JP2002071695A - エイズ関連脳疾患の診断剤、診断方法および診断用キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＨＩＶ脳症やその日和見感染であるサイトメ
ガロウイルス脳炎による脳の神経細胞破壊等のエイズ関
連脳疾患の診断およびその進行の程度を、早期に的確に
診断することのできる診断剤および診断方法を提供する
こと。 【解決手段】 １４−３−３蛋白質のアイソマーγおよ
びアイソマーεを検出する試薬を有効成分として含有す
るエイズ関連脳疾患の診断剤、体液中の上記アイソマ−
を検出するエイズ関連脳疾患の診断方法およびこの診断
方法に利用する診断用キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、従来診断が困難で
あったエイズ関連脳疾患の診断剤および診断方法に関
し、更に詳細には、エイズ脳症やサイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）脳炎による神経細胞障害等のエイズ関連脳疾
患を早期に的確に診断することができ、その程度の判定
や予後の判定或いは治療効果の判定などに有効なエイズ
関連脳疾患の診断剤および診断方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＨＩＶは、リンパ球以外に直接神経組織
を標的にするため、感染初期から様々な神経症状を発症
することが知られているが、高度な神経障害は殆どの場
合、感染宿主の免疫系の荒廃に伴って生ずる日和見感染
や悪性腫瘍の併発によって認められる。このような神経
障害の原因となる基質疾患を的確に把握して治療を行う
必要があり、ＣＴやＭＲＩによる画像診断以外に非侵襲
的で治療効果や予後の判定に有用な検査方法の確立が待
たれている。しかしながら現在、エイズ脳症等のエイズ
関連脳疾患に伴う神経細胞の急速な破壊を、早期に的確
に診断する特異性の高い生化学的方法は確立されていな
い。

【０００３】ところで、脳に豊富な酸性蛋白質として１
４−３−３蛋白質が最初に記述されたのは１９６７年で
ある（この命名は古典的な蛋白分離法での分画番号によ
る）。この蛋白質は、神経細胞に局在し、軸策輸送によ
って神経終末に輸送されることが知られていたが、長く
その構造や生理活性は不明であった。しかしその後、Ｃ
ａ²⁺／カルモジュリン依存性蛋白質キナ−ゼIIの活性に
依存してモノアミン生合性を調節する因子であることが
明らかとなった（Ichimura et al., FEBS Lett. 219, 7
9-82, 1987）。

【０００４】この１４−３−３蛋白質はファミリ−とし
て存在し、その生理活性は種々で、例えばミトコンドリ
アへのチトクロムＣをはじめとしたミトコンドリア蛋白
質前駆体の輸送蛋白とされており、また、Ｂａｄ蛋白質
と結合することによる細胞死（アポト−シス）の抑制物
質として注目されている。更に、本発明者は、１４−３
−３蛋白質がその酵素活性として分子シャペロン蛋白質
に共通するシャペロン型ヌクレオシド・ジホスフェート
・キナーゼ（nucleoside diphosphate kinase）活性を
有すことを見出している。

【０００５】ヒトやラットなどの動物組織では、１４−
３−３蛋白質は現在までに７種類のアイソザイムとその
リン酸化アイソマ−（α〜σ）の構造は決定されている
（蛋白質 核酸 酵素 41, (4), 313-326, １９９
６）。

【０００６】本発明者は、既にクロイッツフェルト・ヤ
コブ（Creutzfeldt-jakob）病（以下、「ＣＪＤ」とい
う）患者の脳脊髄液に著名に増加する蛋白質として知ら
れている（Hish, G etal N. Engl. J. Med., 335, 924-
930, 1996）１４−３−３蛋白質が、エイズ脳症患者の
脳脊髄液中に増加することを見出し報告している（厚生
科学研究費補助金エイズ対策研究事業＜ＨＩＶ感染症に
関する臨床研究＞平成９年、１０年研究報告書）。しか
し、知られている１４−３−３蛋白アイソマ−のうち、
皮膚のみに存在するσ蛋白質以外のβ、γ、ε、ζ、
η、τは、脳に存在することが推定されるが、実際にど
のアイソマーが存在するかや、エイズ脳症患者の脳脊髄
液中に特異的に出現するのはどのアイソマ−であるか等
については全く知られていない。また、報告されている
１４−３−３蛋白アイソマ−を識別しようとしても、各
々のアイソマ−の類似性が高いために、従来知られてい
る抗体は、各アイソマ−に対する特異性が低く、使用に
耐えるものではなかった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、ＨＩ
Ｖ脳症やその日和見感染であるＣＭＶ脳炎による脳の神
経細胞破壊等のエイズ関連脳疾患の診断およびその進行
の程度を、早期に的確に診断することのできる診断剤お
よび診断方法を提供することをその課題とするものであ
る。

