102100039457 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 Human genes 0.000 description 1
- 208000026139 Memory disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004868 N-Methyl-D-Aspartate Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090001041 N-Methyl-D-Aspartate Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000544 cholinesterase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000006951 hyperphosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000010832 independent-sample T-test Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000006984 memory degeneration Effects 0.000 description 1
- 206010027175 memory impairment Diseases 0.000 description 1
- 208000023060 memory loss Diseases 0.000 description 1
- 230000006996 mental state Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000019581 neuron apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/775—Apolipopeptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/49—Platelet-derived growth factor [PDGF]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/28—Neurological disorders
- G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
- G01N2800/2821—Alzheimer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了一组阿尔茨海默病生物标志物及其应用，具体涉及这一组生物标志物及其在血清中含量变化程度在阿尔茨海默病预防、诊断和制备诊断工具中的应用，包括：与正常人均值相比，血清中载脂蛋白M、激肽原1、血小板因子4、中间α‑球蛋白抑制因子H4 35kDa片段亚型和载脂蛋白A‑IV 26kDa片段亚型的表达显著降低且降低幅度≥50％；与正常人均值相比，血清中载脂蛋白L1含量、载脂蛋白L1与载脂蛋白M含量比值、中间α‑球蛋白抑制因子H4全长亚型与中间α‑球蛋白抑制因子H4 35kDa片段亚型含量比值以及载脂蛋白A‑IV全长亚型与载脂蛋白A‑IV 26kDa片段亚型含量比值显著升高且升高倍数≥3。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一组血清生物标志物在阿尔茨海默病预防、诊断和制备诊断工具中的应用。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是一种进行性和持续性的神经退行性疾病，临床表现为记忆力丧失和认知功能受损，严重的患者可能会出现神经精神症状。AD主要的病理特征表现为Aβ沉积形成老年斑，Tau蛋白过度磷酸化所致的神经元纤维缠结和神经元凋亡。目前全球AD的发病率在持续增加，据阿尔茨海默病联盟2016年统计，在美国大约有530万人口患有AD，预计到2050年将超过1380万，到2050年，全球AD患者的数量将达到1亿。在我国，2014年统计结果显示65周岁以上老年人中AD的患病率在已达3.21％，2018年我国AD患者的数量已超过700万人，显然目前我国已成为AD第一大国。
