JPS60224065A - 軟骨組織異常の診断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は軟骨または関連の組織に影響する障害を検出す
る方法に関し、特に、そのような障害を末梢血のグラタ
ン硫酸の濃度を測定する事により検出する方法に関する
。

従来の技術 多くの人が軟骨または軟骨類似組織の障害に苦しんでお
り、したがって軟骨組織の分解同様正常および異常軟骨
組織の組立てが現在の探究の重要な話題である。骨関節
炎は軟骨組織の分解により特徴付けられる状態であり、
５５才以上の多くの人に起こる。仕事場での常習的欠席
の一つの最も重要な理由は慢性背痛であり、を椎の間に
あり、軟骨に非常に類似した組織から形成されている椎
間板の劣化に多くの場合関連する。軟骨に関係のある他
の組織は眼の角膜の組織であり、角膜混濁、視覚消失症
、斑状変性症は正常角膜組織に存在する巨大分子の生合
成ができない人に起こる事が示されている。

軟骨、椎間板または角膜障害の診断はしばしば関節また
は背部に痛みを感じ、斑状変性症の場合には視覚の消失
が始まる比較的進んだ段階に障害が遅して〃・らのみく
だされる。軟骨、椎間板または角膜組織の障害が症候性
になる前にその開始を診断する方法が望まれている。

プロテオグリカンは軟骨の細胞外マトリックスの主成分
であり、会合体に高度に組織化されているのが観察され
る。これらの会合体はヒアルウロン酸結合領域と称され
る分子部分を通してヒアルウロン酸と特異的に結合でき
るプロテログリカン分子を含んでいる。

軟骨組織プロテオグリカン分子は約２０００−４０００
アミノ酸残基のコアタンパク質中心を持つ。このコアタ
ンパク質の一つの末端はＮ　−結合少糖類を含有し、非
常に特異的にヒアルウロン酸と相互作用できる。それは
ヒアルウロン酸結合領域と称されている。タンパク質部
分の大部分は共有結合的に結合したグリコザミノグリコ
ン部分（特にグラタン硫酸およびコンドロイチン硫酸）
が豊富にある。グラタン硫酸部分はコンドロイチン硫酸
が少いグラタン硫酸潤沢領域およびコンドロイチン硫酸
量の大多数が観察される王多糖類結合領域の両方に観察
される。コンドロイチン硫酸部分はヒトでは椎間板組織
の約５０００から若者の関節軟骨での約１５，０００か
ら２０，０００捷での範囲の分子量を持っている。グラ
タン硫酸はその分子量が約３０００から約９０００の範
囲であり、椎間板組織のものが関節軟骨のものよりわず
かに大きい。グラタン硫酸は三糖類（グルコサミン−ガ
ラクトース）の繰り返し配列からなっている。各々のこ
れら２つの糖が硫酸化されている程度はグラタン硫酸の
起源により異る。ケラチン硫酸分子をタンパク質に結合
している結合領域を作っている糖の配列の正確な組成が
何であるかは才だ明確でない。

生出後、プロテオグリカン分子は大きさおよび化学的組
成物が変化する。変化はコアタンパク質に共有的に結合
しているコンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸および少糖
類分子の相対的含量同様コンドロイチン硫酸鎖の長さの
変更も含んでいる。

グリコサミノグリカン部分特にグラタン硫酸は最近の研
究の目標であった。例えば、骨関節炎軟骨から単離され
たプロテオグリカンは未熟の組織から単離されたプロテ
オグリカンと類似した組成を持っている事が示されてき
た。コンドロサイト（軟骨細胞〕は組織複製の試みにお
いて、明らかにグラタン硫酸が少い未熟プロテオグリカ
ンの生合成ヘスイッチされている。グラタン４Ａ酸含量
は軟骨の硬さに相関する事が観察されており、低グラタ
ン硫酸プロテオグリカンは関節の負荷耐性要求に対し不
適である事が示唆されてきた。

軟骨組織に関する最近の探死の目標がグラタン硫酸であ
った事実にも力・かわらず、比較的グラタン硫酸につい
て知られていない。グラタン硫酸はまだ十分に特徴付け
られていないだけでなく、その分解またはそれ以上に一
般的にその代謝についてほとんど仰られていない。

それにもかかわらず、グラタン硫酸はきわめて組織特異
的であり天然には軟骨、椎間板および角膜組織にのみ存
在する事が知られている。一方コンドロイチン硫酸は組
織特異的でなく種々の他の結合組織に見い出されている
。明らかにグラタン硫酸は軟骨弁組織、その前駆体およ
びその分解生成物に対しコンドロイチン硫酸よりはより
特異的な指標である。

