CN108445232B - Nf-l在神经梅毒脑脊液检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及NF‑L在神经梅毒脑脊液检测中的应用。具体地说,本发明提供了一种神经梅毒检测试剂盒,所述试剂盒包括用于检测脑脊液NF‑L水平的检测试剂。本发明还提供了用于检测脑脊液NF‑L的第一检测试剂在制备神经梅毒检测试剂盒中的应用。本发明可以用于神经梅毒的早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估,具有高可靠性、高灵敏度等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域,特别涉及NF-L在神经梅毒脑脊液检测中的应用。
背景技术
中间纤维(intermediate filaments,IFs)是组成神经细胞轴索复合网络系统的3种骨架蛋白之一,中间纤维对细胞核有固定作用、给细胞提供机械强度、参与细胞连接、对细胞内物质运输起作用、参与细胞分裂活动、参与信息传递活动等。中间纤维是一种空心纤维结构,直径为10nm,主要分为神经丝蛋白等六类。神经丝蛋白(Neurofilament,NF)只表达于神经细胞,包括神经丝蛋白轻链(Neurofilament-Light,NF-L)、神经丝蛋白中链(Neurofilament-Medium,NF-M)、神经丝蛋白重链(Neurofilament-Heavy,NF-H)三种亚结构;其结构与其他中间纤维类似,包括头部氨基区、α螺旋的杆状区以及尾部羧基区。神经丝蛋白的作用是稳定轴索的形态,保持其直径及维持其稳定的传导速度,并在神经元分化,轴突生长和再生过程等过程中发挥作用。
NF-L是神经丝蛋白中最先被表达的亚结构,分子量为68kDa。NF-H也是组成神经丝蛋白的主要成分之一,分子量为205kDa,是最后表达的神经丝蛋白,与扩增轴索直径以及提高轴索传导速度直接相关。据报道,NF-L与NF-H的表达水平是相互独立的,这可能与它们的基因组定位不同有关。
NF-H的羧基端有51个磷酸化的位点,从近端到远端,磷酸化程度不同。在神经元胞体或者树突中,NF-H基本无磷酸化存在,而在神经元轴索中,则多以磷酸化的形式即磷酸化神经微丝蛋白重链(phosphorylated Neurofilament-Heavy,pNF-H)存在,NF-H对于稳定轴索形态以及神经信号的传导起到重要作用。
梅毒是由梅毒螺旋体侵入人体后引起的一种全身性、感染性疾病。梅毒螺旋体是一种小而纤细的螺旋状微生物,横断分裂的方式进行繁殖,其结构中有维持螺旋体弹性的轴纤维,可以屈曲及伸缩,有利于梅毒螺旋体穿入宿主组织。梅毒螺旋体在人体外不易生存,煮沸立即死亡,干燥肥皂水以及酒精等一般的消毒剂可以很容易将其杀死,因此目前不能体外培养,梅毒螺旋体在低温(-78℃)下可保存数年,仍能保持其形态活力及毒性。梅毒螺旋体在不能体外培养可以在一定程度上限制了梅毒螺旋体的传播和侵入,但是也使得对梅毒螺旋体的研究以及对梅毒疾病的研究造成了极大的困难和不变,因此目前梅毒的诊断、治疗以及预后研究进展不大。
神经梅毒是梅毒螺旋体侵犯中枢神经系统而引起的慢性感染性疾病,可以造成难以恢复的神经系统损害,是梅毒致残的主要原因,因此神经梅毒已经成为严重威胁人类健康的疾病。
神经梅毒可以发生于梅毒的各个阶段。神经梅毒可分为无症状神经梅毒(Asymptomatic Neurosyphilis)、脑脊膜梅毒(Meningeal Syphilis,包括梅毒性脑膜炎和梅毒性硬脊膜炎)、脑膜血管梅毒(Meningovascular Syphilis)、实质性神经梅毒(麻痹性痴呆(general Paresis)和脊髓痨(Tabes Dorsalis))及树胶肿性神经梅毒(参见图1)。
无症状神经梅毒是指梅毒的血浆学检查阳性,脑脊液存在异常,但是无神经系统的症状和体征,通常发生在感染后的12至18个月,是神经梅毒的最初阶段,无症状神经梅毒患者比脑脊液正常的梅毒患者更容易进展为有症状神经梅毒,因此应对可疑患者进行脑脊液检查,以期早发现早治疗,避免无症状神经梅毒进展为有症状神经梅毒。
脑脊膜梅毒包括梅毒性脑膜炎和梅毒性硬脊膜炎,主要发生于梅毒感染后的12个月内,可发生于1.4%至6%的梅毒患者中,主要原因是早期梅毒阶段未能得到充分治疗。