AD发病隐匿且进展缓慢，在出现临床症状前已经发病多年，因此AD在疾病早期难以诊断。100多年前AD首次被发现，但是至今AD的发病机制尚不明确，因此目前AD靶点药物的研发状况并不理想，大多数药物均已失败告终。目前FDA 批准用于治疗AD的药物包括胆碱酯酶抑制剂和N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂，但是这些药物均是以改善症状为主，既不能彻底治愈AD也不能减缓疾病的进展，因此目前AD尚无有效的治疗药物。鉴于AD上述的疾病特点，寻找有效的AD生物标志物用于AD预防、诊断、相关机制和药物靶点的研究显得尤为重要。虽然 AD患者脑脊液中低水平的Aβ1–42或Aβ1–40、高水平的总的tau蛋白和磷酸化tau 蛋白(p-tau)及神经影像学的生物标志物(MRI,FDG-PET)已被纳入到临床早期诊断的标准中，但是由于脑脊液样本获取的侵袭性和神经影像学的高费用，限制了二者在临床中的应用，因此血液生物标志物在样本获取的可行性和临床筛查及应用上具有较大的优势。因此，我们实验室利用蛋白质组学技术比较AD患者血清与正常健康人血清的差异表达蛋白质，并利用Western blot方法进行大样本验证。因此，我们发现了一些有临床应用价值的分子标志物，对于AD预防和早期诊断具有极其重要的意义。
发明内容
发明目的：本发明是一组血清生物标志物在阿尔茨海默病预防、诊断和制备诊断工具中的应用。其目的在于解决目前阿尔茨海默病发病机制复杂，在早期难以诊断，目前尚无有效药物治疗以及脑脊液和神经影像学生物标志物在临床应用受限的问题。
技术方案：
一组用于阿尔茨海默病诊断或预后的分子标志物，其特征在于，分子标志物选自：载脂蛋白M、载脂蛋白L1、激肽原1、血小板因子4、中间α-球蛋白抑制因子H4全长亚型、中间α-球蛋白抑制因子H4的35kDa片段亚型或载脂蛋白A-IV 的26kDa片段亚型；或分子标志物选自蛋白质组合，其组合为载脂蛋白L1与载脂蛋白M、中间α-球蛋白抑制因子H4全长亚型与中间α-球蛋白抑制因子H4 35kDa 片段亚型或载脂蛋白A-IV全长亚型与载脂蛋白A-IV26kDa片段亚型。
检测样本中分子标志物的产品在制备诊断阿尔茨海默病或预测阿尔茨海默病预后的工具中的应用，其特征在于，分子标志物选自：载脂蛋白M、载脂蛋白L1、激肽原1、血小板因子4、中间α-球蛋白抑制因子H4全长亚型、中间α-球蛋白抑制因子H4的35kDa片段亚型或载脂蛋白A-IV的26kDa片段亚型；或分子标志物选自蛋白质组合，其组合为载脂蛋白L1与载脂蛋白M、中间α-球蛋白抑制因子 H4全长亚型与中间α-球蛋白抑制因子H4 35kDa片段亚型或载脂蛋白A-IV全长亚型与载脂蛋白A-IV 26kDa片段亚型。
本发明中所述的样本中分子标志物的表达水平是指样本中分子标志物在血清中的含量与正常人均值相比的变化程度，包括样本血清中载脂蛋白M、激肽原1、血小板因子4、中间α-球蛋白抑制因子H4 35kDa片段亚型和载脂蛋白A-IV 26kDa 片段亚型的表达与正常人的均值相比，显著降低且降低幅度≥50％；血清中载脂蛋白L1含量、载脂蛋白L1与载脂蛋白M含量比值、中间α-球蛋白抑制因子H4全长亚型与中间α-球蛋白抑制因子H4 35kDa片段亚型含量比值以及载脂蛋白A-IV 全长亚型与载脂蛋白A-IV 26kDa片段亚型含量比值与正常人均值相比，是显著升高的且升高倍数≥3。
本发明的应用包括制备检测样本中分子标志物的表达水平的产品，所述的产品包括蛋白芯片、质谱技术、高通量蛋白质组学技术、ELISA、Western-blot或免疫组化。
本发明中所述的制备检测样本中分子标志物的表达水平的产品针对的检测技术包括可以检测一种或同时检测多种蛋白质的检测技术。
本发明中所述的检测样本中分子标志物的表达水平的样本包括血浆、血清、脑脊液或尿液。
有益技术效果：本发明的这些分子标志物可单独或联合用于阿尔茨海默病临床常规筛查、预防、早期诊断和候选药物的筛选，具有巨大的经济和社会效益。
附图说明
图1示载脂蛋白M在阿尔茨海默病患者和正常人血清中的水平变化情况。
图2示载脂蛋白L1在阿尔茨海默病患者和正常人血清中的水平变化情况。
图3示载脂蛋白L1与载脂蛋白M含量比值在阿尔茨海默病患者和正常人血清中的水平变化情况和受试者工作特征曲线(ROC)分析。
