CN108459165B - Orai1蛋白作为心肌梗塞生物标志物的用途 - Google Patents

Orai1蛋白作为心肌梗塞生物标志物的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种Orai1蛋白，特别是外周血血浆中的外泌体上的Orai1蛋白，作为凝血相关疾病，如心肌梗塞，生物标志物的用途。本发明的发明人发现人外周血血浆中的外泌体上Orai1蛋白的表达水平与凝血相关的疾病具有正向相关关系，据此提供对人外周血血浆中的外泌体上Orai1蛋白的表达水平进行定量分析用于诊断凝血相关的疾病风险的方法。另外，Orai1还可以为药物治疗等临床应用提供治疗靶点和重要依据。

Description

Orai1蛋白作为心肌梗塞生物标志物的用途
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种Orai1蛋白，特别是外周血血浆中的外泌体上的Orai1蛋白，作为凝血相关疾病，如心肌梗塞，生物标志物的用途。
背景技术
急性心肌梗死，又名心肌梗塞(AMI)是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死。按照世界卫生组织(WHO)标准：典型的胸痛、心电图改变和心肌酶异常三项指标中有两项符合，即可诊断AMI。AMI在临床表现上有心绞痛与无痛两种表现，在我国AMI病人无症状约占总患病人口的25％，无典型心绞痛表现的病例约占30％，临床上一般采用心电图进行诊断，心电图诊断AMI的准确性平均约60％。有确诊意义的病理性Q波常在发病6～8小时以后才出现，而目前心电图对诊断非Q波AMI缺乏特异性，由此不稳定心绞痛和小范围AMI难以鉴别，使得AMI早期心电图确诊率很低，然而其发病后1-6小时是溶栓治疗和介入手术治疗的黄金时间，所以快速诊断发病6小时内的早期心肌梗塞是决定治疗的关键环节。
2015年中国心血管病报告显示，自2002年到2014年AMI死亡率总体呈上升态势，从2005年开始呈快速上升趋势。2014年中国AMI死亡率城市为55.32/10万，农村为68.6/10万。自2013年，农村心肌梗死死亡率已超过城市并持续上升。
心肌损伤生化标志物的检测在急性心肌梗塞的诊断、监测、危险评估、预后和引导治疗等方面都起到了重要作用，目前常用的心肌损伤生化标志物有肌酸激酶同功酶(CK-MB)、肌钙蛋白(cTnI或CTNI)、肌红蛋白(Myoglobin)等。肌红蛋白作为心脏损伤早期标志物，其缺乏对心肌的特异性。心肌肌钙蛋白在数天后才会升高，因此难以在6小时内实现快速诊断。CK-MB虽然快速经济有效，但依然缺乏特异性。此三个标志物作为心肌梗塞检测的常规手段，都在心肌损伤生化标志物的在急性心肌梗塞早期诊断，尤其是发病6小时以内的早期诊断的敏感性和特异性方面有不足。因此，方便提取样本且特异性较好的诊断手段对心肌梗塞的早期诊断有着重要的意义。
经研究发现，细胞膜蛋白Orai1所构成的库操控的钙通道(store-operatedcalcium channels，SOCC)存在于人外周血血浆中提取的外泌体中。Orai1蛋白是血小板主要钙通道之一(Progress in Physiological Sciences,2012,43:417-421)，Orai1蛋白激活与血小板的凝血功能相关，参与GPVI诱导的库操控的钙流入(store-operated Ca2+entry SOCE)、凝血酶源激活和血栓形成(J Biol Chem,2010,285,23 629-23638)。Orai1高表达于血小板，研究发现，敲除Orai1后的小鼠与野生型小鼠相比，出现严重的CRAC通道缺陷，激动诱导性钙应答，活化受损和血栓形成(Blood,2009,113:2056-63)。Orail蛋白敲除会在体外实验中导致血小板聚集降低和在体内导致血栓形成(Ann N Y Acad Sci.2015,1356(1):45-79)。Orai1蛋白血小板生物活动和血栓形成过程中的重要性使得其有条件成为检测血小板活性的生物标记。