脑膜血管梅毒包括脑血管梅毒和脊髓脑膜血管梅毒,一般感染梅毒后的5到12年发生,在抗生素未发明之前,3.2%到15%的梅毒患者会进展为脑膜血管梅毒。
实质性神经梅毒是较晚期的神经梅毒,包括麻痹型痴呆和脊髓痨。麻痹型痴呆的平均潜伏期为15-20年,据报道,5%的梅毒患者会进展为麻痹型痴呆,而未经治疗的麻痹型痴呆患者会在5年内死亡。
树胶肿性神经梅毒,在神经梅毒中比较罕见,包括脑树胶肿以及脊髓树胶肿,树胶肿发病部位的不同导致临床表现也不同,脑树胶肿主要表现为脑肿瘤类似症状,例如进行性神经系统症状、癫痫、颅内压增高等,MRI可出现与脑膜瘤类似的线性强化。而脊髓树胶肿累及颈椎部时可导致四肢麻痹,累及胸椎时则可导致下肢轻瘫等等。
神经梅毒的临床表现亦是复杂多变,症状无特异性,几乎包括神经病学中的所有各种症状与体征,可出现神经科、眼科、皮肤科、精神科等科相似的临床表现,因此对神经梅毒的误诊率高,误诊率达55.6%,比如神经梅毒引起的青壮年不明原因脑梗死,青壮年出现癫痫、智能障碍等可能被误诊,因此,神经梅毒的正确诊断和及时治疗是非常重要的。
目前并没有诊断神经梅毒的金标准,实验室检测有助于神经梅毒的诊断;但是并没有单个检测方法可用于所有情况下神经梅毒的诊断。神经梅毒的诊断依赖于血浆学试验、脑脊液(CSF)检查、神经症状和体征的综合分析。对于出现神经梅毒临床症状的患者需要进一步测试。
血浆学试验主要包括两类试验,即非梅毒螺旋体抗原血浆试验和梅毒螺旋体抗原血浆试验。非梅毒螺旋体抗原血浆试验是以心磷脂作为抗原,检测血浆中的对心磷脂有反应的抗体,其中目前应用最广泛的是快速血浆反应素环状卡片试验(RPR,Rapid PlasmaReagin),该方法操作简便、迅速,试验结果清晰易读,简便快速,稳定性好。其原理是利用心磷脂、卵磷脂及胆固醇组成混合物作为抗原,用特制的活性炭颗粒进行吸附,通过肉眼观察白色纸板上有无黑色凝集颗粒出现而直接进行结果判断。梅毒螺旋体抗原血浆试验是针对作为抗原的梅毒螺旋体特异成分,因此被用于筛查和确诊梅毒感染。梅毒螺旋体明胶凝集实验(TPPA)把致病性TP的精致菌株成分包被在人工载体明胶粒子上,检测血浆中梅毒相应的抗体,由于试剂制备过程排除了各种非特异性反应,敏感性和特异性均较高,是目前主要的梅毒螺旋体抗原血浆试验。
脑脊液检查主要包括CSF-RPR、CSF白细胞计数或蛋白水平。CSF-RPR与血浆RPR原理相同,特异性与脑脊液性病研究实验室(VDRL,Venereal Disease ResearchLaboratory)试验(CSF-VDRL)相似,但是敏感性比CSF-VDRL高,是目前常用的脑脊液梅毒螺旋体非特异性抗体试验,一般CSF-RPR阳性,即可诊断神经梅毒。神经梅毒的重要参考指标还包括脑脊液细胞计数或蛋白水平,在CSF-RPR为阴性结果时,如果出现神经梅毒临床征象、血浆学检测阳性以及脑脊液细胞计数(一般CSF白细胞计数>5/μl为异常,对于合并HIV感染的患者,脑脊液细胞计数会偏高,为提高诊断准确性,这类患者脑脊液细胞计数异常的标准应提高为白细胞>20/μl)和/或蛋白水平异常,可以考虑诊断为神经梅毒。
多项临床研究证实,神经梅毒患者脑脊液中蛋白质含量升高程度与病情严重程度呈正相关,与远期预后呈负相关;神经梅毒患者脑脊液中寡克隆区带(OCB)阳性,脑脊液tau蛋白含量升高,或CXCL13升高等均提示中枢神经系统内发生了免疫应答。但是目前并没有可信的反映神经梅毒神经损伤程度的生物学标志物。因此,寻找评估神经梅毒患者神经受损程度以及预后的指标显得尤为重要。
据报道,能够反映中枢神经系统损伤的标记物很多,如β淀粉样前体蛋白及β淀粉样蛋白、髓鞘碱性蛋白、神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白tau等,在神经梅毒也有一些变化,但都存在特异性都不强等诸如此类的问题。神经丝蛋白被推测可能与多种神经系统疾病有关,但是其细胞分子学机制尚不清楚。本发明人通过长年持续地研究,发现梅毒患者尤其是神经梅毒患者的脑脊液神经丝蛋白轻链水平能够充分反映神经梅毒的进展,从而可以根据脑脊液神经丝蛋白轻链水平对梅毒进行分期分型、早期诊断、病情严重程度预估和疗效评估。
