CN101730845A - 用于确定stim2活性的测定法和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于确定STIM2活性水平的测定法和方法，从而提供了用于表征和研究细胞内钙水平调节的工具。

Description

用于确定STIM2活性的测定法和方法

相关专利申请相互引用

本专利申请主张2007年3月23日递交的美国临时专利申请No.60/896,581的权益，本文通过提述并入其全部内容用于所有目的。

发明领域

本发明一般地涉及CRAC通道及其与STIM1和STIM2的关联。特别地，本发明包括用于确定细胞中STIM2活性的测定法和方法。

发明背景

细胞内游离钙浓度([Ca²⁺]_i)的变化，是多种细胞响应的调节的最广泛和最重要的信号事件。许多类型的细胞利用钙池操纵的Ca²⁺内流(store-operated Ca²⁺entry)作为Ca²⁺内流的主要途径。这一机制在Ca²⁺从钙池释放之后参与作用，其中钙池的耗竭导致钙释放激活的Ca²⁺(CalciumRelease-Activated Ca²⁺，CRAC)通道的激活。最近的工作确定了基质相互作用分子(stromal interaction molecule，STIM1)和CRAC调节物1(CRACM1或Orail)是功能性钙池操纵Ca²⁺内流的必需组分。STIM1和CRACM1足以在异源表达系统中重建和放大CRAC电流。在哺乳动物中，存在这些蛋白质的多种同源体：内质网中的STIM1和STIM2，以及质膜中的CRACM1、CRACM2和CRACM3。STIM2在钙池操纵Ca²⁺内流中的作用似乎很复杂，尚未完全得到了解。

因此，需要有一种方法来评估STIM2的水平及其对CRAC通道活性的作用。

发明概要

因此，本发明提供了用于确定细胞中STIM2活性的测定法和方法。

在一个方面中，本发明提供了用于细胞中STIM2活性的测定法，包括测量Icrac的活性。在该测定法的一个优选的方面中，向细胞施加2-APB，且Icrac活性响应于该2-APB的施加而增加可指示所述细胞内一定水平的STIM2活性。在另一个方面中，Icrac活性的增加在没有钙池耗竭的情况下发生。

在另一个方面中，本发明提供了用于细胞中STIM2活性的测定法，包括在施加氨基糖苷抗生素之后测量Icrac活性。在该测定法的一个方面中，所述抗生素对Icrac活性的抑制指示细胞中一定水平的STIM2活性。

在进一步的方面中，本发明提供了用于具有免疫抑制性质的氨基糖苷抗生素的测定法。

附图简要说明

图1：(A)在STIM1+CRACM1细胞、STIM2+CRACM1细胞和受2μM2-APB刺激的STIM2+CRACM1细胞中由IP₃(20μM)诱发的平均CRAC电流密度。(B)在图A所示的STIM1+CRACM1表达细胞中由IP₃(20μM)诱发的或STIM2+CRACM1表达细胞中由2μM 2-APB诱发的CRAC电流的代表性电流-电压(I/V)关系。(C)在仅表达STIM2的HEK293细胞(紫色，n＝5)、仅表达CRACM1的HEK293细胞(黑色，n＝3)、表达STIM1+CRACM1的HEK293细胞(蓝色，n＝8)和在存在(红色，n＝9)或不存在(绿色，n＝6)G418的条件下生长的表达STIM2+CRACM1的HEK293细胞中的平均CRAC电流密度。在所有细胞中，使用20mM BAPTA和8mM CaCl₂将[Ca²⁺]_i缓冲保持在150nM。(D)在存在(红色，n＝7)或不存在(绿色，n＝5)G418的条件下生长的STIM2+CRACM1细胞中被50μM 2-APB诱导的-80mV下的高分辨率平均CRAC电流。