発明の要約 軟骨、椎間板または角膜組織の異常を持つ患者の末梢血
中のグラタン硫酸は普通低レベルである事が観察されて
いるが、グラタン硫酸は異常に高いまたは異常に低いレ
ベルで存在するらしい事が観察された。末梢血中のグラ
タン硫酸のための定量的な免疫検定法が開発されてきた
。末梢血中のケラタン硫酸の異常なレベルと軟骨椎間板
または角膜組織の障害の間の相関が存在する事が観察さ
れた。末梢血中のグラタン硫酸の異常な低レベルおよび
異常な高レベルは関連する角膜障害同様に斑状変性症（
一般的に失明に結びつく角膜障害）にも相関した。骨関
節炎の患者はケラタン硫酸の異常に高いレベルを持つ傾
向がある。

良好な具体例の詳細な説明 本発明に従うと、末梢血中のケラタン硫酸のレベルは軟
骨、椎間板および角膜組織の障害の重要な指標である事
が見い出される。本明細書においては以後これらのグラ
タン硫酸含有組織は総称的に軟骨弁組織と称する。特に
、末梢血中のグラタン硫酸の異常な低レベルおよび異常
な高レベルは斑状変性症および関連する角膜障害に相関
した。

末梢血中のグラタン硫酸の異常な高レベルは骨関節炎と
相関した。

本発明の良好な例に従うと、末梢血血漿または血清中の
グラタン硫酸レベルは免疫検定法により定量され、末梢
血中のグラタン硫酸の低、普通および上昇した１ノベル
の差を十分に感度よく区別する。特に酵素連結免疫吸着
検定法が開発され、それはグラタン硫酸に特異的に反応
性を持つモノクローナル抗体を使用する阻害工程を含ん
でいる。

末梢血中のケラタン硫酸レベルはり、前にはほとんど研
究されていす、重要な情報を示す事は期待されていなか
ったので末梢血中の異常グラタン硫酸レベルで軟骨群組
織障害が示される事は、輔＜べき事であり、期待されて
いなかった。病的状態の指標としての末梢血中のグラタ
ン硫酸レベルは、末梢血中のグラタン硫酸レベルがとて
も低く有効には検出できないと考えられていたので、以
前は考慮されていなかった。そのような状態であるので
末梢血中のグラタン硫酸レベルは厳冨に試験されていな
い。さらに、グラタン硫酸は血清および血漿中に有意に
高いレベルで存在する成分に化学的に類似しており、血
中に存在するレベル（（おいてのグラタン硫酸に対する
特異的な定量的試験法の以前の欠落は末梢血中のケラタ
ン硫酸レベルの観測を妨げていた。末梢血中のグラタン
硫酸の臨床的に意味のあるレベルの発見は軟骨組織のグ
ラタン硫ｅに対する検定法の開発により実現した。

グラタン硫酸をほとんど含有しないと信じられている末
梢血血清または血漿をグラタン硫酸検定の適した陰性対
照として選択した。全く期待していなかったが、血液試
料は本当に低かったが有意のレベルのグラタン硫酸を含
んでいる事が観祭され、末梢血中のそのような有意なグ
ラタン硫酸レベルが軟骨群組織障害を示すかどうかの調
査を導き、この墨が明らかになった。

グラタン硫酸レベル測定のために特に開発した免疫検定
法は、サンドイッチ技術に基づく酵素連結免疫吸着検定
法ＩＥＬＩＳＡ）であり、抗原を定性的およびボ量的に
測定するため同様抗血清の力価および特異性を決定する
ために以前使用されていたものである。特に開発された
検定法においては、抗原（ケラタン硫酸）は抗体阻害工
程での取り込みにより定量的に測定される。簡単に記載
すると、ミクロ力価プレートをウシ鼻骨Ｄ１プロテオグ
リカン（ＢＮＰ）のごときグラタン硫酸含有物質で被覆
する。（種々の咄乳類種のグラタン硫酸はヒトのグラタ
ン硫酸と同じ構造を持っており、ヒトのグラタン硫酸と
反応する抗体と同じように反応する；しかしながら、ヒ
トのグラタン硫酸のレベルの測定に非ヒトプロテオグリ
カンを標準物質として使用した場合はヒトケラタン硫酸
レベルヲ非ヒトプロテオグリカン当量レベルとして表現
するのが適当である。） 阻害段階では、別のバイアルで、グラタン硫酸反応性抗
体（良好なのはモノクローナル抗体）を含有する溶液の
一部を、未知の血液の血漿−または血清の検体と同様に
種々の既知濃度のグラタン硫酸含有物質と抗体がグラタ
ン硫酸と実質的に先金に反応するのを可能にする十分な
時間インキュベートする。その後、等量のインキュベー
ション混合物をグラタン硫酸被覆プレートに入れ、浴液
中でケラタン硫酸と前もって反応していない（阻害され
た）抗体に十分な期間インキュベートし、プレートに被
覆されたグラタン硫酸と反応せしめる。