神经丝蛋白只存在于神经细胞当中,神经细胞特异性强,并且有很强的抗酶解能力。神经细胞受损后,NF-L会释放到脑脊液中。本发明人通过对神经梅毒患者脑脊液NF-L水平的研究,发现脑脊液NF-L水平具有重大的临床意义,并探索其相关影响因素。本发明人经过长年临床研究发现,NF-L在脑脊液中的水平及其与其他因素的相关性可以为神经梅毒的早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估提供可靠、有效、灵敏的解决方案。
发明内容
于是,针对现有技术中的上述问题,本发明提供了如下技术方案:
1、一种梅毒检测试剂盒,其中,所述试剂盒包括用于检测脑脊液神经丝蛋白轻链水平的检测试剂。
2、根据技术方案1所述的试剂盒,其中,所述检测试剂为抗神经丝蛋白轻链的抗体;优选的是,所述抗体为抗人神经丝蛋白轻链的抗体;另外优选的是,所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体,最优选为单克隆抗体。
3、根据技术方案1所述的试剂盒,其中,所述试剂盒还包括第二检测试剂,所述第二检测试剂为用于选自VDRL检测、USR检测、TRUST检测、RPR检测、TPHA或TPPA检测、FTA-ABS检测、ELISA检测、血NF-L检测、血pNF-H检测、脑脊液pNF-H检测组成的组的一种或者多种梅毒检测方法的检测试剂;优选的是,所述第二检测试剂为用于选自由RPR检测、TPHA或TPPA检测、FTA-ABS检测、血NF-L检测、血pNF-H检测、脑脊液pNF-H检测组成的组的梅毒检测方法的检测试剂;更优选的是,所述第二检测试剂为用于FTA-ABS检测和/或TPPA检测的检测试剂。
4、根据技术方案1所述的试剂盒,其中,所述试剂盒还包括用于辅助抗神经丝蛋白轻链的抗体通过ELISA检测法检测脑脊液神经丝蛋白轻链的辅助试剂;优选的是,所述辅助试剂包括选自由神经丝蛋白轻链抗体包被微滴定板条、神经丝蛋白轻链抗体溶液、辣根过氧化酶偶联物溶液、神经丝蛋白轻链蛋白标准样品、稀释缓冲液、洗涤液、底物溶液、终止液组成的组。
5、根据技术方案1所述的试剂盒,其中,所述第二检测试剂还包括用于检测选自由血NF-L水平、脑脊液pNF-H水平、脑脊液RPR滴度、血液RPR滴度、脑脊液白细胞、脑脊液蛋白、治疗前和治疗后血NF-L差值、治疗前和治疗后脑脊液NF-L差值、治疗前和治疗后脑脊液pNF-H差值组成的组的指标的检测试剂。
6、根据技术方案1所述的试剂盒,其中,所述试剂盒还包括脑脊液穿刺抽取器械和/或脑脊液冻存管。
7、根据技术方案1至6中任一项所述的试剂盒,其中,所述检测试剂为用于对脑脊液神经丝蛋白轻链进行定性检测或定量检测的检测试剂。
8、用于检测脑脊液神经丝蛋白轻链的第一检测试剂和可选的第二检测试剂在制备技术方案1至7中任一项所述的试剂盒中的应用。
9、根据技术方案8所述的应用,其中:
所述第一检测试剂为用于对脑脊液神经丝蛋白轻链进行定量检测或定性检测的检测试剂;
更优选的是,所述检测试剂为抗神经丝蛋白轻链的抗体;
进一步优选的是,所述抗体为抗人神经丝蛋白轻链的抗体;
更进一步优选的是,所述抗体为单克隆抗体。
10、根据技术方案8至9中任一项所述的应用,其中,所述试剂盒用于对神经梅毒进行早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估。
本发明人通过对神经梅毒患者脑脊液中NF-L水平进行研究,首次发现血NF-L异常与神经梅毒的发展及相关症状的发生存在一定相关性,因而对于神经梅毒具有重大的临床意义。由于有症状神经梅毒患者组血NF-L与无症状神经梅毒患者组血NF-L相比较差异有统计学意义,说明不同临床分型或分期神经梅毒患者脑脊液中的蛋白分子水平有所不同,患者脑脊液中的蛋白分子水平有所不同,免疫反应程度及免疫损伤程度也不同,因此可以根据其蛋白分子水平对神经梅毒进行早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估。
附图说明
图1是梅毒未进行治疗的自然病程。
图2显示了各组患者脑脊液(CSF)的NF-L分析结果。其中,NS表示有症状神经梅毒组(n=20);ANS表示无症状神经梅毒组(n=46);S表示隐性梅毒组(n=18)。