图2：数据来自无G418条件下生长的HEK293细胞。(A)在STIM2+CRACM1细胞中响应于20μM IP₃的平均CRAC电流密度的实例。数据来自不同的转染，展示了所观察到的各种电流表型。主要的表型是小双相(small dibasic)，包括快的第一相(primary phase)和慢的第二相(secondaryphase)(1)。其它转染的这两个相的幅值和动力学各有不同。(B)从图A所示代表性STIM2+CRACM1细胞提取的、在实验进行120s或300s时的CRAC电流的平均电流-电压(I/V)关系。数据代表由50ms、-100至+100mV的电压斜坡(ramp)引起的去除了泄漏的电流，并已针对细胞电容加以标准化(pA/pF)。(C)在用CRACM1(1)、CRACM2(2)和CRACM3(3)转染并用20mM BAPTA将[Ca²⁺]_i钳制在接近0的STIM2表达性HEK293细胞中由20μMIP₃诱发的平均CRAC电流密度。(D)在吸管中不存在G418(实心圆，n＝34)或存在300nM(空心圆，n＝9)，1μM(实心方形n＝11)，3μM(空心方形n＝8)，或10μM(实心三角形，n＝8)G418的情况下，STIM2+CRACM1细胞内的平均CRAC电流密度。(E)从图D所示记录中于300s处提取的平均CRAC电流密度作为G418浓度的函数的剂量-响应关系。用剂量-响应曲线拟合数据，得出IC₅₀值为520nM，Hill系数为1。(F)受50μM 2-APB刺激的STIM2+CRACM1细胞中的平均CRAC电流密度，其中用20μM IP₃诱导钙池耗竭并且用20mM BAPTA将[Ca²⁺]_i缓冲保持在接近0(黑色，n＝5)，或者不加IP₃并且将[Ca²⁺]_i缓冲保持于150nM以防止钙池耗竭(红色，n＝7)。颜色编码的条形指示两组数据中50μM 2-APB的施加。

图3：来自无G418条件下生长的HEK293细胞的数据。(A)STIM2+CRACM1细胞中的平均CRAC电流密度，其中由20μM IP₃+20mMBAPTA(3)或者被动地仅由20mM BAPTA(2)诱发钙池耗竭，或者通过不加IP₃并把[Ca²⁺]_i缓冲保持在150nM(1)来防止钙池耗竭。(B)在用等摩尔KCl替换Cs-谷氨酸盐，或者用20mM EGTA和8.9mM CaCl₂将[Ca²⁺]_i缓冲在150nM以防止钙池耗竭的溶液中，由20μM IP₃+20mM BAPTA诱发的STIM2+CRACM1细胞中的平均CRAC电流。其它两组数据的吸管溶液使用BAPTA和8mM CaCl₂将[Ca²⁺]_i缓冲在150nM，并额外含有3mM Mg-ATP和300μM Na-GTP或100μM钙调蛋白。(C)20μM IP₃+20mM BAPTA诱发钙池耗竭的STIM2+CRACM1细胞中的平均CARC电流。迹线代表分档(binned)实验数据，其中吸管串联电阻处于如下的范围：2-4MΩ，5-7MΩ，或7-9MΩ。(D)[Ca²⁺]_i的变化，作为在不存在(黑色)或存在(红色)1mM细胞外Ca²⁺的条件下用空载体转染的STIM2细胞中在340和380nm激发的fura-2荧光的比值加以测量。卡巴胆碱(100μM)的施加用箭头指示。(E)实验条件与图D相同，只是使用STIM2+CRACM1细胞。(F)这些迹线代表经差减后的图D和E的迹线，其中从用有Ca²⁺的溶液获得的[Ca²⁺]_i信号减去了无Ca²⁺溶液中的[Ca²⁺]_i信号，得到了净Ca²⁺内流。

图4：在稳定过表达STIM1或STIM2的细胞中响应于20μM IP₃的-80mV下的平均CRAC电流密度。[Ca²⁺]_i用20mM BAPTA钳制在接近0。数据表明，与野生型HEK293细胞相比，STIM1过表达可微弱增加CRAC电流，而STIM2过表达可微弱降低CRAC电流，其中野生型HEK293细胞产生的电流密度为～0.5pA/pF。(S2)在G418存在下生长的STIM1+CRACM1细胞(n＝7)中的平均CRAC电流。吸管溶液含有IP₃(20μM)和10μM G418，表明这些细胞大体上对细胞内G418不敏感。细胞外施加10μM G418导致CRAC电流微小且可逆的降低。(S3)无G418存在下生长的STIM2+CRACM1细胞(n＝7)中的平均CRAC电流。吸管溶液含有IP₃(20μM)以激活双相CRAC电流。条形指示不同浓度G418的细胞外施加。这些导致CRAC电流微小且可逆的降低：300nM(实心圆，n＝3)，1μM(空心圆，n＝4)和10μM(实心方形，n＝5)。

