JP5167288B2 - Stim2活性を決定するアッセイおよび方法 - Google Patents
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Description
[0001] 本出願は、参照によりすべての目的でその全体が本明細書に組み込まれている、2007年3月23日出願の米国特許仮出願第60/896581号の出願日の利益を主張する。
[0012] 「2−APB」は、ホウ酸2−アミノエトキシジフェニルを指す。
[0016] 文脈により別段明確に指示されていない限り、「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」には複数への言及が含まれる。したがって、例えば、「薬物」を送達するための組成物への言及は、1、2またはそれより多い数の薬物への言及が含まれる。
[0020] CRACチャネルは、細胞内貯蔵、とりわけ小胞体からのカルシウム放出によって活性化される。これらのチャネルは、筋肉の収縮、タンパク質および液体の分泌ならびに細胞の成長および増殖の制御を含めた広範な細胞機能の調節における主要因子である。
[0022] ホウ酸2−アミノエトキシジフェニル(2-APB)は、低用量(≦5μM)ではCRAC電流への亢進作用を有するが、高用量(≧10μM)ではそれらを抑制する化合物である。細胞がさらに高い濃度、例えば50μMの2−APBで刺激された場合、CRAC電流は、迅速に活性化され、その後直ちに2−APBの阻害作用によって縮小し、その結果、内向き電流の一過性サージをもたらす(図1C)。貯蔵枯渇を避けるために、IP3を取り除き、[Ca2+]iを緩衝化した場合、2−APBの適用の際に電流を誘導することが可能である。しかし、この作用は、STIM2およびCRACM1を過剰発現する細胞に特異的であり、STIM2またはCRACM1のいずれかを単独で過剰発現する細胞でも、STIM1およびCRACM1の組合せを過剰発現する細胞でも観察されない(図1C)。したがって、STIM1に会合したCRACチャネルとSTIM2に会合したCRACチャネルとの間の薬理の相違を用いて、細胞内のSTIM2活性のレベルをアッセイすることが可能である(図1Cおよび1D)。
[0028] 多形膠芽腫などの脳悪性腫瘍は、複雑な構造的変化および遺伝的変化を特徴とする。多形膠芽腫における遺伝子コピー数変化の研究は、STIM2を含めた特定の遺伝子がこれらの悪性腫瘍で過剰発現されていることを示し、これらの腫瘍の発病機序におけるこれらの分子の潜在的役割を示した(Ruana et al.、Molecular Cancer、(2006)、5:39)。他の研究は、STIM2が小脳ニューロンの発生、特に脳橋神経突起の精密化における役割を演じていることを示した(Hansen et al.、Brain Res. Mol. Brain. Res.(2004)、124(2):165-77)。したがって、STIM2活性の同定を用いて、脳悪性腫瘍および神経発生のある種の側面を特徴付け、診断することができる。
[0030] CRACチャネルは、Tリンパ球およびB細胞を含めた、免疫系の細胞全体で見出されている。CRACチャネル機能の調節因子として、STIM1およびSTIM2も、これらの細胞の機能特性で重要な役割を演じている。したがって、本発明のアッセイを利用して、免疫系に影響を与える作用物質をスクリーニングすることができる。
[0032] ST1M1またはST1M2を安定的に過剰発現するHEK293細胞を用いた実験から、両方のタンパク質が内在性ICRACをわずかに改変することが確認された。イノシトール1,4,5−三リン酸(IP3)によるCa2+貯蔵枯渇に反応して、STIM2発現細胞は、低減したICRAC(約0.2pA/pF)を示し、STIM1発現細胞は、野生型細胞(約0.5pA/pF)と比較してわずかに増大したICRAC(約0.8pA/pF)を示した。(図4)。STIM1細胞は、大きなCRAC電流を発生させたが、STIM2細胞は発生させなかった(図1A)。以前の報告とは対照的に、ブレークイン時(at break-in)における<1pA/pFの小さな基底CRAC電流は見落とした可能性があるが、これらの条件下では、CRACチャネルの容易に識別可能ないかなる構成的活性も存在しなかった。しかし、平均して、−80mVで約−1pA/pFに達する極めて緩徐に発生する小さなCRAC電流が存在した。
[0035] 2μMのホウ酸2−アミノエトキシジフェニル(2-APB)の外部適用によって、IP3誘導のCRACM1電流がないのにもかかわらず、通常は内向き整流性の電流−電圧関係を有する大きなCRACM1電流(図1、AおよびB)を誘導できる(図1A)。2−APBは、低用量(≦5μM)ではCRAC電流への亢進作用を有するが、高用量(≧10μM)ではそれらを抑制する化合物である、実際、50μM 2−APBというさらに高い濃度で細胞を刺激した場合、CRAC電流は、迅速に活性化され、そして直ちに2−APBの阻害作用によって縮小し、その結果、内向き電流の一過性サージをもたらした(図1C)。IP3をパッチピペットから取り除き、[Ca2+]iを150nMに緩衝化して、いかなる種類の貯蔵枯渇も回避した。したがって、ここで観察された2−APBの作用は貯蔵枯渇を必要としていなかった。