图3显示了各组患者的平均脑脊液NF-L水平。其中,NS表示有症状神经梅毒组(n=20);ANS表示无症状神经梅毒组(n=46,包括27名脑脊液TRUST阳性(+)患者和19名脑脊液TRUST阴性(-)患者);S表示隐性梅毒组(n=18)。
图4至图14分别显示了部分神经梅毒患者个体治疗前后的脑脊液NF-L水平、脑蛋白水平和脑白细胞水平的比较结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。但是,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
如上所述,本发明一种神经梅毒检测试剂盒,所述试剂盒包括用于检测脑脊液神经丝蛋白轻链水平的检测试剂。
在一些优选的实施方式中,所述检测试剂为用于对脑脊液NF-L进行定性检测或定量检测的检测试剂。更优选的是,所述检测试剂为用于对脑脊液NF-L进行定量检测的检测试剂。
在一些优选的实施方式中,所述脑脊液NF-L水平为脑脊液NF-L蛋白水平,更优选的是,所述检测试剂为抗NF-L的抗体,进一步优选的是,所述抗体为抗人NF-L的抗体,更进一步优选的是,所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体,最优选为单克隆抗体。所述单克隆抗体可以是已知的,例如从商业试剂公司(如R&D Systems,Inc.,GeneTex InternationalCorporation,abcam等)购得的单克隆抗体,或者从德国IBL等公司购得的NF-L蛋白酶联诊断试剂盒中包括的单克隆抗体。
在一些优选的实施方式中,所述试剂盒还包括可选的第二检测试剂,所述第二检测试剂为用于选自VDRL(venereal disease research laboratory(性病研究实验室))检测、USR(unheated serum regain(血浆不需加热的反应素))检测、TRUST(toluidine redunheated serum test(甲苯胺红血浆不需加热试验))检测、RPR(rapid plasma regain(快速血浆反应素))检测、FTA-ABS(fluorescent treponemal antibody-absorption(荧光螺旋体抗体吸收))检测、TPHA(Treponema pallidum hemagglutination assay(梅毒螺旋体血凝试验))检测、TPPA(Treponema pallidum particle agglutination assay(梅毒螺旋体颗粒凝集试验)检测、ELISA(enzyme-linked immuno-sorbent assay(酶联免疫吸附试验)检测、血NF-L检测、血pNF-H检测、脑脊液pNF-H检测组成的组的一种或者多种梅毒检测方法的检测试剂,这些梅毒检测方法及其所用的试剂都是已知的。例如,VDRL检测、USR检测、TRUST检测、RPR检测、FTA-ABS检测、TPHA检测、TPPA检测和ELISA检测及其所采用的试剂均可以行业标准如梅毒诊断标准(WS 273-2007)所述。血或脑脊液NF-L的检测试剂可以如商用试剂盒NF-(Neurofilament light)ELISA(Enzyme immunoassay forquanlitative determination of human Neurofilament light(NF-L)protein incerebrosphinal fluid)(LBL international GME)所述,血或脑脊液pNF-H的检测试剂可以如商用试剂盒Human Phosphorylated Neurofilament H ELISA试剂盒(BioVendor-Laboratornímedicína a.s.)所述。更优选的是,所述第二检测试剂为用于选自由RPR检测、TPPA或TPHA检测、FTA-ABS检测、血NF-L检测、血pNF-H检测、脑脊液pNF-H检测组成的组的梅毒检测方法的检测试剂;进一步优选的是,所述第二检测试剂为用于FTA-ABS检测和/或TPPA检测的检测试剂。FTA-ABS以及TPPA是诊断梅毒螺旋体感染特异性指标,一般认为脑脊液FTA-ABS阴性可以排除神经梅毒,该指标结合NF-L检测结果,能够增加诊断神经梅毒的敏感性和特异性。