发明详细说明

缩写

“2-APB”是指2-氨基乙氧基二苯基硼酸(2-aminoethoxydiphenyl borate)。

“IP₃”是指肌醇1，4，5-三磷酸。

“STIM1”是指基质相互作用分子1。类似地，“STIM2”是指基质相互作用分子2。

“CRAC通道”是指钙释放激活的Ca²⁺通道。

定义

单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数的指代对象，除非上下文中明确地另有教导。因此，例如，在指称用于投递“一种药物”的组合物时，包括指称一种、两种或更多种药物。

“STIM2活性”是指STIM2对CRAC通道功能的作用，包括但不限于电流幅值、激活和失活动力学，以及药理学。

“Icrac活性”是指钙释放激活的钙通道(calcium release activated calciumchannel)的活性。该活性可以通过本领域已知的方法进行观察和定量，包括钙水平荧光显像和离子电流(包括钙电流)的电生理测量。

CRACM1、CRACM2和CRACM3是CRAC通道同源物。

引言

CRAC通道受细胞内钙池特别是内质网的钙释放的激活。这些通道在包括肌肉收缩、蛋白和液体分泌以及细胞生长和增殖的控制在内的多种多样的细胞功能的调节中是关键性的因素。

对异源表达的CRAC通道同源物的研究已经显示，这些通道的激活受到多种细胞因子的调节，包括STIM1和STIM2。STIM1充当内质网中的钙传感器，在钙池耗竭(store depletion)之后向质膜移动以结合并激活CRACM1通道。STIM2活性的表征不如STIM1那样充分，但早期研究提示，STIM2对CRAC通道活性的影响与STIM1非常不同。本发明提供了这样的测定法和方法，它们利用CRAC通道的与STIM2相关的功能性质来确定细胞中STIM2的活性水平。

药理学

化合物2-氨基乙氧基二苯基硼酸(2-APB)是一种在低剂量下(≤5μM)对CRAC电流有促进效果，但在高剂量下(≥10μM)则抑制CRAC电流的化合物。当用更高浓度例如50μM的2-APB刺激细胞时，CRAC电流快速激活，然后立即通过被2-APB的抑制性作用所遏制(curtail)，这导致内向电流的瞬时浪涌(图1C)。当不加IP₃并且对[Ca²⁺]_i加以缓冲以避免钙池耗竭时，有可能在施加2-APB时诱发电流，但是此效果是过表达STIM2和CRACM1的细胞特有的，在仅过表达STIM2或CRACM1的细胞中或者在过表达STIM1和CRACM1组合的细胞中是观察不到的(图1C)。因此，在有可能利用STIM1-和STIM2-相关CRAC通道在药理学上的差异测定细胞中STIM2的活性水平(图1C和1D)。

在一个方面中，本发明利用这些药理学性质提供了一种细胞内STIM2活性测定法。该测定法包括测量Icrac活性对2-APB的响应。Icrac活性响应于2-APB的提高指示在所述细胞中存在一定水平的STIM2活性。在进一步的方面中，这种针对2-APB的响应在没有钙池耗竭的条件下发生。

STIM2活性还可以被氨基糖苷抗生素所调节，所述氨基糖苷抗生素例如链霉素、艮他霉素、妥布拉霉素、阿米卡星(amikacin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、氨曲南(aztreonam)、头孢他定(ceftazidime)、头孢噻肟(cefotaxime)、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异恶唑(trimethoprim-sulfamethoxazole)、哌拉西林-他唑巴坦(piperacillin-tazobactam)、替卡西林-克拉维酸(ticarcillin-clavulanate)和G418(也称作遗传霉素)。

G418的存在似乎不会损害STIM1-依赖的CRACM1电流激活。在G418中生长的STIM1细胞产生的CRACM1电流的性质与由没有暴露于该抗生素的细胞所产生的电流的性质相似。然而，G418对STIM2介导的信号传导有损害。在无G418条件下生长的HEK293细胞对2APB显示更强的响应。而且，在暴露于该抗生素时，STIM2细胞不对IP₃诱发的钙池耗竭产生响应，但在无G418条件下生长的细胞在钙池耗竭时确实显示CRACM1电流激活。这种效应在共表达STIM1和CRACM1的细胞中观察不到。