【０００８】

【発明を解決すための手段】本発明者は、前記のエイズ
脳症患者の脳脊髄液中に１４−３−３蛋白質が増加する
との知見を元に、エイズ脳症患者およびその日和見感染
による脳の神経細胞破壊の程度を診断できる方法につい
て研究を開始した。すなわち、他の疾患や病態により脳
脊髄液中に１４−３−３蛋白が増加することもあるの
で、この知見だけではエイズ脳症であるとの診断をする
ことができず、更に、エイズ脳症に特有の現象を見出す
ための研究を行う必要があった。

【０００９】このような状況において、本発明者らは、
エイズ脳症患者等のエイズ関連脳疾患患者の産生する１
４−３−３蛋白質中のアイソマ−について、各アイソマ
ーを識別可能な抗体を入手して検討を行った結果、エイ
ズ関連脳疾患患者においては、特定のアイソマーのみが
増加していること、およびこのアイソマーを指標とすれ
ばエイズ関連脳疾患を非侵襲的に診断できることを見出
し、本発明を完成した。

【００１０】すなわち本発明の目的は、１４−３−３蛋
白質のアイソマーγおよびアイソマーε並びに必要によ
りアイソマーζを検出する試薬を有効成分として含有す
るエイズ関連脳疾患の診断剤を提供することである。

【００１１】また本発明の他の目的は、体液中の１４−
３−３蛋白質のアイソマ−γおよびアイソマーε並びに
必要によりアイソマーζを検出するエイズ関連脳疾患の
診断方法を提供するものである。

【００１２】更に本発明の別の目的は、上記診断方法に
有利に使用されるエイズ関連脳疾患の診断用キットを提
供するものである。

【００１３】

【発明の実施の形態】本明細書中においてエイズ関連脳
疾患とは、エイズ脳症や、ＣＭＶ脳炎等の日和見感染症
による脳の神経細胞破壊をいう。

【００１４】本発明においては、検体中に含まれる１４
−３−３蛋白質のアイソマ−γおよびアイソマーε、更
に必要によりアイソマーζを検出し、これらアイソマー
の存在およびその量からエイズ関連脳疾患の診断および
これに伴う脳の神経細胞破壊の程度を判断する。当該ア
イソマーの検出には、生体成分中に含まれる蛋白質を測
定するために当業界で用いられる方法を広く利用するこ
とができ、例えば寒天ゲル免疫拡散法、凝集反応法、凝
集阻止反応、対抗免疫電気泳動法、免疫蛍光顕微鏡法、
免疫電子顕微鏡法、放射性免疫測定法及び酵素免疫測定
法などが例示される。

【００１５】このような方法のうち、好適なものとして
は、１４−３−３蛋白質のアイソマーγ、アイソマーε
またはアイソマーζに、これと特異的に反応する抗体に
結合させ、形成された抗原抗体複合体を検出する免疫測
定が挙げられる。このような各アイソマーと特異的に反
応する抗体の例としては、アイソマ−γ、アイソマーε
およびアイソマ−ζに対するモノクローナル抗体および
ポリクローナル抗体が挙げられる。

【００１６】上記のような各アイソマーに対するモノク
ロ−ナル抗体は、例えば、常法に従ってそれぞれのアイ
ソマーで動物を免疫した後、Ｂリンパ球を取り出し、こ
れとミエロ−マ細胞とを細胞融合してハイブリド−マを
得、これを培養することにより得られる。また、ポリク
ローナル抗体は、各アイソマーをエピト−プペプチドと
してウシサイログロブリンに結合した後、これをウサギ
に免疫することにより得られる。

【００１７】モノクローナル抗体やポリクローナル抗体
を得るために利用されるアイソマーとしては、例えば、
クロ−ニングによって、１４−３−３蛋白質のアイソマ
ーγ、アイソマーεおよびアイソマーζをコードする遺
伝子を採取し、これをヘキサヒスチジン・タグ（hexahi
stidine tag）で、或いはグルタチオン−Ｓ−トランス
フェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」という）融合蛋白質とし
て大腸菌に発現させ、各々を精製することにより得られ
る、各アイソマ−に対するリコンビナント蛋白が利用さ
れる。