外泌体(exosome)，直径约为30-150nm，密度在1.13-1.21g/m1，是由细胞主动分泌的膜性囊泡，经过"内吞-融合-外排"等一系列调控过程而形成。外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、腹水和母乳。外泌体会携带源细胞独特或关键的功能分子，导致不同来源的外泌体有不同的生物学功能。因此根据外检测泌体所含的物质，去测定某些细胞内的某些蛋白质与核酸的变化具有可能性。目前，已经有许多疾病，包括某些肿瘤，可以对患者血浆中的外泌体进行检测，通过一定实验和数据分析方法研究样品中的蛋白质含量，对比正常个体的样品数据实现早期诊断，为疗效判断和预后提供重要依据。
已有多篇研究在外周血提取的外泌体中发现Orai1蛋白(J Biol Chem.2015,290(19):11983-11999)。血小板外泌体已被发现在凝血、血管再生等重要血液活动中有着关键作用，而血小板外泌体所携带的蛋白数量也会随着血小板功能改变而变化(Pharmacol.2016,7:293)。根据已有研究报道，本专利发明人假设在凝血障碍发生时，携带Orai1蛋白的外泌体大多来自于血小板，且血小板外泌体的蛋白表达及活性与血小板活动状态相关，并实验验证假设成立且外泌体较血小板更为敏感。综上所述，根据外周血提取的外泌体中Orai1蛋白表达情况，能够检测血小板功能的变化，从而有效的进行诊断。
经本专利研究发现，心肌梗死患者与健康个体的外泌体中Orai1蛋白表达具有差异性，因此Orai1蛋白具有成为心肌梗死早期生物标志物的可能，为早期心肌梗死中提供诊断，为患病程度和预后治疗提供依据。
发明内容
本发明一方面提供一种Orai1蛋白或其活性片段、检测Orai1蛋白或其活性片段的物质在制备凝血相关疾病的诊断产品中的应用。
优选地，所述诊断包括患有所述疾病的风险的诊断、所述疾病严重程度的诊断和所述疾病预后恢复的诊断等。
优选地，所述凝血相关疾病为血栓；更优选为心血栓。
在本发明的一个实施方案中，所述疾病为心肌梗塞，特别是心血栓引起的心肌梗塞。
优选地，所述诊断是通过测定样品中Orai1蛋白及其活性片段的含量进行的。
优选地，所述样品来源于哺乳动物，如人类、大鼠、小鼠等，更优选为人。
在本发明的一个实施方案中，所述诊断是通过测定外周血血浆中的外泌体上的Orai1蛋白的含量进行的。
在本发明的一个实施方案中，所述检测Orai1蛋白或其活性片段的物质为抗Orai1蛋白或其活性片段的抗体。
优选地，所述抗体为单克隆抗体和/或多克隆抗体。
优选地，所述的产品选自：试剂、药物、试纸、试剂盒、芯片等中的一种或多种。
在本发明的一个实施方案中，所述产品为试剂盒。
优选地，所述试剂盒包括抗Orai1蛋白或其活性片段的抗体。
优选地，所述抗体为单克隆抗体和/或多克隆抗体。
在本发明的一个实施例中，所述试剂盒为酶联免疫试剂盒。
在本发明的一个优选实施例中，所述酶联免疫试剂盒包括抗Orai1蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体；更优选地，所述单克隆抗体用作检测抗体，多克隆抗体用作捕获抗体。本领域技术人员可通过常规实验进行捕获抗体和检测抗体的配对筛选，获得结合信号较强的一对或多对捕获抗体和检测抗体，本发明对此不作具体限定。