图4示激肽原1在阿尔茨海默病患者和正常人血清中的水平变化情况。
图5示血小板因子4在阿尔茨海默病患者和正常人血清中的水平变化情况。
图6示中间α-球蛋白抑制因子H4全长亚型、中间α-球蛋白抑制因子H4 35kDa片段亚型以及二者含量比值在阿尔茨海默病患者和正常人血清中的水平变化情况和受试者工作特征曲线(ROC)分析。
图7示载脂蛋白A-IV全长亚型和载脂蛋白A-IV 26kDa片段亚型在阿尔茨海默病患者和正常人血清中的水平变化情况。
具体实施方式：
Western Blot实验
人血清总蛋白提取
取空腹静脉血4ml/人，置于真空负压不添加任何抗凝剂采血管中，室温静置2h后，将其离心(3000rpm×5min)4℃，得到的上清液即为血清，可小心将上清吸出(注意切勿吸出细胞成分)，分装备用。
蛋白定量
采用BCA法进行蛋白定量。取蛋白样品2μl，稀释200倍(至398μl)。在96孔板上，每孔加入稀释后的蛋白样品25μl，每个样品设两个复孔。蛋白标准设置8 个浓度：1μg/μL，0.5μg/μL，0.25μg/μL，0.125μg/μL，0.0625μg/μL，0.03125μg/μL， 0μg/μL，也按25μl/孔加样。各孔再加入200ul BCA工作液(BCA试剂A和试剂 B比例为50:1)，充分混匀，37℃放置30分钟后于波长562nm处测定OD值。根据标准曲线计算蛋白浓度。
SDS-PAGE电泳
(1)配制10％分离胶10ml(见下表)，将分离胶注入垂直放置的干净玻璃板间隙中，其顶层加入约1cm高度的无水乙醇覆盖胶面。室温下静置45min，可看见凝胶与无水乙醇之间有一水平的清晰界面，倾斜装置，如胶面无变化，可认为聚合基本完成。倒掉无水乙醇，用滤纸尽可能吸干凝胶顶部液体。
(2)SDS-PAGE凝胶配方表
(3)按上表配制5％浓缩胶5ml，将其注入玻璃板间隙后，立即插入洁净的Teflon梳子，垂直放置于室温，30min后聚合完成。拔出梳子，用双蒸水反复冲洗，并用针拨直梳齿。
(4)将样品与5×Loading Buffer按4：1比例混匀，100℃加热5min。
(5)将凝胶放入垂直电泳槽。上下槽各加入适量的1×SDS凝胶电泳缓冲液，梳孔中加入蛋白样品(60μg/lane)和蛋白质分子量标准，在所有不用的样品孔中加入等体积的凝胶上样缓冲液。
(6)将电泳装置与电源连接，样品在浓缩胶中泳动90min，电压为60V，当溴酚蓝进入分离胶后，将电压增大至120V，继续电泳直到溴酚蓝接近分离胶底部，切断电源。
(7)卸下并撬开玻璃板。
转膜
(1)剪6张与凝胶块大小相同的滤纸和一张PVDF膜(0.22μm)，将滤纸及海绵垫用转移缓冲液浸泡30min。
(2)打开转膜夹，将海绵垫、3张滤纸和凝胶按顺序对齐铺于其上，将PVDF膜于甲醇溶液中浸润10s左右，立即盖膜，盖膜后勿再移动。在膜上盖3张滤纸，最后盖上另一海绵垫。用玻璃棒逐层赶走气泡，合上夹板，放入转膜槽中(槽中转移缓冲液加至超过最上面的金属线，PVDF膜侧为阳极侧)。
(3)接通电源，电流为130mA，恒流电转2.5h。
抗原抗体反应
(1)封闭：电转移完毕后，将PVDF膜放入含5％脱脂奶粉的TBST中，室温振摇封闭2h以上。
(2)孵育一抗：将PVDF膜放于一洁净孵育盒中，向膜上均匀滴加一抗，4℃静置过夜。
(3)取出PVDF膜，用TBST室温洗膜5min×5次；
(4)孵育二抗：将PVDF膜转移至另一湿盒中，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温振摇孵育2h。
(5)取出PVDF膜，用TBST室温洗膜5min×5次。
显色反应
(1)将PVDF膜置于显色托盘上，均匀滴加Millipore化学发光液于PVDF膜上。
(2)LAS-3000凝胶成像仪检测化学发光并照相。
(3)用Bio-rad quantity one密度分析软件对图像中蛋白条带进行灰度分析。
(4)目的蛋白的定量：目的蛋白相对含量＝目的条带灰度值/IgG条带灰度值。
抗体：
Antibody against ApoL1,KNG1,PF4购自Abcam(Cambridge,UK),antibodyagainst ApoM购自Proteintech Group,Inc.(Chicago,IL,USA),antibody against ApoA-IV,ITIH4购自Santa Cruz Biotechnology(CA,USA).