【００１８】本発明方法において、好ましく使用される
１４−３−３蛋白質のアイソマーγおよびアイソマーε
に対する特異抗体は、次のエピト−プ抗原ペプチドを用
いて得られたものである。 アイソマ−γ QQDDDGGEGNN アイソマ−ε EQNKEALQDVENQ また、好ましいアイソマ−ζの特異抗体としては、市販
の製品（Santa Cruz SC-1019）を挙げることができる。

【００１９】一方、本発明方法の実施において使用され
る検体としては、測定対象となる患者の脳脊髄液、血清
などの血液、リンパ液など１４−３−３蛋白質を含む生
体成分であれば特に制約なく利用されるが、脳脊髄液を
用いることが好ましい。

【００２０】酵素免疫測定法による本発明の実施は、例
えば、目的とする１４−３−３蛋白質のアイソマーの存
在が疑われる検体に所定量の特異抗体を反応させ、つい
でこの特異抗体に結合する標識した二次抗体を加え、イ
ンキュベ−ション後、抗原抗体結合物と未反応の抗原及
び抗体を分離して標識した抗体を検出する試薬を用いる
ことで検体中の１４−３−３蛋白質のモノマーの存在お
よびその量を検出することにより行われる。

【００２１】より具体的に本発明の実施方法を、検体と
して脳脊髄液を用いる場合を例に取り説明すれば次の通
りである。すなわち、先ず、エイズ患者から血液の混入
のないように注意しながら脳脊髄液採取する。採取した
脳脊髄液の所定量を、例えば１５０００ｘｇ程度で遠心
し、上澄み液を採取する。この上澄み液を、例えば、ラ
エムリ（Laemmli）の方法で電気泳動し、更に、ＰＶＤ
Ｆ膜にエレクトロブロッティング（ electro blotting
）する。次に一次抗体として、ヒト１４−３−３蛋白
質のアイソマ−γ、アイソマーεおよびアイソマーζに
対する特異抗体（ウサギ抗ヒト１４−３−３ β、γお
よびζ）を用い、上記ＰＶＤＦ膜を４℃で一晩処理す
る。最後に、このＰＶＤＦ膜をペルオキシダ−ゼ（ＰＯ
Ｄ）標識抗ウサギＩｇＧ二次抗体と室温で反応させ、Ｅ
ＣＬ化学発光検出システム（AmershamPharmacia Biotec
h）を用い、アイソマ−γ、アイソマーεおよびアイソ
マーζの存在をを検出する。

【００２２】また、本発明方法によりヒト１４−３−３
蛋白質のアイソマ−γ、アイソマーεおよびアイソマー
ζを定量するには、脳脊髄液中の１４−３−３アイソマ
−蛋白質をウェスタンブロット法で検出と同時に、上記
した各リコンビナント１４−３−３アイソマ−蛋白質
（０.５〜８.６ng）を同様にウェスタンブロットした
後、ＰＯＤの産物をイメージマスター等で測定すれば良
い。

【００２３】なお本発明において、あらかじめ特異抗体
をプレ−トなどに固相化しておき、検体中の１４−３−
３蛋白質のアイソマーを反応させた後、更に標識した１
４−３−３蛋白質のアイソマーに対する抗体を反応させ
て測定するすることもできる。これらの測定方法におけ
る手段又は選択は何れも当業者の良く知るところであ
り、本発明においては各手法の何れも採用することがで
きる（「臨床検査法提要」金原出版、1995年など）かか
る免疫測定法の設計は、本発明の分野で通常行われてい
る変更を伴うことができる。

【００２４】更に、各測定系における標識剤としても、
特に制限はされず、従来公知のもの又は将来使用されう
る何れをも用いることが、具体的には^３Ｈ、^１４Ｃ等の
放射性元素、アルカリホスファタ−ゼ、パ−オキシダ−
ゼ等の酵素、フルオレセインイソチオシアネ−ト、テト
ラメチルロ−ダミンイソチオシアネ−ト等の蛍光物質が
例示される。これらを標識剤として使用する免疫測定法
はそれぞれラジオイムノアッサイ、エンザイムイムノア
ッサイ、フルオロイムノアッサイと称されるが、何れを
も用いることができる。