在本发明的一个实施方案中，所述应用为Orai1蛋白或其活性片段、检测Orai1蛋白或其活性片段的物质在制备诊断患有凝血相关疾病(特别是心肌梗塞)的风险的产品中的应用。优选地；所述应用根据样品中Orai1蛋白(特别是外周血血浆中的外泌体上的Orai1蛋白)含量或含量的变化来诊断患有凝血相关疾病(特别是心肌梗塞)的风险；当样品中Orai1蛋白含量升高或其含量高于正常值时，特别是样品中Orai1蛋白含量均升高或其含量均高于正常值时，表明受试者患有凝血相关疾病(特别是心肌梗塞)的风险较高，且样品中Orai1蛋白含量偏离正常值的程度与患病风险呈正相关。
在本发明的另一个实施方案中，所述应用为Orai1蛋白或其活性片段、检测Orai1蛋白或其活性片段的物质在制备评估凝血相关疾病(特别是心肌梗塞)的治疗效果、判断凝血相关疾病(特别是心肌梗塞)的预后的产品中的应用。优选地，所述应用根据样品中Orai1蛋白(特别是外周血血浆中的外泌体上的Orai1蛋白)含量或含量的变化来评估凝血相关疾病(特别是心肌梗塞)的治疗效果或判断凝血相关疾病(特别是心肌梗塞)的预后；当样品中的Orai1蛋白含量降低时，特别是样品中Orai1蛋白含量均降低时，表明对凝血相关疾病(特别是心肌梗塞)的治疗有效或效果较好，或表明凝血相关疾病(特别是心肌梗塞)的预后较好。
本发明另一方面还提供一种试剂盒，所述试剂盒用于凝血相关疾病的诊断，其包括检测Orai1蛋白或其活性片段的物质。
优选地，所述诊断包括患有所述疾病的风险的诊断、所述疾病严重程度的诊断和所述疾病预后恢复的诊断等。
优选地，所述凝血相关疾病为血栓；更优选为心血栓。
在本发明的一个实施方案中，所述疾病为心肌梗塞，特别是心血栓引起的心肌梗塞。
优选地，所述诊断是通过测定样品中Orai1蛋白及其活性片段的含量进行的。
优选地，所述Orai1蛋白为外周血血浆中的外泌体上的Orai1蛋白。
优选地，所述样品来源于哺乳动物，如人类、大鼠、小鼠等，更优选为人。
在本发明的一个实施方案中，所述诊断是通过测定外周血血浆中的外泌体上的Orai1蛋白的含量进行的。
优选地，所述试剂盒中，所述检测Orai1蛋白或其活性片段的物质为抗Orai1蛋白或其活性片段的抗体。
优选地，所述抗体为单克隆抗体和/或多克隆抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述试剂盒包括抗Orai1蛋白的单克隆抗体和/或多克隆抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述试剂盒为酶联免疫试剂盒。
优选地，所述试剂盒中还包括外泌体提取产品(特别是从哺乳动物外周血血浆中提取外泌体的产品)，如外泌体提取试剂盒，其可为市售产品，也可根据现有技术公开的方法制备得到。
在本发明的一个优选实施例中，所述酶联免疫试剂盒包括抗Orai1蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体；更优选地，所述单克隆抗体用作检测抗体，多克隆抗体用作捕获抗体。本领域技术人员可通过常规实验进行捕获抗体和检测抗体的配对筛选，获得结合信号较强的一对或多对捕获抗体和检测抗体，本发明对此不作具体限定。
本发明中所述的抗Orai1蛋白或其活性片段的抗体可采用现有产品或已知方法制备，本发明对此不作具体限定。
本发明中所述酶联免疫试剂盒中还可包括其他成分，如包被缓冲液、洗涤液、稀释液、封闭液、终止液等，本领域技术人员可根据实际需要选择合适的溶液和用量等，本发明对此不作具体限定。
本发明另一方面还提供一种Orai1蛋白及其活性片段、检测Orai1蛋白或其活性片段的物质在筛选治疗和/或预防凝血相关疾病的药物中的应用。