在一些优选的实施方式中,所述试剂盒还包括用于辅助抗NF-L的抗体通过ELISA检测法检测脑脊液NF-L的辅助试剂。在一些优选的实施方式中,所述辅助试剂包括选自由NF-L抗体包被微滴定板条、NF-L抗体溶液、辣根过氧化酶偶联物溶液、NF-L蛋白标准样品、稀释缓冲液、洗涤液、底物溶液、终止液组成的组。
在一些优选的实施方式中,所述试剂盒还包括脑脊液穿刺抽取器械和/或脑脊液冻存管。
本发明还提供了用于检测脑脊液NF-L的第一检测试剂和可选的第二检测试剂在制备神经梅毒检测试剂盒中的应用。
所述第一检测试剂可以为用于对脑脊液NF-L进行定量检测或定性检测的检测试剂,例如,所述检测试剂盒为用于通过ELISA检测法对脑脊液样品中的NF-L进行定性或者定量检测的检测试剂盒。更优选的是,所述检测试剂为抗NF-L的抗体,进一步优选的是,所述抗体可以为抗人NF-L的抗体;更进一步优选的是,所述抗体为单克隆抗体。所述单克隆抗体可以如上所述。
所述第二检测试剂可以为用于检测选自由血NF-L水平、脑脊液pNF-H水平、脑脊液RPR滴度、血液RPR滴度、脑脊液白细胞、脑脊液蛋白、治疗前和治疗后脑脊液NF-L差值、治疗前和治疗后脑脊液NF-L差值、治疗前和治疗后脑脊液pNF-H差值组成的组的指标的检测试剂。
在一些优选的实施方式中,所述试剂盒为用于对神经梅毒进行早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估的试剂盒。
在对神经梅毒进行诊断(包括早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估等)时,可以根据脑脊液NF-L水平对神经梅毒患者进行分型分期(即对神经梅毒进行分型和/或分期);或者,可以根据脑脊液NF-L预后相对于预前(或称为治疗前)的差值对神经梅毒患者进行预后评估。于是,在一些具体的实施方式中,本发明提供了一种神经梅毒检测试剂盒,所述试剂盒包括用于检测脑脊液NF-L水平的检测试剂,并且用于对神经梅毒患者进行分型分期或者预后评估。本发明还提供了所述检测试剂在制备用于对神经梅毒患者进行分型分期(即对神经梅毒进行分型和/或分期)或者预后评估的试剂盒中的应用。
在对神经梅毒进行诊断(包括早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估等)时,可以将脑脊液NF-L水平独立地或者与选自由脑脊液NF-L水平、脑脊液pNF-H水平、脑脊液RPR滴度、血液RPR滴度、脑脊液白细胞、脑脊液蛋白、治疗前和治疗后脑脊液NF-L差值、治疗前和治疗后脑脊液NF-L差值、治疗前和治疗后脑脊液pNF-H差值组成的组中一个或者多个指标结合地用于对神经梅毒进行早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估。于是,在一些具体的实施方式中,本发明提供了一种神经梅毒检测试剂盒,所述试剂盒包括:用于检测脑脊液NF-L水平的第一检测试剂;可选的第二检测试剂,所述第二检测试剂用于检测选自由脑脊液NF-L水平、脑脊液pNF-H水平、脑脊液RPR滴度、血液RPR滴度、脑脊液白细胞、脑脊液蛋白、治疗前和治疗后脑脊液NF-L差值、治疗前和治疗后脑脊液NF-L差值、治疗前和治疗后脑脊液pNF-H差值组成的组中的一个或者多个指标。本发明还提供了所述第一检测试剂和/或所述第二检测试剂在制备用于对神经梅毒进行早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估的检测试剂盒中的应用。
在本发明中,脑脊液NF-L水平、脑脊液NF-L水平、脑脊液pNF-H水平、脑脊液RPR滴度、血液RPR滴度、脑脊液白细胞数、脑脊液蛋白量都是通过已知的检测方法检测的,治疗前和治疗后脑脊液NF-L差值、治疗前和治疗后脑脊液NF-L差值、治疗前和治疗后脑脊液pNF-H差值都可以通过已知方法测得的数据求算的。例如,NF-L、pNF-H都可以采用商用试剂盒测得,其他指标都可以根据我国行业标准梅毒诊断标准(WS 273-2007)规定的方法测得。
实施例
1、患者一般临床资料