统计学分析
结果以means±SEM表示。组间差异比较采用独立样本t检验(T-test)，P<0.05 为存在显著性差异。采用ROC曲线评价蛋白的临床诊断效能。
下面结合实施例，进一步说明本发明：
实验例1：载脂蛋白M在阿尔茨海默病(AD)患者和正常人血清中的水平变化情况。
本发明人研究发现：如图1和表1所示，与正常组相比(1.00±0.06，n＝68)，阿尔茨海默病患者血清中载脂蛋白M含量是显著降低的且降低幅度将近50％(0.65 ±0.04，n＝68，p<0.01)。因此本发明结果提示，与正常人均值相比，血液中载脂蛋白M的含量显著降低以及降低幅度≥50％时可用于阿尔茨海默病临床筛查、预防、诊断、候选药物靶点和制备阿尔茨海默病诊断试剂。
表1.载脂蛋白M在健康对照组和AD患者组血清中的表达情况
实验例2：载脂蛋白L1在阿尔茨海默病(AD)患者和正常人血清中的水平变化情况。
本发明人研究发现：如图2和表2所示，与正常组相比(1.00±0.12，n＝68)，阿尔茨海默病患者血清中载脂蛋白L1是显著增加的，且增加幅度大于1.5倍(1.63 ±0.11，n＝68，p<0.01)。因此，本发明结果提示，与正常人均值相比，血液中载脂蛋白L1的含量显著增加以及增加幅度≥3倍时可用于阿尔茨海默病临床筛查、预防、诊断、候选药物靶点和制备阿尔茨海默病诊断试剂。
表2.载脂蛋白L1在健康对照组和AD患者组血清中的表达情况
实验例3：载脂蛋白L1与载脂蛋白M含量比值在阿尔茨海默病(AD)患者和正常人血清中的水平变化情况和受试者工作特征曲线(ROC)分析。
本发明人研究发现：如图3和表3所示，与正常组相比(1.00±0.46，n＝8)，阿尔茨海默病患者血清中载脂蛋白L1和载脂蛋白M的含量比值是显著升高的且升高幅度为2.5倍(2.52±0.89，n＝8，p<0.01)。ROC曲线分析结果显示，载脂蛋白L1、载脂蛋白M以及载脂蛋白L1与载脂蛋白M含量比值的ROC曲线下面积 (AUC)分别是0.797、0.844和0.938。因此，本发明结果提示，该蛋白质组合与单一生物标志物相比，能够明显的区分阿尔茨海默病患者和正常人，诊断效能显著提高。因此，血液中载脂蛋白L1和载脂蛋白M的含量比值增加以及增加幅度≥3 倍时可用于阿尔茨海默病临床筛查、预防、诊断、候选药物靶点和制备阿尔茨海默病诊断试剂。
表3.载脂蛋白L1、载脂蛋白M和载脂蛋白L1/M在健康对照组和AD患者组血清中的表达情况、95％置信区间和受试者工作特征曲线(ROC)分析结果
实验例4：激肽原1在阿尔茨海默病(AD)患者和正常人血清中的水平变化情况。
本发明人研究发现：如图4和表4所示，与正常组相比(1.00±0.08，n＝68)，阿尔茨海默病患者血清中激肽原1含量是显著降低的且降低幅度大于50％(0.45± 0.05，n＝68，p<0.01)。因此本发明结果提示，与正常人均值相比，血液中激肽原1 的含量显著降低以及降低幅度≥50％时可用于阿尔茨海默病临床筛查、预防、诊断、候选药物靶点和制备阿尔茨海默病诊断试剂。
表4.激肽原1在健康对照组和AD患者组血清中的表达情况
实验例5：血小板因子4在阿尔茨海默病(AD)患者和正常人血清中的水平变化情况。
本发明人研究发现：如图5和表5所示，与正常组相比(1.00±0.10，n＝68)，阿尔茨海默病患者血清中血小板因子4含量是显著降低的且降低幅度接近50％ (0.49±0.04，n＝68，p<0.01)。因此本发明结果提示，与正常人均值相比，血液中血小板因子4的含量显著降低以及降低幅度≥50％时可用于阿尔茨海默病临床筛查、预防、诊断、候选药物靶点和制备阿尔茨海默病诊断试剂。
表5.血小板因子4在健康对照组和AD患者组血清中的表达情况
实验例6：中间α-球蛋白抑制因子H4全长亚型、中间α-球蛋白抑制因子H4 35kDa片段亚型以及二者含量比值在阿尔茨海默病(AD)患者和正常人血清中的水平变化情况和受试者工作特征曲线(ROC)分析。
本发明人研究发现：如图6和表6所示，与正常组相比(1.00±0.10，n＝68)，阿尔茨海默病患者血清中中间α-球蛋白抑制因子H4全长亚型(ITIH4-120 kDa) 含量是升高的且升高幅度为1.8倍(1.83±0.11，n＝68，p<0.01)；而与正常组相比 (1.00±0.07，n＝68)，中间α-球蛋白抑制因子H4 35kDa片段(ITIH4-35kDa)在阿尔茨海默病患者血清中的含量是下降的且降低幅度>50％(0.23±0.05，n＝68， p<0.01)；在上述结果基础上，将ITIH4-120kDa和35kDa的含量作比值(ITIH4-120 kDa/ITIH4-35kDa)，结果显示，与正常人均值相比(1.00±0.50，n＝68)，该蛋白质组合在阿尔茨海默病患者血清中含量升高更为显著(14.5±2.64，n＝68，p<0.01)。 ROC曲线分析结果显示，ITIH4-120 kDa、ITIH4-35kDa和ITIH4-120 kDa/ITIH4-35kDa的ROC曲线下面积(AUC)分别是0.776、0.912和0.928，说明这3个生化指标均具有很好的诊断效能。因此，本发明结果提示，与正常人均值相比，血液中ITIH4-120kD含量和ITIH4-120 kDa/ITIH4-35kDa含量比值增加且增加幅度≥3倍以及血液中ITIH4-35kDa表达降低且降低幅度>50％时均可用于阿尔茨海默病临床筛查、预防、诊断、候选药物靶点和制备阿尔茨海默病诊断试剂。