【００２５】以上の方法により、検体中の１４−３−３
蛋白質のアイソマーγとアイソマーεがほぼ同量で検出
された場合、当該検体の患者はエイズ関連脳疾患患者で
あると判断され（陽性）、また、その量が多い程重篤度
が高いと判断される。更に、エイズ関連脳疾患患者にお
いては、検体中の１４−３−３蛋白質のアイソマーζが
アイソマ−γおよびアイソマーεと比べ低い量（十分の
一程度）で検出されるが、この値は AIDS Dementia Com
plex（以下、ＡＤＣという）ステ−ジと最も良く相関
し、診断において有用である。

【００２６】本発明方法の実施のために用いられる診断
剤としては、１４−３−３蛋白質のアイソマーγ、アイ
ソマーεおよび必要によりアイソマーζを検出する試薬
を有効成分として含有する薬剤が挙げられる。

【００２７】これらの薬剤は、例えば１４−３−３蛋白
質のアイソマーγ、アイソマーεまたはアイソマーζ各
々に対して特異的な抗体を含有するものであり、必要に
より適宜薬学的に許容される担体を組み合わせたもので
ある。

【００２８】また、本発明方法を容易に実施するため
に、エイズ関連脳疾患の診断用キットを利用することも
できる。この診断用キットは、例えば次の組合せよりな
るものである。

【００２９】次の試薬（ａ）および（ｂ）の組合せ （ａ）１４−３−３蛋白質のアイソマーγ、アイソマー
ε（および必要によりアイソマーζ）を認識する抗体を
含む試薬 （ｂ）上記（ａ）に含まれる抗体を認識する標識抗体を
含む試薬

【００３０】次の試薬（ｃ）および（ｄ）の組合せ （ｃ）固定化された、１４−３−３蛋白質のアイソマー
γ、アイソマーε（および必要によりアイソマーζ）を
認識する抗体を含む試薬 （ｄ）標識された、１４−３−３蛋白質のアイソマー
γ、アイソマーε（および必要によりアイソマーζ）を
含む試薬

【００３１】

【作用】本発明は、１４−３−３蛋白質のアイソマーを
定量することによりエイズ脳症等のエイズ関連脳疾患お
よびこれによる神経細胞の破壊の程度を非侵襲的に診断
できるようにしたものである。すなわち、１４−３−３
蛋白質のうち、脳に存在することが推定される β、
γ、ε、ζ、η、τ各々のアイソマ−蛋白質に特異的に
反応する抗体を作成し、エイズの進行度の判断に用いら
れるＣＤ４値との関係、更に脳細胞の破壊に伴って発現
するＡＤＣとの関連、及びＨＩＶの進行に伴って発生す
る種々の日和見感染による脳症との関連を調べ、１４−
３−３蛋白質のアイソマーのうち、γ、ε及びζが中枢
神経症状を伴うエイズ患者の脳脊髄液中に特異的に出現
することを見出したものである。従って、これらアイソ
マーの存在とその濃度を測定することでエイズ関連脳疾
患とこれに伴う神経細胞の破壊の程度が診断され、神経
細胞の破壊を伴う他の疾患、例えばＣＪＤやヘルペス脳
炎との鑑別診断を可能としたものである。

【００３２】

【実施例】以下、実施例をあげて本発明を更に詳細に説
明する。

【００３３】実 施 例 １ １４−３−３蛋白質のアイソマ−に対する抗体の調製：
先ず、エイズ脳症患者の脊髄液中の１４−３−３アイソ
マ−蛋白質のうち、β、γ、ε、ζ、η、τ各々のアイ
ソマ−蛋白質に対する抗体を入手し、これを用いて免疫
測定法を確立した。

【００３４】すなわち、クロ−ニングによって得られた
１４−３−３蛋白質のβ、γ、ε、ζ、η、τアイソマ
−蛋白の遺伝子をヘキサヒスチジン・タグで、或いはＧ
ＳＴ融合蛋白質として大腸菌に発現させ、各々を精製し
て抗原を得た。これらの各アイソマ−に対するリコンビ
ナント蛋白を抗原として、ウサギに投与し、ポリクロ−
ナル抗体の作成を行った。特にβ、γ、ε、ηの各特異
的な抗体の作成は、次のような各々のエピト−プ抗原ペ
プチドを用いることにより成功した。