因此。在另一个方面中，本发明提供了一种细胞中STIM2活性的测定法，包括在施加氨基糖苷抗生素之后测量Icrac的活性。在该测定法的一个实施方案中，抗生素对Icrac活性的抑制指示细胞中存在一定水平的STIM2活性。在一个优选实施方案中，抗生素对Icrac活性的抑制是通过STIM2抑制Icrac的钙池耗竭诱导激活(inhibition of store depletion-induced activationof Icrac via STIM2)而发生的。在本发明的一个优选实施方案中，抗生素活性的效应被2-APB的施加所克服；2-APB的这种作用可作为细胞中STIM2活性的进一步指示。

某些氨基糖苷抗生素，如多柔比星(doxorubicin)，已经被证明具有免疫抑制作用，特别是当与细胞因子如白介素-2联用时(Ewens et al.，Cancer Res.，(2006)，66(10)：5419-26)。因此，可以使用本发明的测定法，通过鉴定可抑制Icrac活性的氨基糖苷抗生素来筛选具有免疫抑制作用的氨基糖苷抗生素。

STIM2的过表达与脑恶性相关

脑恶性(brain malignancy)，例如多形性胶质母细胞瘤，以具有复杂的结构性和遗传性变异为特征。对多形性胶质母细胞瘤中基因拷贝数改变的研究显示，包括STIM2在内的某些基因在这些恶性中过表达，表明这些分子在这些肿瘤的发病机理中具有潜在的作用。(Ruana et al.，Molecular Cancer，(2006)，5：39.)。其他的研究显示，STIM2在小脑神经元的发育中发挥作用，特别是在脑桥神经突的细化(elaboration)中。(Hansen et al.，Brain Res.Mol.Brain.Res.(2004)，124(2)：165-77)。因此，STIM2活性的鉴定可用于表征和诊断脑恶性和神经发育的某些方面。

在本发明的一个实施方案中，STIM2活性测定法中使用的细胞来源于哺乳动物受试者。在优选实施方案中，细胞来源于所述哺乳动物受试者的脑，并且STIM2活性的存在指示脑恶性。

STIM2与免疫系统

CRAC通道在免疫系统的所有细胞中都有发现，包括T淋巴细胞和B细胞。作为CRAC通道功能的调节物，STIM1和STIM2也在这些细胞的功能性质中发挥重要作用。因此，本发明的测定法可以用于筛选可影响免疫系统的作用剂。

参考下面的非限制性实施例可更好地理解本发明。这些实施例是为了示例本发明而提供的。如下给出的实施例是为了更全面地例证本发明的优选实施方案，不应当认为在任何方面对本发明的宽广范围具有限制。

实施例

实施例I：STIM1或STIM2与CRACM1的异源共表达

利用稳定过表达STIM1或STIM2的HEK293细胞的实验证实，这两种蛋白质均可微细地调节内源I_CRAC。作为对由肌醇1，4，5-三磷酸(IP₃)导致的Ca²⁺池耗竭的响应，与野生型细胞相比(～0.5pA/pF)，STIM2表达细胞显示减小的I_CRAC(～0.2pA/pF)，而STIM1表达细胞显示略微增大的I_CRAC(～0.8pA/pF)(图4)。STIM1细胞产生了大的CRAC电流，而STIM2细胞则不然(图1A)。与先前的报道相反，在这些条件下，没有容易分辨的组成型CRAC通道活性，尽管在破膜(break-in)时可能有＜1pA/pF的微小基础CRAC电流未被察觉到。然而，在-80mV下存在非常缓慢演化的小CRAC电流，平均大小为-1pA/pF。