[0038] STIM2の挙動は、アミノグリコシド抗生物質であるG418によって引き起こされる薬理作用によって複雑化されていた。G418は、STIM1またはSTIM2で安定的に形質移入されている細胞の選択圧を維持するために、増殖培地中で慣行的に使用されていた。G418中で増殖させたSTIM1細胞は、G418に曝露されないままであったwt HEK293細胞内でのSTIM1およびCRACM1の同時発現によって生成されたものと類似した特性を有するCRACM1電流を生成させるので(図1Aを参照)、G418の存在は、STIM1依存的なCRACM1電流の活性化を損なっていなかった。しかし、事実上、STIM2媒介のシグナル伝達はG418によって損なわれていた。G418の非存在下で数日または数週間増殖させた、STIM2を過剰発現するHEK293細胞は、2−APBに対する増強された反応を示し、かつ貯蔵枯渇に対して著しく異なった反応を示した。図1CおよびDは、これらの細胞が、有意に、より速い動態(速度論)およびより大きな電流振幅で50μMの2−APBに対して反応することを実証している。しかし、最も重要な相違は、これらの細胞がこの場合には、様々な形および振幅の増幅されたCRAC電流を発生させることによってIP3誘導の貯蔵枯渇に反応したことであった(図2A)。大部分の細胞で観察される支配的なCRAC電流表現型は、小さくて速い活性化相と、それに続く、約100秒後に始まり600秒後にさえ定常状態にめったに達しない、より遅い相とからなる二相性活性化パターンを特徴とする(図2Cおよび図3も参照)。この二相性表現型のため、実験に入って300秒で得られた−80mVの電流振幅は約−15pA/pFであった。しかし、一部の形質移入および細胞集団では、二次相が比較的小さいか、または存在しないかのごとく、最大−120pA/pFまでの、より大きな電流と、顕著に速い活性化動態(活性化速度論)が観察された(例えば図2Aを参照)。これらのすべての場合で、IP3によって活性化された電流は、CRAC電流に典型的なI/V曲線を有していた。(図2B)。
[0040] 2−APBは、STIM2発現細胞およびCRACM1発現細胞のCRAC電流を活性化し、貯蔵の充填状態に関係なく、G418媒介の抑制を克服することができる。貯蔵枯渇を、IP3によって能動的に誘導するか、またはIP3を含まない溶液で細胞を灌流し、かつ[Ca2+]iを150nmに緩衝化することによって阻止する実験プロトコールを用いて、G418の非存在下で増殖させたSTIM2発現細胞およびCRACM1発現細胞における、2−APBの作用を評価した(図2F)。両方の場合とも、50μM 2−APBは大きな一過性のCRAC電流を活性化することができた。これはおそらく、貯蔵に依存しない予め連結されたSTIM2およびCRACM1複合体の動員によるものである(図1Cも参照)。興味深いことに、2−APBを洗い出した後に、CRAC電流が再活性化され、貯蔵が空であったか、または充填されたままであったかに関係なく、実験時間中、活性のまま残った。もしこの電流の第2相が貯蔵枯渇によるものだったならば、それは、IP3灌流細胞の場合には再活性化されたが、充填された貯蔵を有する細胞では再活性化されなかったはずである。
Claims (11)
- 細胞内のSTIM2活性のアッセイであって、該細胞はSTIM2及びCRACM2で形質移入されており、前記アッセイは、Icrac活性を測定するステップを含み、カルシウム貯蔵枯渇の非存在下での2−APBの適用に反応したIcrac活性の増大が、前記細胞内のSTIM2活性のレベルを示すアッセイ。
- 細胞内のSTIM2活性のアッセイであって、抗生物質の適用後のIcrac活性を測定するステップを含み、前記抗生物質によるIcrac活性の抑制が、前記細胞内のSTIM2活性のレベルを示すアッセイ。
- 前記抗生物質が、アミノグリコシドである、請求項2に記載のアッセイ。
- Icrac活性の前記抑制が2−APBの適用によって克服される、請求項2に記載のアッセイ。
- 前記細胞が哺乳動物対象に由来する、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記細胞が前記哺乳動物対象の脳に由来する、請求項5に記載のアッセイ。
- 細胞内のSTIM2活性を調節する作用物質のアッセイであって、カルシウム貯蔵枯渇の非存在下での2−APBの適用に反応したIcrac活性を測定するステップを含み、前記細胞はSTIM2及びCRACM2で形質移入されており、前記Icrac活性を調節する作用物質が、STIM2活性を調節する作用物質として同定されるアッセイ。
- 前記細胞がリンパ球である、請求項1又は2に記載のアッセイ。
- 前記リンパ球が、B細胞又はT細胞である、請求項8に記載のアッセイ。
- 免疫系の細胞に影響を与える抗生物質のスクリーニング方法であって、
抗生物質を投与した後に免疫系の細胞のIcrac活性を測定する工程を含み、Icrac活性の抑制が、その抗生物質が免疫系の細胞に影響を与えることを示す方法。 - 前記抗生物質が、アミノグリコシドである、請求項10に記載のスクリーニング方法。
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