表6.中间α-球蛋白抑制因子H4-120kDa、中间α-球蛋白抑制因子H4-120kDa和中间α-球蛋白抑制因子H4-120/35kDa在健康对照组和AD患者组血清中的表达情况、 95％置信区间和受试者工作特征曲线(ROC)分析结果
实验例7：载脂蛋白A-IV全长亚型和载脂蛋白A-IV 26kDa片段亚型在阿尔茨海默病(AD)患者和正常人血清中的水平变化情况。
本发明人研究发现：如图7和表7所示，与正常组相比，载脂蛋白A-IV全长亚型(ApoA-IV46 kDa)在两组中的表达无显著变化，而该蛋白的片段形式(约 26kDa)在阿尔茨海默病患者血清中表达显著降低且降低幅度>50％(n＝16)；因此本发明结果表明，与正常人均值相比，血液中ApoA-IV 26kDa亚型含量显著减低且降低幅度≥50％以及ApoA-IV分子量46kDa与26kDa亚型的含量比值显著增加且增加倍数≥3时均可用于阿尔茨海默病临床筛查、预防、诊断、候选药物靶点和制备阿尔茨海默病诊断试剂。
表7.载脂蛋白A-IV46 kDa、载脂蛋白A-IV26 kDa和载脂蛋白A-IV46/26kDa在健康对照组和AD患者组血清中的表达情况
表8.阿尔茨海默病患者和健康对照组的人口统计学和临床特征
MMSE：简易精神状态检查分数；Glu：血糖；TC：血清总胆固醇；TG：血清总甘油三脂。
Claims (8)
1.一组用于阿尔茨海默病诊断或预后的分子标志物，其特征在于，分子标志物选自：载脂蛋白M(ApoM)、载脂蛋白L1(ApoL1)、激肽原1(KNG1)、血小板因子4(PF4)、中间α-球蛋白抑制因子H4全长亚型(ITIH4-120)、中间α-球蛋白抑制因子H4的35kDa片段亚型(ITIH4-35)或载脂蛋白A-IV的26kDa片段亚型(ApoA-IV-26)；或分子标志物选自蛋白质组合，其组合为载脂蛋白L1与载脂蛋白M(ApoL1/M)、中间α-球蛋白抑制因子H4全长亚型与中间α-球蛋白抑制因子H4 35kDa片段亚型(ITIH4-120/35)或载脂蛋白A-IV全长亚型(ApoA-IV-46)与载脂蛋白A-IV 26kDa片段亚型(ApoA-IV-46/26)。
2.检测样本中分子标志物的产品在制备诊断阿尔茨海默病或预测阿尔茨海默病预后的工具中的应用，其特征在于，分子标志物选自：载脂蛋白M、载脂蛋白L1、激肽原1、血小板因子4、中间α-球蛋白抑制因子H4全长亚型、中间α-球蛋白抑制因子H4的35kDa片段亚型或载脂蛋白A-IV的26kDa片段亚型；或分子标志物选自蛋白质组合，其组合为载脂蛋白L1与载脂蛋白M、中间α-球蛋白抑制因子H4全长亚型与中间α-球蛋白抑制因子H4 35kDa片段亚型或载脂蛋白A-IV全长亚型与载脂蛋白A-IV 26kDa片段亚型。
3.根据权利要求2的应用，其特征在于，所述检测样本中分子标志物的产品包括检测样本中分子标志物的表达水平的产品。
4.根据权利要求3的应用，其特征在于，所述表达水平是指样本中分子标志物在血清中的含量与正常人均值相比的变化程度。
5.根据权利要求3的应用，其特征在于，所述表达水平是指样本血清中载脂蛋白M、激肽原1、血小板因子4、中间α-球蛋白抑制因子H4 35kDa片段亚型和载脂蛋白A-IV 26kDa片段亚型的表达与正常人的均值相比，显著降低且降低幅度≥50％；血清中载脂蛋白L1含量、载脂蛋白L1与载脂蛋白M含量比值、中间α-球蛋白抑制因子H4全长亚型与中间α-球蛋白抑制因子H4 35kDa片段亚型含量比值以及载脂蛋白A-IV全长亚型与载脂蛋白A-IV 26kDa片段亚型含量比值与正常人均值相比，是显著升高的且升高倍数≥3。
6.根据权利要求2的应用，其特征在于，所述的产品针对的检测技术包括可以检测一种或同时检测多种蛋白质的检测技术。
7.根据权利要求2的应用，其特征在于，所述的产品包括蛋白芯片、质谱技术、高通量蛋白质组学技术、ELISA、Western-blot或免疫组化。