在21-25℃下以高密封全细胞模式实施膜片钳实验。用EPC-9(HEKA)获得高分辨率的电流记录。在100-700sec期间以0.5Hz的速度从0mV的保持电位输送跨度范围为-100至+100mV、持续时间为50ms的电压斜坡。全部电压针对10mV的液体接界电位进行修正(3mV，以Cl^-作为主要内部阴离子)。电流以2.9kHz滤波，并以100μs间隔数字化。在每次电压斜坡之前对电容电流进行测定和修正。从每个斜坡电流记录提取出-80mV下的电流幅值，估计电流的低分辨率时间演化(temporal development)。在适用情况下，平均数据的统计误差以n次测定的平均值±S.E.M.给出。标准外部溶液如下(单位是mM)：120NaCl，10CsCl，2.8KCl，2MgCl₂，10CaCl₂，10TEA-Cl，10HEPES，10葡萄糖，用NaOH调节至pH 7.2，300mOsm。在一些实验中，向标准外部溶液添加2μM或50μM 2-氨基乙氧基二苯硼酸盐(2-APB)或10μM G418，并通过宽头吸管(puffer pipett)施加。标准内部溶液如下(单位是mM)：120Cs-谷氨酸盐、8NaCl、10Cs·BAPTA、3MgCl₂、10HEPES、0.02IP₃、用CsOH调至pH 7.2、300mOsm。如图例中标出的，对于一些实验，用20mM Cs·BAPTA和8mM CaCl₂或20mM Cs·EGTA和8，9mM CaCl₂将[Ca²⁺]_i缓冲保持在150nM。对于被动耗竭实验，内部溶液在不存在IP₃和Ca²⁺的条件下添加Cs·BAPTA。在一些实验中，将Cs-谷氨酸盐和Cs·BAPTA等摩尔替换为KCl和K·BAPTA。其它实验中，向细胞内溶液添加G418，Na·ATP和Na·GTP或钙调蛋白，如图例中标明的。所有的化学品均购自于Sigma-Aldrich公司。

对于荧光测量，将盖玻片上生长的细胞置于含有下述成分(单位是mM)的外部溶液中：107NaCl、7.2KCl、1CaCl₂、1.2MgCl₂、11.5葡萄糖、10HEPES、用NaOH调节至pH 7.2，并在20℃下加载fura-2乙酰氧甲酯(2μM)30min。清洗细胞，并让染料在20℃下去酯化最少30min。根据皂角苷透化后剩余的信号确定，大约95％的染料被限制在细胞质内。将盖玻片上的细胞置于有或无1mM CaCl₂的外部溶液中。Ca²⁺测量使用InCyt双波长荧光成像系统(Intracellular Imaging Inc.)。用340和380nm激发，监视505nm的荧光发射；细胞内Ca²⁺测量结果表示为从各组(35-45个)单细胞获得的340/380nm比值。这些Ca²⁺测量结果的细节在前面有介绍。显示的所有测量结果均代表至少3次独立的实验。

实施例II：在STIM1和STIM2存在下CRACM1电流的药理学

尽管缺少IP₃诱发的CRACM1电流，通过外加2μM的2-氨基乙氧基二苯基硼酸(2-APB，图1A)可诱发具有典型的内向整流型电流-电压关系的大CRACM1电流(图1A和B)。2-APB是一种在低剂量(≤5μM)时对CRAC电流有促进作用，但在高剂量(≥10μM)时抑制CRAC电流的化合物。事实上，当用50μM 2-APB的更高浓度刺激细胞时，CRAC电流迅速激活，然后立刻被2-APB的抑制作用所遏制，导致内向电流瞬时浪涌(图1C)。膜片吸管(patch pipette)中未加IP₃，而且[Ca2+]_i被缓冲保持在150nM以避免任何类型的钙池耗竭，因此，这里观察到的2-APB的效应不需要钙池耗竭。

为了更好地解析这一响应的动力学，在-80mV的固定膜电位下获得了2-APB的效应的高分辨率记录。从图1D可见，2-APB诱发的电流在数秒内激活，然后迅速被阻断，产生一个瞬时电流。这种2-APB诱发的效应是过表达STIM2和CRACM1的细胞所特有的，在仅过表达STIM2或CRACM1的HEK293细胞，或者过表达STIM1和CRACM1的组合的HEK293细胞中都观察不到(图1C)。