优选地，所述凝血相关疾病为血栓；更优选为心血栓。
在本发明的一个实施方案中，所述疾病为心肌梗塞，特别是心血栓引起的心肌梗塞。
在本发明的一个实施方案中，所述检测Orai1蛋白或其活性片段的物质为抗Orai1蛋白或其活性片段的抗体。
优选地，所述抗体为单克隆抗体和/或多克隆抗体。
本发明另一方面还提供一种能够降低Orai1蛋白水平的物质在制备用于治疗和/或预防凝血相关疾病的药物中的应用。
优选地，所述凝血相关疾病为血栓；更优选为心血栓。
在本发明的一个实施方案中，所述疾病为心肌梗塞，特别是心血栓引起的心肌梗塞。
优选地，所述能够降低Orai1蛋白水平的物质可以是任何物质，如小分子化合物、生物大分子如蛋白质(如抗体、配体等)、多肽或核酸等，所述物质可以通过与Orai1蛋白的直接或间接作用来降低Orai1蛋白含量。
优选地，所述物质能够同时降低Orai1蛋白水平。
优选地，所述能够降低Orai1蛋白水平的物质为能够降低哺乳动物外周血血浆中的外泌体上Orai1蛋白水平的物质。
本发明的发明人发现人外周血血浆中的外泌体上Orai1蛋白的表达水平与凝血相关的疾病具有正向相关关系，据此提供对人外周血血浆中的外泌体上Orai1蛋白的表达水平进行定量分析用于诊断凝血相关的疾病风险的方法，这种方法操作简便，样本采集方便，能准确诊断多种疾病，优选如可以对心血栓、心肌梗塞等疾病的患病风险、疾病严重度以及预后风险等进行特异性诊断。另外，Orai1蛋白还可以为药物治疗等临床应用提供治疗靶点和重要依据。
附图说明
图1所示为根据本发明的实施方案中所测定的标准品的OD值的标准曲线(y＝0.0006x+0.021，R2＝0.9892)。
图2所示为本发明实施例4测定的正常未患病人群和心肌梗死患病人群的外周血浆分离出来的外泌体中Orai1蛋白的westernblot结果；其中，1和5分别为两位不同的健康志愿者外泌体Orai1蛋白样本，2-4分别为三位不同的心梗患者外泌体Orai1蛋白样本，M为Marker蛋白；Orai1蛋白的分子量约为50kDa左右，Actin蛋白为内参，其分子量大小为42kDa。
图3所示为本发明实施例4测定的心肌梗死患病人群的外周血浆分离出来的外泌体中Orai1蛋白表达与血小板提取的Orai1蛋白免疫印迹；其中，1、2和3分别为三位不同的心梗患者血样本，1a、2a和3a分别为患者的血小板提取Orai1蛋白样本，1b、2b和3b分别为患者的外周血提取的外泌体的Orai1蛋白样本；Orai1蛋白的分子量约为50kDa左右，Actin蛋白为内参，其分子量大小为42kDa。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
本发明中，所述Orai1来源于哺乳动物，特别是人类，其序列分别可见GenBank：AAH13386、GenBank：AFZ76986.1。所述的“其活性片段”是指Orai1蛋白的活性片段，例如，所述Orai1蛋白的活性片段是指具有Orai1蛋白功能的片段，其可以为Orai1蛋白的一部分，也可以为Orai1蛋白的氨基酸序列经过缺失、添加或替换后得到的片段，例如该活性片段为包含Orai1蛋白与配体或受体结合的部分的片段，或者经过氨基酸缺失、添加或替换后仍保留Orai1蛋白功能的片段。
本发明中，所述检测Orai1蛋白或其活性片段的物质为本领域所公知，或者其制备方法或获得方法为本领域所公知，通常情况下，其可以和Orai1蛋白或其活性片段特异性结合，通过检测该物质可以检测Orai1蛋白或其活性片段的存在或含量，例如，其可以为哺乳动物(如人类)体内天然存在的可以与Orai1蛋白或其活性片段结合的配体、受体或抗体，也可以为本领域技术人员制备的能够与Orai1蛋白或其活性片段特异性结合的抗体，如单克隆抗体和/或多克隆抗体。在本发明的一个实施例中，所述检测Orai1蛋白或其活性片段的物质为抗体，如单克隆抗体和/或多克隆抗体。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：外泌体提取