【００３５】 アイソマ−β MTMDKSELVQ アイソマ−γ QQDDDGGEGNN アイソマ−ε EQNKEALQDVENQ アイソマ−η MGDREQLLQR アイソマ−τの特異抗体は、リコンビナント蛋白質に対
するモノクロ−ナル抗体を作成し、特異的アイソマ−の
測定を可能にした。これらの各ポリ・モノクローナル抗
体の特異性を図１に示す。また、アイソマ−ζの特異抗
体としては市販品（SantaCruz SC-1019）を用いた。

【００３６】実 施 例 ２ 免疫測定試験： （１）対象 国立国際医療センタ−で取り扱ったＨＩＶ患者２３例か
ら採取した血液と脳脊髄液各２３検体を対象とした。Ｈ
ＩＶ患者は２３例でそのうち、エイズ脳症と診断された
者は４例、ＨＩＶ日和見感染としてＣＭＶ脳炎と診断さ
れた者が６例、その他ウイルス性髄膜炎を診断された者
が３例、クリプトコッカス髄膜炎と診断された者６例、
及び中枢神経症状を伴わないＨＩＶ感染者４例からな
る。

【００３７】（２）１４−３−３蛋白質アイソマーの検
出法 血液の混入のない脳脊髄液脳脊髄液２０μｌを１５００
０×ｇで１０分間遠心した上澄みをラエムリ（Laemml
i）の方法で電気泳動した後に、ＰＶＤＦ膜にエレクト
ロ・ブロッティングした。次にこのＰＶＤＦ膜を、実施
例１のヒト１４−３−３蛋白質アイソマ−に対する特異
抗体（ウサギ抗ヒト１４−３−３ β、γ、ε、ζ、
η）と、各アイソマ−に共通して反応するウサギ抗ヒト
１４−３−３ユニバ−サル抗体（ Sannta Cruz SC-629
）を一次抗体として４℃で一晩処理した後、ペルオキ
シダ−ゼ（ＰＯＤ）標識抗ウサギＩｇＧ二次抗体と室温
で反応させ、ＥＣＬ化学発光検出システム（ Amersham
Pharmacia Biotech ）を用いて検出した。なお、ウェス
タンブロット法での脳脊髄液中の１４−３−３アイソマ
−蛋白質の定量には、検出と同時に各リコンビナント１
４−３−３アイソマ−蛋白質(０.５〜８.５ｎｇ)を同様
にウェスタンブロットした後、ＰＯＤの産物をイメージ
・マスターで測定して定量した。

【００３８】

【表１】

【００３９】（３）結果 表１に今回対象としたＨＩＶ感染者を、中枢神経症状を
伴う群と伴わない群の２群に分け、中枢神経症状を伴う
群では更に、エイズ脳症（ＨＩＶ脳炎）と診断された群
と、日和見感染としてＣＭＶ脳炎、クリプトコッカス髄
膜炎及びその他のウイルス性髄膜炎（ＰＭＬ、ＶＺＶ
Ｅ）を伴うと診断された５群に分け、合計６群に分類し
たときの脳脊髄液中の１４−３−３蛋白質の各アイソマ
−の定量値と、ＨＩＶ−ＲＮＡ値、ＡＤＣステ−ジ及び
患者末梢血中のＣＤ４値を示した。脳脊髄液中の１４−
３−３アイソマ−パタ−ンの解析は、すべてのアイソマ
−を検出することのできるユニバ−サル抗体による検定
が陽性となった検体のみを更に各々の特異抗体で検定し
ている。したがって、ユニバ−サル抗体での検出が陰性
の検体では、何れのアイソマ−の出現も認められていな
い。

【００４０】表１から明らかなように、ＨＩＶ患者の脳
脊髄液中には、γとεタイプの１４−３−３蛋白質が多
量に出現し、更に微量ではあるがζタイプの１４−３−
３蛋白質も出現する。尚、調べた限りにおいて正常人あ
るいは各種髄膜炎患者とＨＩＶ感染者でも中枢神経症状
のない患者では、１４−３−３蛋白質は殆ど検出されな
かった。