上面的结果提示，STIM2不能响应IP3诱发的钙池耗竭而激活CRACM1通道，而2-APB可导致显著的CRACM1激活，这种机制需要STIM2的存在。

实施例III：氨基糖苷抗生素对STIM1和STIM2活性的影响

氨基糖苷类抗生素G418所致的药理学效应使得STIM2的行为变得更复杂。G418通常被用于生长培养基中以保持稳定转染STIM1或STIM2的细胞的筛选压力。在G418中生长的STIM1细胞产生的CRACM1电流(见图1A)与在没有暴露于G418的共表达STIM1和CRACM1的wt HEK293细胞中产生的电流具有相似的性质，可见G418的存在不损害STIM1依赖的CRACM1电流的激活。然而，STIM2介导的信号传导实际上受到G418的损害。过表达STIM2的HEK293细胞在不存在G418的条件下生长数天或数周后，显示对2-APB的响应提高，并且对钙池耗竭的响应截然不同。图1C和D显示，这些细胞响应于50μM 2-APB的动力学显著更快，电流幅值更大。然而，最显著的差异在于，这些细胞现在响应于IP₃诱发的钙池耗竭而产生形状和幅值各异的放大的CRAC电流(图2A)。在大多数细胞中观察到的主要CRAC电流表型是以双相激活模式为特征，由一个小而快速的激活相和一个后随的较缓慢的相组成，后者开始于～100s之后并且很少达到稳定状态，甚至在600s之后也不会(另见图2C和图3)。对于这种双相表型，在实验开始后300s获得的-80mV下的电流幅值为大约-15pA/pF。然而，在一些转染和细胞群体中，观察到高达-120pA/pF并具有主要是快速激活动力学的大电流，似乎第二相相对较小或者不存在(见例如图2A)。在所有这些情况下，被IP₃激活的电流具有CRAC电流的典型I/V曲线(图2B)。

既然在无G418条件下生长的细胞对IP₃诱发的钙池耗竭有响应，可以通过用限定浓度的G418灌注(perfuse)细胞来评估这种抗生素对STIM2介导的CRACM1激活的抑制作用。图2D图解了递增浓度的G418对IP₃诱导的CRACM1电流的两个相的剂量依赖性抑制作用，半最大抑制浓度为0.5μM(图2E)。在相同的实验条件下——其中将10μM G418灌注于细胞内——它没有改变共表达STIM1和CRACM1的细胞中的IP₃诱发CRAC电流(见图5)。虽然G418的最强效应似乎是从细胞内空间介导过来的(mediated fromintracellular space)，并特异地影响STIM2表达细胞，但是在从细胞外侧以10μM施加时，这种氨基糖苷也会有—些抑制作用。然而，这种效应似乎并不是STIM2特异性的，因为它在表达STIM1和STIM2细胞中是相似的(图5和6)，这提示它可能是针对CRACM1的药理学作用。因此，这种由细胞内G418(可能还有其它的氨基糖苷类抗生素)导致的、针对STIM2介导的CRAC电流的特异而强烈的抑制作用，是评估天然细胞系统中STIM2功能的强有力的药理学工具。

实施例IV：对CRAC通道和STIM1和STIM2活性具有影响的胞质因子的研究

2-APB在STIM2和CRACM1表达细胞(STIM2-andCRACM1-expressing cells)中可激活CRAC电流，并且也能克服G418介导的抑制，无论钙池的充盈状态如何。用如下的实验方案评估2-APB在无G418条件下生长的STIM2和CRACM1表达细胞中的作用：其中用IP₃主动诱导钙池耗竭，或者通过用无IP₃溶液灌注细胞并将[Ca²⁺]_i缓冲保持在150nM从而防止钙池耗竭(图2F)。在两种情况下，50μM 2-APB均能够激活大的瞬时CRAC电流，这可能是通过招募不依赖钙池的、预先偶联的STIM2和CRACM1复合体(另见图1C)。有趣的是，在洗掉2-APB之后，CRAC电流重新激活，并在实验持续期间保持活跃，不管钙池是空的还是保持充满的。如果电流的第二相是由于钙池耗竭所致，那么它应当在IP₃灌注的细胞中重新激活，而不会在钙池充盈的细胞中重新激活。

考察了第二相实际上是由于钙池耗竭导致的还是由于某些其它过程导致的。图3A显示，在通过IP₃主动耗竭钙池的过程中(存在20mM BAPTA以将[Ca²⁺]_i缓冲保持到接近0)产生的电流具有CRACM1电流典型的双相激活。当用仅含有20mM BAPTA的吸管溶液灌注细胞以诱导被动的钙池耗竭时，CRAC电流的快相消失，仅能够观察到第二相，这与钙池依赖的激活一致。然而，用不含IP₃并将[Ca²⁺]_i缓冲在150nM以防止钙池耗竭的溶液灌注细胞时仍然产生了缓慢的第二相。这些结果提示，第一相是由于钙池耗竭导致的，但第二相的产生与细胞内钙池的充盈状态无关。因此，第二相或者是被我们吸管填充溶液的一些成分激活的，或者它是由于某些组成性抑制CRAC通道的细胞质因子的损失导致的。