本研究共入组患者92例。根据WS 273-2007梅毒诊断标准确诊患有有症状神经梅毒、无症状神经梅毒和隐性梅毒。其中,有症状神经梅毒组23例;无症状神经梅毒组51例;隐性梅毒对照组18例。
有症状神经梅毒组患者的血浆TPPA全部阳性;血浆RPR滴度1:1患者1例,1:4患者2例,1:8患者2例,1:16患者3例,1:32患者4例,1:64患者4例,1:128患者2例,1:256患者5例。脑脊液TPPA阳性23例;脑脊液RPR滴度阴性1例,1:1患者6例,1:2患者3例,1:4患者5例,1:8患者3例,1:16患者4例,1:32患者1例。脑脊液蛋白中位数为62.3mg/dl,最大值为191.6mg/dl,最小值为30mg/dl。脑脊液白细胞数中位数为17×106/L,最大值为130×106/L,最小值为0×106/L。
无症状神经梅毒患者的血浆TPPA全部阳性;血浆RPR滴度1:1患者2例,1:2患者3例,1:4患者5例,1:8患者11例,1:16患者11例,1:32患者14例,1:64患者2例,1:128患者2例,1:256患者1例。脑脊液TPPA阳性44例,阴性7例。脑脊液RPR滴度阴性30例,1:1患者9例,1:2患者9例,1:4患者2例,1:8患者1例。脑脊液蛋白中位数为29.6mg/dl,最大值为60.7mg/dl,最小值为7.2mg/dl。脑脊液白细胞数中位数为10×106/L,最大值为216×106/L,最小值为1×106/L。
隐性梅毒患者的血浆TPPA全部阳性;血浆RPR滴度阴性患者3例,1:1患者1例,1:2患者3例,1:4患者3例,1:8患者2例,1:16患者3例,1:32患者1例,1:64患者1例,1:128患者1例。脑脊液TPPA阴性17例,阳性1例;脑脊液RPR滴度全部阴性。脑脊液蛋白中位数为22.8mg/dl,最大值为45.2mg/dl,最小值为8.6mg/dl;脑脊液白细胞数中位数为3×106/L,最大值5×106/L,最小值为0×106/L。
2、样品获取
根据入组患者情况,行腰椎穿刺术以及肘静脉穿刺术留取脑脊液、血液进行常规检验,并留取脑脊液和血液标本,标本配对置-80℃冰箱保存,最后统一检测,避免样本检测批次误差。
在患者知情同意下,腰穿收集脑脊液标5ml,静脉采集血液标本10ml。腰椎穿刺术收集脑脊液后,用冻存管分装,编码标记;静脉穿刺术收集血液后,置于4℃离心机中,离心10分钟,3000转/分钟,迅速分离上层清亮血浆置于冻存管中,编码标记。脑脊液和血浆标本全部保存于-80℃冰箱,最后统一检测。
3、检测方法
实施例中采用的检测方法都是已知的。其中,脑脊液NF-L和脑脊液NF-L的检测采用NF-(Neurofilament light)ELISA(Enzyme immunoassay for quanlitativedetermination of human Neurofilament light(NF-L)protein in cerebrosphinalfluid)(LBL international GME)根据说明书进行检测。血浆和脑脊液pNF-H的检测采用Human Phosphorylated Neurofilament H ELISA试剂盒(BioVendor-Laboratornímedicína a.s.)并按照所附的厂家的说明书进行检测。血浆RPR滴度、脑脊液RPR滴度、脑蛋白检测和脑白细胞的检测根据WS 273-2007所述的方法进行。
4、治疗方案
有症状神经梅毒和无症状神经梅毒的治疗方法采用国家标准治疗方法,青霉素2400万U/天,分为400万U/4小时,静脉滴注,连续治疗14天。治疗前数据是使用在治疗之前第0天取得的样品检测得到的数据;治疗后数据是在采用上述治疗方案进行治疗后第180天取得的样品检测得到的结果。
5、结果与分析
各组患者脑脊液NF-L水平和差异比较
各组患者的脑脊液NF-L水平的数据(表2)和对比分析(图2)结果如下:有症状神经梅毒组(NS)、无症状神经梅毒组(ANS)、隐性梅毒组(S)患者的脑脊液NF-L的中位数分别为5806.25pg/ml、217.59pg/ml、266.32pg/ml,其中有症状神经梅毒组脑脊液NF-L水平高于无症状神经梅毒组(P<0.001)以及隐性梅毒组(P<0.001),差异具有统计学意义。无症状神经梅毒组、隐性梅毒组患者的脑脊液NF-L水平没有差异(P=0.915)。因此,可以根据脑脊液NF-L水平对梅毒患者进行分型,例如可以将有症状神经梅毒患者与无症状神经梅毒或隐性梅毒的患者区分开。