1工具
采血管、高速离心机、低温储存装置、SBI外泌体提取试剂盒。
2方法
2.1分离富集血小板血浆
2.1.1抽取静脉血8mL，用蓝色抗凝采血管(枸橼酸钠1：9)分装；
2.1.2 20℃，400g，离心25min，得到血小板富集的血浆(PRP)和细胞沉淀物，收集沉淀(白细胞和红细胞)；
2.1.3将离心得到的上清血浆转移至新的EP管中；
2.1.4 20℃，2200g，离心20min，得到沉淀(血小板)以及去血小板血浆。
2.2分离外泌体
2.2.1即时提取的去血小板血浆，4℃，16000g的条件，在离心机中离心10min；
2.2.2取上清用SBI试剂盒提取外泌体。
实施例2：抗体制备
1材料
1.1试剂
BL21(DE3)原核表达宿主菌、LB培养基、卡那抗生素、高亲和性NI树脂、琼脂糖凝胶、咪唑、尿素、NaCl、SDS、过硫酸铵、TEMED、丙烯酰胺、考马斯亮蓝、BCA蛋白浓度测定试剂盒、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂等。
2抗体制备流程：
根据要求设计得到Orai1基因序列，构建至原核表达载体或者真核表达载体。所表达的Orai1蛋白氨基酸序列参见GenBank：AAH13386。
2.1多抗制备
将上步表达纯化的Orai1蛋白与等体积的弗氏佐剂、YOULONG佐剂混合乳化均匀，成油包水状态，以备免疫兔子。对新西兰大白兔行皮下免疫3次，间隔30天，最后经ELISA检测，抗血浆滴度>1:50000。
耳缘静脉加强免疫，加强免疫半个月后采集兔血(全部采集)。
兔血离心20min(3000rpm，室温)，提取抗体，纯化后保存。
利用高亲和性NI树脂纯化蛋白，SDS-PAGE检测蛋白纯化效果可行。变性条件下纯化所得的蛋白进行梯度尿素复性，SDS-PAGE检测，蛋白复性效果可行。最终所得的Orai1蛋白纯度86％，蛋白浓度2mg/mL，蛋白量11mg。
2.2单抗制备
将上步表达纯化的Orai1蛋白与等体积的弗氏佐剂、YOULONG佐剂混合乳化均匀，成油包水状态，用于免疫小鼠，皮下免疫三次，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。
将细胞进行融合筛选后，对阳性孔进行克隆化，建立阳性细胞株，不少于50株细胞株。将建株的单克隆细胞扩大培养，并进行冻存。
2.3腹水单抗制备：
提前一周在小鼠腹腔注射矿物油，将一定数量的细胞注射入小鼠腹腔，11天左右收集腹水，5000rpm离心，得上清即为单克隆抗体腹水。纯化后，将纯化好的抗体用抗体稀释液进行梯度稀释，每孔100μl，37℃反应2h；洗板，每孔加入100μl酶标二抗，37℃反应2h；洗板，每孔加入100μl显色剂，室温避光反应20min，450nm读取OD值。以0.5作为截断值，得到抗体的效价。
2.4配对筛选
将上步纯化后的鼠单抗用pH9.6的碳酸盐缓冲液(包被液，下同)按照1:100倍稀释，100μL/孔加至多孔板，4℃包被过夜。洗液清洗包被板3次，10％羊血浆封闭(用pH9.6的碳酸盐缓冲液按照1:9倍稀释)，每孔150μL，恒温37℃封闭3小时。加入浓度梯度为1000、100、10、0ppb的Orai1蛋白溶液(高标)，加入阴性对照，100μL/孔，30℃温育60min。