通过改变标准吸管填充溶液的主要成分研究了这些可能性。如图3B所示，用KCl完全替换主要胞内盐Cs-谷氨酸盐对于抑制由IP₃诱导的第二电流组分无效，并且在通过将[Ca²⁺]_i缓冲保持在150nM而阻止了钙池耗竭的细胞中用等摩尔浓度的EGTA替换主螯合剂BAPTA也不能抑制第二相。因此，第二CRAC电流相可能是由于某种尚未鉴定的细胞因子被洗去的结果。

为了证实有某种细胞质因子在激活第二电流组分，对吸管头的直径进行变化，并分析所得的双相电流。较小的吸管头(具有更高的串联电阻)将会降低细胞质抑制物的扩散逃逸速度，而如图3C所示，这确实延缓了第二相的产生。该细胞质因子似乎不是两种主要细胞质核苷酸之一，因为添加生理浓度的ATP(3mM)和GTP(0.3mM)均不能抑制第二相。同样，在用100μM钙调蛋白灌注的细胞中也观察到了第二相(图3B)。

在完整细胞中，内源抑制物不能逃逸，因此，可以预期在STIM2对CRAC通道的初始钙池操纵激活之后会发生抑制，从而产生一个瞬时的钙池操纵的Ca²⁺内流相。对此完整细胞中进行了验证，其中完整细胞负荷有Ca²⁺指示剂fura-2，并利用卡巴胆碱通过毒蕈碱受体激活钙池操纵的Ca²⁺内流。该实验同时在存在和不存在细胞外Ca²⁺的条件下，在用空载体或用CRACM1瞬时转染的稳定表达STIM2的HEK293细胞中进行。如图3D和E所示，转染了空载体且过表达CRACM1的细胞[Ca²⁺]_i瞬时增加，其不依赖于由IP₃介导的Ca²⁺从细胞内钙池释放而产生的细胞外Ca²⁺。正如所预期的，在两种细胞群体中细胞外Ca²⁺的存在均产生了一个高[Ca²⁺]_i的平台相，这是由于钙池操纵的Ca²⁺内流导致的。然而，CRACM1表达细胞在由于STIM2导致的钙池操纵激活的释放瞬间之后显示出更加显著的肩部。

为了进一步阐明两个群体中Ca²⁺内流的差异，从Ca²⁺存在时获得的信号中减去不存在Ca²⁺时获得的信号，以获得两种细胞群体中的净内流成分。从图3F可以看出，CRACM1表达细胞的钙池操纵的钙内流瞬时增加，随后衰退到与空载体转染细胞相似的水平。这种钙池操纵的钙内流的瞬时增加反映了在钙池耗竭之后STIM2诱导的与CRACM1通道偶联的钙池操纵Ca²⁺内流。

Claims (8)

1.用于细胞中STIM2活性的测定法，包括测量Icrac活性，其中在没有钙池耗竭的情况下Icrac活性响应于2-APB的施加而提高指示所述细胞中一定水平的STIM2活性。

2.用于细胞中STIM2活性的测定法，包括在施加氨基糖苷抗生素之后测量Icrac活性，其中Icrac活性被所述抗生素抑制指示所述细胞中一定水平的STIM2活性。

3.权利要求1的测定法，其中所述Icrac活性的抑制被2-APB的施加所克服。

4.权利要求1的测定法，其中所述细胞来源于哺乳动物受试者。

5.权利要求4的测定法，其中所述细胞来源于所述哺乳动物受试者的脑。

6.权利要求5的测定法，其中STIM2活性的存在指示脑的恶性。

7.权利要求3的测定法，其中所述Icrac活性的抑制进一步将所述氨基糖苷抗生素鉴定为免疫抑制剂。

8.用于可调节STIM2活性的作用剂的测定法，包括在没有钙池耗竭的条件下测量Icrac活性对施加2-APB的响应，其中将可调节所述Icrac活性的作用剂鉴定为可调节STIM2活性的作用剂。

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