表2各组患者脑脊液NF-L水平(n=92)
疾病类型 | NF-L水平(pg/ml) |
有症状神经梅毒(23) | 5806.25(409.25,41616.68) |
无症状神经梅毒(51) | 217.59(33.48,2020.43) |
隐形梅毒(18) | 266.32(117.83,679.43) |
另外,从图3也可以看出,NS组水平远高于ANS组和S组,这与不同类型梅毒的严重程度例如对神经损伤程度是吻合的。另外,脑脊液NF-L水平非常高,甚至超过8000pg/ml,因此可以根据脑脊液NF-L水平以高灵敏度对梅毒严重程度进行量化检测。
脑脊液NF-L与各因素的相关性分析
所有患者脑脊液NF-L的相关性分析结果如下:脑脊液NF-L水平与患者梅毒分期(r=0.564,p<0.001)具有相关性,除了与血浆NF-L水平(r=0.257,P=0.018)呈正相关外,还与血浆pNF-H水平(r=0.352,P=0.001)、脑脊液pNF-H水平(r=0.764,p<0.001)、年龄(r=0.625,p<0.001)、CSF蛋白(r=0.635,p<0.001)、血浆RPR滴度(r=0.347,p=0.001)、脑脊液RPR滴度(r=0.540,p<0.001)呈正相关。
NS、ANS、S各组的相关性分析结果如下:NS组脑脊液NF-L水平与血液pNF-H(r=0.475,P=0.034)、脑脊液pNF-H(r=0.775,P<0.001)正相关;ANS组脑脊液NF-L水平与脑脊液pNF-H(r=0.541,P<0.001)、脑脊液蛋白(r=0.287,P=0.041)正相关;S组脑脊液NF-L水平与、脑脊液蛋白(r=0.666,P=0.003)正相关。
另外,从图4至图14可以看出,脑脊液NF-L的检测结果与脑蛋白和脑白细胞的结果基本一致,但是可以更加灵敏地反映梅毒的严重程度或者所造成的损伤程度,图4至图14都反应了这一点,尤其是图7和图12表现得尤其明显。例如可以参见图5,脑白细胞并明确地反应出治疗后有好转的迹象,但是脑蛋白和脑脊液NF-L明确反应积极的疗效。例如参见图10,脑蛋白结果并没有显示出积极的疗效,但是脑脊液NF-L能够反应明显的疗效,这与该名患者的梅毒症状变化完全一致。
脑脊液NF-L预后分析
预后共随访25人,有症状神经梅毒组随访15人,无症状神经梅毒组10人。具体数据见表3。
(1)脑脊液NF-L治疗前后的差异比较
脑脊液NF-L治疗前水平中位数为2141.76pg/ml,治疗后脑脊液NF-L水平为1057.37pg/ml;神经梅毒治疗后脑脊液NF-L水平下降,且具有统计学意义(P=0.006)。
(2)神经梅毒组与无症状神经梅毒组脑脊液NF-L治疗前后差值的差异比较
神经梅毒组脑脊液NF-L水平变化水平中位数为-2647.46pg/ml,即下降2647.46pg/ml;无症状神经梅毒组脑脊液NF-L水平变化水平中位数为49.23pg/ml,即上升49.23pg/ml;两者比较有统计学意义(P=0.003)。
治疗后脑脊液NF-L与各因素的相关性分析
治疗后脑脊液NF-L水平与梅毒分期(r=-0.759,P<0.001)、治疗前脑脊液NF-L水平(r=0.654,P=0.001)、治疗前后血NF-L变化水平(r=-0.636,P=0.001)、治疗后血浆pNF-H水平(r=0.574,p=0.005)、治疗前血浆pNF-H水平(r=0.670,P=0.001)、治疗前后血浆pNF-H变化水平(r=-0.670,P=0.001)、治疗前脑脊液NF-L水平(r=0.923,P<0.001)、治疗前后脑脊液NF-L变化水平(r=-0.548,P=0.001)、治疗后脑脊液pNF-H水平(r=0.694,P<0.001)、治疗前脑脊液pNF-H水平(r=0.831,P<0.001)、治疗前后脑脊液pNF-H变化水平(r=-0.573,P=0.003)、脑脊液RPR(r=0.495,P=0.012)、脑蛋白(r=0.631,P=0.001)相关。