8.根据权利要求2的应用，其特征在于，所述的样本包括血浆、血清、脑脊液或尿液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911360241.6A CN113024651A (zh) | 2019-12-25 | 2019-12-25 | 阿尔茨海默病生物标志物及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911360241.6A CN113024651A (zh) | 2019-12-25 | 2019-12-25 | 阿尔茨海默病生物标志物及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113024651A true CN113024651A (zh) | 2021-06-25 |
Family
ID=76458972
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911360241.6A Pending CN113024651A (zh) | 2019-12-25 | 2019-12-25 | 阿尔茨海默病生物标志物及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113024651A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080070995A1 (en) * | 2004-09-29 | 2008-03-20 | Jules Westbrook | Methods and Compositions Relating to Alzheimer's Disease |
| US20100124756A1 (en) * | 2008-10-10 | 2010-05-20 | Sandip Ray | Collection of biomarkers for diagnosis and monitoring of alzheimer's disease in body fluids |
| CN102762986A (zh) * | 2009-12-04 | 2012-10-31 | 兰多士实验有限公司 | 阿尔茨海默病的诊断方法 |
| US20130116132A1 (en) * | 2011-11-03 | 2013-05-09 | Diagenic Asa | Alzheimer's probe kit |
| CN105353135A (zh) * | 2015-11-23 | 2016-02-24 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 阿尔茨海默病标志物的用途 |
| CN109425739A (zh) * | 2017-08-31 | 2019-03-05 | 复旦大学 | 一组蛋白作为肿瘤标志物在制备恶性肿瘤诊断试剂和试剂盒中的用途 |
-
2019
- 2019-12-25 CN CN201911360241.6A patent/CN113024651A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080070995A1 (en) * | 2004-09-29 | 2008-03-20 | Jules Westbrook | Methods and Compositions Relating to Alzheimer's Disease |
| US20100124756A1 (en) * | 2008-10-10 | 2010-05-20 | Sandip Ray | Collection of biomarkers for diagnosis and monitoring of alzheimer's disease in body fluids |
| CN102762986A (zh) * | 2009-12-04 | 2012-10-31 | 兰多士实验有限公司 | 阿尔茨海默病的诊断方法 |
| US20130116132A1 (en) * | 2011-11-03 | 2013-05-09 | Diagenic Asa | Alzheimer's probe kit |
| CN105353135A (zh) * | 2015-11-23 | 2016-02-24 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 阿尔茨海默病标志物的用途 |
| CN109425739A (zh) * | 2017-08-31 | 2019-03-05 | 复旦大学 | 一组蛋白作为肿瘤标志物在制备恶性肿瘤诊断试剂和试剂盒中的用途 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| LU,W.等: "Specific changes of serum proteins in Parkinson’s disease patients", 《PLOS ONE》 * |