【００４１】また、これらのデ−タを基に、ＡＤＣステ
−ジと脳脊髄液中に認められた１４−３−３蛋白質γ、
ε、ζアイソマ−との相関関係を検討すると、図２に示
すようにγ、ε、ζアイソマ−は何れもＡＤＣステ−ジ
が上昇するにつれて、脳脊髄液中の値が増加しており、
相関関係の指標となるＰ値は、各々γタイプで０.００
１０、εタイプで０.００１９、ζタイプで０.０００１
以下を示し、明らかに相関関係が認められた。脳脊髄液
ではγとεタイプ出現量が最も多く、高感度に検出でき
る患者アイソマ−であることと、ζタイプのアイソマ−
はγやεに比較して十分の一程度しか出現しないが、一
方でＡＤＣステ−ジと最も良く相関することが明らかに
なった。

【００４２】更に、末梢血中のＣＤ４値は、ＨＩＶの進
行度とともに減少するが、図３から明らかなように１４
−３−３蛋白質のγ、ε、ζアイソマ−は、各々ＣＤ４
値が２０cells／μｌ以下のときに高頻度に出現する
が、ＣＤ４値が２０cells／μｌ以上の値では、脳脊髄
液中の１４−３−３蛋白質の上昇は全く認められていな
い。また、脳脊髄液中の１４−３−３蛋白質とＣＤ４値
との相関関係が認められなかった。

【００４３】ヒトの脳内の１４−３−３蛋白質は、特に
神経細胞に多量に発現しているので、以上の事実は、Ｈ
ＩＶ脳症及びＣＭＶ脳炎により脳の神経細胞が障害され
た時に、脳脊髄液中に放出される１４−３−３蛋白質量
が増加したためか、或いは神経細胞の障害時にアポト−
シス制御因子として反応性に発現が増加し、放出が生じ
たためと推定される。いずれにしても、ＣＤ４値が高度
に減少して、免疫不全が進行するとともに、脳脊髄液中
の１４−３−３蛋白質が出現し、その量は中枢神経症状
の強さに相関していることが明らかとなった。

【００４４】一方表１に示す通り、脳脊髄液中のＨＩＶ
−ＲＮＡ値と１４−３−３蛋白質の間には、明らかな相
関関係が認められなかった。又、ＨＩＶ−ＲＮＡ値と中
枢神経症状の程度を示すＡＤＣステ−ジとの間、及びＨ
ＩＶ−ＲＮＡ値と末梢血ＣＤ４値との間にも明らかな相
関関係は認められなかった。以上のことより、脳脊髄液
中のＨＩＶ−ＲＮＡ量は、神経細胞の破壊の程度を必ず
しも反映していないことが示唆された。

【００４５】なお、４例のＣＪＤ患者の脳脊髄液では、
１４−３−３蛋白質のγタイプのアイソマ−が優位に出
現しており、ごく僅かにεタイプの１４−３−３蛋白質
が認められる。更に、ウイルトファング（Wiltfang）等
の報告によるとＣＪＤ患者ではβ、γ、ε、ηアイソマ
−が多量に、ヘルペス脳炎ではηアイソマ−が脳脊髄液
中に検出されると報告している（J.Neurochem 71、2485
-2490、1999）。このことから、ＨＩＶ患者とＣＪＤ患
者及びヘルペス脳炎患者との脳脊髄液中に出現する１４
−３−３アイソマ−蛋白質のパタ−ンに違いがあり、脳
脊髄液中の１４−３−３アイソマ−パタ−ンによりこれ
ら疾患の鑑別診断が可能となる。

【００４６】

【発明の効果】従来、エイズ脳症等エイズ関連脳疾患の
診断には、ＭＲＩ、ＣＴ等の画像診断、脳生検或いはイ
ンタ−フェロン−α、ネオプテリン、キノリン酸、β2
−ミクログロブリン、ＴＮＦ−α等が生化学的測定法と
して用いられてきたが、これ等の検査はいずれも特異性
が低く、しかも神経細胞破壊の程度を直接示す方法では
なかった。

【００４７】これに対し、本発明によれば、エイズ関連
脳疾患とこれに伴う神経細胞の破壊の程度が高い精度で
診断され、神経細胞の破壊を伴う他の疾患、例えばＣＪ
Ｄやヘルペス脳炎との鑑別診断を可能とするものであ
り、エイズ患者の処置、治療等において有用なものであ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 各１４−３−３蛋白質アイソマ−を認識する
特異抗体。６種の１４−３−３蛋白質アイソマ−（抗原
１０ｎｇ）に対して本発明者が作成した特異抗体（Ａ）
と市販されているサンタ・クルツ（ Santa Cruz ）の特
異抗体（Ｂ）の特異性を示す。市販の抗体に比べて、発
明者が作成したβ、γ、ε、η、τ抗体では著しく特異
性の増した抗体が得られている。