治疗前后脑脊液NF-L变化水平与梅毒分期(r=0.611,P=0.001)、性别(r=0.474,P=0.017)、治疗前血NF-L水平(r=-0.460,P=0.031)、预后脑脊液NF-L水平(r=-0.548,P=0.005)、治疗前脑脊液NF-L水平(r=-0.759,P<0.001)、治疗前脑脊液pNF-H水平(r=-0.682,P<0.001)、治疗前后脑脊液pNF-H变化水平(r=0.571,P=0.003)、脑脊液RPR(r=-0.419,P=0.037)、脑蛋白(r=-0.476,P=0.016)相关。
表3有症状神经梅毒组与无症状神经梅毒组脑脊液NF-L治疗前后水平变化表。
最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (15)
1.用于检测脑脊液神经丝蛋白轻链的第一检测试剂在制备神经梅毒检测试剂盒中的应用,所述试剂盒包括用于检测脑脊液神经丝蛋白轻链水平的第一检测试剂。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述第一检测试剂为抗神经丝蛋白轻链的抗体。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述抗体为抗人神经丝蛋白轻链的抗体。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述抗体为单克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述试剂盒还包括第二检测试剂。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述第二检测试剂为用于选自VDRL检测、USR检测、TRUST检测、RPR检测、TPHA或TPPA检测、FTA-ABS检测、ELISA检测、血NF-L检测、血pNF-H检测、脑脊液pNF-H检测组成的组的一种或者多种梅毒检测方法的检测试剂。
8.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述第二检测试剂为用于选自由RPR检测、TPHA或TPPA检测、FTA-ABS检测、血NF-L检测、血pNF-H检测、脑脊液pNF-H检测组成的组的梅毒检测方法的检测试剂。
9.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述第二检测试剂为用于FTA-ABS检测和/或TPPA检测的检测试剂。
10.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述试剂盒还包括用于辅助抗神经丝蛋白轻链的抗体通过ELISA检测法检测脑脊液神经丝蛋白轻链的辅助试剂。
11.根据权利要求10所述的应用,其特征在于,所述辅助试剂包括选自由神经丝蛋白轻链抗体包被微滴定板条、神经丝蛋白轻链抗体溶液、辣根过氧化酶偶联物溶液、神经丝蛋白轻链蛋白标准样品、稀释缓冲液、洗涤液、底物溶液、终止液组成的组。
12.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述第二检测试剂包括用于检测选自由血NF-L水平、脑脊液pNF-H水平、脑脊液RPR滴度、血液RPR滴度、脑脊液白细胞、脑脊液蛋白、治疗前和治疗后血NF-L差值、治疗前和治疗后脑脊液NF-L差值、治疗前和治疗后脑脊液pNF-H差值组成的组的指标的检测试剂。
13.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述试剂盒还包括脑脊液穿刺抽取器械和/或脑脊液冻存管。
14.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述第一检测试剂为用于对脑脊液神经丝蛋白轻链进行定性检测或定量检测的检测试剂。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的应用,其特征在于,所述试剂盒用于对神经梅毒进行早期诊断、分型分期、疗效评价和/或预后评估。
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