| MUENCHHOFF,J.等: "Changes in the plasma proteome at asymptomatic and symptomatic stages of autosomal dominant Alzheimer’s disease", 《SCI REP.》 * |
| SHI,X等: "Acute anti-inflammatory markers ITIH4 and AHSG in mice brain of a novel alzheimer’s disease model", 《J ALZHEIMERS DIS.》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sarna et al. | HLA-DQ: gluten tetramer test in blood gives better detection of coeliac patients than biopsy after 14-day gluten challenge | |
| Liu et al. | Extracellular vesicles in liquid biopsies: potential for disease diagnosis | |
| WO2010038974A9 (ko) | 이뮤노글로블린 에이 신증과 티지비엠 신증의 진단용 조성물 및 키트 | |
| CN115236166A (zh) | 肝病相关生物标志物和其使用方法 | |
| KR101941308B1 (ko) | 장, 혈액-뇌 장벽 투과성 검출 방법 및 테스트 물질 | |
| JP2009500641A (ja) | 多発性硬化症の診断方法 | |
| JP2009501922A (ja) | 凝集体形成性循環タンパク質形態を、該形態を凝集させる薬剤及び形成された凝集体を捕捉するための薬剤を用いて検出する方法 | |
| CN109655608A (zh) | 一种用于骨肉瘤诊断的外泌体蛋白及其即时检测方法 | |
| JP4721703B2 (ja) | 多発性硬化症を診断するための方法 | |
| Wang et al. | Gut microbial signatures and their functions in Behcet's uveitis and Vogt-Koyanagi-Harada disease | |
| CN108982868B (zh) | 核体蛋白sp110及含有该蛋白的试剂盒在制备酒精性心肌病早期诊断试剂中的应用 | |
| CN113024651A (zh) | 阿尔茨海默病生物标志物及其应用 | |
| CN108611343A (zh) | 一种从人体血液中性粒细胞的嗜天青颗粒中分离纯化天然蛋白酶3的方法 | |
| CN110333355B (zh) | 多蛋白组合物及应用与先天性心脏病肺动脉高压筛查试剂盒 | |
| CN111650381B (zh) | 蛋白标志物或其组合在制备急性乳腺炎诊断试剂盒上的应用 | |
| CN112858697B (zh) | ALG-2-interacting protein X在制备分子标志物中的应用 | |
| JPS6314911B2 (zh) | ||
| CN106636388A (zh) | 用于亨廷顿病诊断的基因及其应用以及由其编码的蛋白和蛋白的应用 | |
| EP2772759B1 (en) | Composition for diagnosis of lung cancer | |
| CN111398595A (zh) | 一种血浆小细胞外囊泡中的蛋白质tnfaip8的应用和检测方法 | |
| CN108459165B (zh) | Orai1蛋白作为心肌梗塞生物标志物的用途 | |
| WO2009051599A1 (en) | Use of biomarkers of alzheimer's disease for diagnostic tests and drug screening | |
| Ben-Bassat et al. | Changes in the Con-A-induced redistribution pattern of lymphocytes: a possible aid in the differential diagnosis between malignant lymphoma and other diseases | |
| CN103336127A (zh) | 一种早期肝病、肝纤维化和肝硬化指示剂与诊断剂 | |
| WO2023038071A1 (ja) | アルツハイマー病の検出方法および検出試薬 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20210625 |