将得到的单克隆抗体逐一常规标记辣根过氧化物酶作为检测抗体，洗液清洗包被板3次，加入2M H2SO4，终止反应，100μL/孔，在30分钟内于ELISA检测仪上读取波长450nm下的读数450nm读取OD(吸光度)值。
2.6结果
上步制备的单抗中，强阳性抗Orai1单抗与兔多抗进行配对或者强阳性单抗之间进行配对。根据最强结合信号，确定出最佳的包被抗体A和检测抗体B(酶标抗体B)。配对效果检测结果如表1所示。
表1配对效果检测结果
抗体编号 阳性 阴性
1 2.467 0.151
2 2.435 0.134
3 2.352 0.267
4 2.15 0.235
6 2.595 0.289
7 2.77 0.143
8 1.832 0.284
11 2.49 0.252
12 2.582 0.237
13 2.221 0.259
14 2.267 0.211
17 2.36 0.209
18 2.352 0.237
19 2.1 0.123
2.7灵敏度确定
选取配对筛选阴性值低、阳性值高的一对包被抗体A和检测抗体B，按照前述方法，加入不同浓度的标品与酶标抗体B，确定灵敏度与酶标抗体B使用浓度。灵敏度检测结果如表2所示。
表2灵敏度检测结果
Figure BDA0001611188560000111
Figure BDA0001611188560000121
实施例3：建立并优化ELISA测试方法
包括试剂的组成成分的确定，捕获和检测抗体用量的确定，以及对特异性和灵敏度的测试，组间和组内误差的测试，样品回收率的确定。该检测方法的检测灵敏度为4.5ng/mL，标准曲线为50ng/mL到1000ng/mL；对于样品浓度为109-920ng/mL的Orai1蛋白，回收率>90％。对于低浓度200ng/mL、中浓度500ng/mL和高浓度800ng/mL，其组内变异系数分别为3.56％、5.3％和5.9％，而组间的变异系数分别为6.56％、7.14％和9.34％。试剂盒真阳性率为：86.8％；特异度(真阴性率)：85.33％；假阳性率：4％；假阴性率15％。
实施例4：根据本发明的诊断试剂盒及其示例性诊断应用
表3试剂盒的组分
名称 数量
标准品冻干粉 1瓶
酶标记抗体工作液 1瓶
稀释液 2瓶
显色剂 1瓶
终止剂 1瓶
洗涤液 1瓶
1试剂
包被缓冲液，0.1M碳酸盐缓冲液(CB)，pH值为9.6；
稀释液，0.01mM磷酸盐缓冲液(PBS)，pH值为7.4；
洗涤液，含0.2％吐温-20的PBS；
封闭液，含1％BSA的CB；
终止液，2M H2SO4。
2ELISA板制备
大肠杆菌E.coli中原核表达并通过亲和纯化的Orai1蛋白，冷冻干燥机过夜抽干得到标准品冻干粉，根据具体的灵敏度稀释成不同的浓度：1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、50ng/mL、0ng/mL。取一定量的酶标记抗体B加入到稀释液中，充分混匀，使其终浓度为2μg/mL，(根据具体的条件而定)2-8℃避光保存。
移取一定量Orai1抗体于所需体积的包被液中，将包被工作液按每孔100μL加入酶标板微孔，4℃静置过夜。小牛血浆、水杨酸钠、蔗糖、使小牛血浆、水杨酸钠、蔗糖的浓度分别为10％、0.05％、5％，配置成封闭工作液，将封闭工作液按每孔150μL加入微孔，37℃烘焙3.5小时。弃去封闭液，真空热封。
使用本发明试剂盒(试剂盒组分如上表3所示)检测人体中的Orai1蛋白标准品或未知浓度外周血血浆外泌体样品。加标准品或未知浓度样品：
100μL的样品稀释液(空白对照)/标准品/未知浓度样品加入到对应的微孔中，轻轻振荡混匀，25℃避光环境中反应45min。检测蛋白浓度，-20℃储存。洗板3次，加入酶标抗体100μL/孔，轻轻振荡混匀，25℃避光环境中反应45min，加入显色剂100μL/孔，置于25℃避光环境中反应20min。加入100μL终止液/孔，轻轻振荡混匀，酶标仪设定至450nm，测定每孔OD值。