【図２】 ＨＩＶ患者の脳脊髄液中の１４−３−３蛋白
質アイソマ−とＡＤＣステ−ジとの相関関係の重回帰分
析の結果を示す図面。

【図３】 ＨＩＶ患者の脳脊髄液中の１４−３−３蛋白
質アイソマ−と末梢血ＣＤ４値との相関関係の重回帰分
析の結果を示す図面。 以 上

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 前田 雅弘 群馬県佐波郡玉村町2104番地８ (72)発明者 若林 英樹 徳島県徳島市南佐古八番町２番地９の303

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 １４−３−３蛋白質のアイソマーγおよ
   びアイソマーεを検出する試薬を有効成分として含有す
   るエイズ関連脳疾患の診断剤。
2. 【請求項２】 更に１４−３−３蛋白質のアイソマーζ
   を検出する試薬を有効成分として含有する請求項第１項
   記載のエイズ関連脳疾患の診断剤。
3. 【請求項３】 １４−３−３蛋白質のアイソマーγ、ア
   イソマーεまたはアイソマーζを検出する試薬が、１４
   −３−３蛋白質のアイソマ−γ、ε又はζを特異的に認
   識する抗体である請求項第１項または第２項に記載のエ
   イズ関連脳疾患の診断剤。
4. 【請求項４】 検体として脳脊髄液を用いるものである
   請求項第１項ないし第３項の何れかの項記載のエイズ関
   連脳疾患の診断剤。
5. 【請求項５】 エイズ関連脳疾患がエイズ脳症またはエ
   イズ患者における日和見感染症による脳の神経細胞破壊
   である請求項第１項記載のエイズ関連脳疾患の診断剤。
6. 【請求項６】 体液中の１４−３−３蛋白質のアイソマ
   −γおよびεを検出することを特徴とするエイズ関連脳
   疾患の診断方法。
7. 【請求項７】 更に１４−３−３蛋白質のアイソマーζ
   を検出する請求項第６項記載のエイズ関連脳疾患の診断
   方法。
8. 【請求項８】 １４−３−３蛋白質のアイソマ−γ、ε
   およびζを認識する抗体を使用する請求第６項または第
   ７項記載のエイズ関連脳疾患の診断方法。
9. 【請求項９】 体液が脳脊髄液であるクレ−ム第６項な
   いし第８項の何れかの項に記載のエイズ関連脳疾患の診
   断方法
10. 【請求項１０】 １４−３−３蛋白質のアイソマ−γと
    εをほぼ同量検出することにより陽性と診断する請求項
    第６項、第８項または第９項記載のエイズ関連脳疾患の
    診断方法。
11. 【請求項１１】 １４−３−３蛋白質のアイソマ−γと
    εが同程度検出され且つζがそれらに比べて低いことに
    より陽性と診断する請求項第６項ないし第９項の何れか
    の項に記載のエイズ関連脳疾患の診断方法。
12. 【請求項１２】 脳脊髄液中の１４−３−３蛋白質のア
    イソマ−γ、εおよびζを検出し、その量からエイズ関
    連脳疾患の重篤度を判断する請求項第５項ないし第１０
    項の何れかの項記載のエイズ関連脳疾患の診断方法。
13. 【請求項１３】 エイズ関連脳疾患がエイズ脳症または
    エイズ患者における日和見感染症による脳の神経細胞破
    壊である請求項第６項または第７項記載のエイズ関連脳
    疾患の診断方法。
14. 【請求項１４】 次の試薬（ａ）および（ｂ）、 （ａ）１４−３−３蛋白質のアイソマーγ、アイソマー
    ε（および必要によりアイソマーζ）を認識する抗体を
    含む試薬 （ｂ）上記（ａ）に含まれる抗体を認識する標識抗体を
    含む試薬を含有するエイズ関連脳疾患の診断用キット。
15. 【請求項１５】 次の試薬（ｃ）および（ｄ）、 （ｃ）固定化された、１４−３−３蛋白質のアイソマー
    γ、アイソマーε（および必要によりアイソマーζ）を
    認識する抗体を含む試薬 （ｄ）標識された、１４−３−３蛋白質のアイソマー
    γ、アイソマーε（および必要によりアイソマーζ）を
    含む試薬 を含有するエイズ関連脳疾患の診断用キット。