计算：利用统计学绘图软件，根据所测定的标准品的OD值绘制标准曲线，如图1所示；通过标准曲线和未知浓度样品的OD值就可计算出未知样品中Orai1蛋白。正常未患病人群和心肌梗死患病人群的外周血血浆中的外泌体上Orai1蛋白的结果如图2所示。心肌梗塞患病人群的外周血浆分离出来的外泌体中Orai1蛋白表达与血小板提取的Orai1蛋白表达结果对比如图3所示。
从图2中可见，正常人群中外泌体上Orai1蛋白表达量低于心肌梗塞患者外泌体上Orai1蛋白表达。由此可见，外泌体上的Orai1蛋白可以更好地反映凝血功能钙离子通道的改变。
由图3可见，在心肌梗死患者外泌体中提取Orai1蛋白表达相比血小板提取的Orai1蛋白表达增加量更加明显，因此外泌体中Orai1蛋白能更敏感地反映心梗的发生。
正常未患病人群和心肌梗死患病人群的外周血浆分离出来的外泌体中Orai1蛋白表达结果对比如表4所示(采用本发明中试剂盒定量结果)。
表4正常未患病人群和心肌梗死患病人群的外周血浆分离出来的外泌体中Orai1蛋白表达结果对比
Figure BDA0001611188560000141
从表4可见，在患病人群中，即使Orai1蛋白表达量较低的不稳定心绞痛组，其平均Orai1蛋白表达量也为正常人群表达量的2倍左右，因此可以通过将Orai1蛋白的表达量定量来诊断受试者是否存在凝血功能障碍，或者是否具有更高的发生血栓事件的风险。
分别检测外周血分离出来外泌体上Orai1蛋白表达和血浆中cTnI的表达，结果发现外泌体上Orai1蛋白表达能更好地预测cTnI的表达为阴性患者的发病及预后(p<0.005)，结果如表5所示。
表5外周血分离出来外泌体上Orai1蛋白表达和血浆中cTnI的表达检测结果
Figure BDA0001611188560000151
从表5中可知，cTnI初诊为阴性的患者也有可能进展为不稳定性心绞痛，并且有3个月再发心梗的风险，外泌体中Orai1蛋白高表达可以很好地将这部分阴性患者筛选出来，因为其表达增高预示着血小板凝集功能的增加。患病严重程度不同的病人的外周血外泌体Orai1蛋白表达量存在差异，或者说外周血外泌体Orai1蛋白表达量与病人的患病严重程度存在正相关的关系，因此可以通过血浆外泌体中Orai1蛋白的表达量定量来诊断受试者的患病严重程度、预后恢复等等。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种外周血血浆中的外泌体上的Orai1蛋白和/或检测Orai1蛋白的物质在制备心肌梗塞的定量诊断产品中的应用；
其中，所述诊断是通过测定外周血血浆中的外泌体上的Orai1蛋白的含量进行的；
其中，正常人群中外泌体上Orai1蛋白表达量低于心肌梗塞患者外泌体上Orai1蛋白表达量。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诊断包括患有心肌梗塞的风险的诊断、心肌梗塞严重程度的诊断和心肌梗塞预后恢复的诊断。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测Orai1蛋白的物质为抗Orai1蛋白的抗体。
4.如权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述的产品选自：试剂、试纸、试剂盒和芯片中的一种或多种。
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