プレートに結合していないすべての抗体、グラタン硫酸
および抗体−グラタン硫酸複合体を除去するためプレー
トを徹底的に洗浄する。

プレートに結合している抗体の量全可視化する手段とし
ては、プレートラ抗−ケラタン硫酸抗体と反応し、酵素
で適切に標識した過剰の第２抗体に暴露する。例えば、
もし第１抗体が抗グラタン４Ａ？モノクローナルマウス
抗体であるなら、酵素標識は抗マウス免疫グロブリンに
結合される。第２抗体を標識する良好な手段は、発色反
応を触媒しそれによりその存在がわかるペルオキシダー
ゼのごとき酵素を結合する事である。適したペル第１４
１８０．１９８２、に記載されている。グラタン硫酸結
合抗体の可視化の方法として他の酵素伝達系もペルオキ
シダーゼ伝達系に置換されうる。

この特定の検定系において、検体中により多いグラタン
硫酸が存在すると、発色がおさえられる。

発色の程度は検体中のグラタン硫酸の関数であるが直線
関係ではない。従って未知の検体の発色を比較する既知
のグラタン硫酸標準濃度からの標準曲縁を作る必要があ
る。この検定の標準曲線は限られたグラタン硫酸濃度範
囲でのみ一般に直線的であり、未知の検体中のグラタン
硫酸のレベルを標準曲線から正確に読み取るためには、
各々の検体の連続的希釈により各々の検体検定の一つま
たはそれ以上の連続的希釈液が直線範囲にはいる墨を確
かめて検定を実施するのが望ましい。

上に記載したＥＬＩＳＡ検定の変更は抗ケラタン硫酸抗
体を固体支持体に結合せしめる事である。

この場合また必要とされるのは酵素がグラタン硫酸含有
分子に結合される事である。既知の量の酵素結合ケラタ
ン硫酸含有分子を既知の倉の試験検体に６≦加し、その
混合物の一定の量を被覆ウェルに置く。試験検体中のグ
ラタン硫酸が酵素結合分子中のグラタン硫酸と抗体結合
部位を競合する。

適当な時間の後ウェルを洗浄し就いて酵素触媒発色反応
が進行する試薬糸を加えると、この場合は、より多い色
の発色は反応混合物中の遊離グラタン硫酸はより少い事
を示す。この検定系はいく分簡易である利点を持ってお
り、プレートに結合された抗体、酵素結合ケラタン硫酸
溶准および酵素基質溶液のみを必要とする。医学研究室
へはこの検定系をキットの形で提供する方がより適して
いるであろう。

ラジオイムノアッセイは別の適した技術を代表し、それ
により未知の検体のグラタン硫酸が定量でき、本発明は
採用する免疫検定を特定の型に制限しない。酵素連結ま
たは他の非放射性比色検定法が安全配慮および試薬安全
性の観点からラジオイムノアッセイ技術より望ましい。

末梢液中のグラタン硫酸のレベルに鋭敏な検定の開発は
、部分的にはグラタン硫酸に特異的に反応するモノクロ
ーナル抗体の開発により可能になった。最初の開発はＢ
ｒｒｂｃｅ　Ｃａｔｅｒｓｏｎ　ＣＪ、　ｏｆＢｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５８，８８４８
−８８５４（１９８３））により、軟骨組織に対するモ
ノクローナル抗体を開発している際になされた。ある種
のこれらのモノクローナル抗体がケラタン硫酸部分と特
異的に反応性がある事が観察され、グラタン硫酸部分が
離れた存在として存在していても反応する。その後、他
のグラタン・硫酸特異性モノクローナル抗体が開発され
た。

呻乳類種のグラタン硫酸の本質的な類似性のため、１つ
の種からのグラタン硫酸反応性モノクローナル抗体は他
の種からのグラタン硫酸ともしばしば反応する。しかし
ながら、グラタン硫酸に対する反応性は１つの種から他
の種に変わると変化し、もしグラタン懺酸標早品をグラ
タン硫酸レベルを測定している種と異った種から得たな
らば、グラタン硫酸レベルは標準品当量で表現される。

さらに、別個の測定から誘導される変換因子によりレベ
ルが相関づけられる。最も標準化されたグラタン硫酸含
有物質の一つはウシ鼻骨Ｄ１プロテオグリカン（ＢＮＰ
）であり、それに対するヒト血液グラタン硫酸レベルを
測定するとその場合ヒト血液レベルはｎｉ／ｍｅ、ＢＮ
Ｐ当量として表現される。ヒトケラタン硫酸濃度に変換
するにはＢＮＰ当量に０．１０の因子を掛ける。

グラタン硫酸に対するモノクローナル抗体（Ｂｒ１Ｌｃ
ｅ　Ｃａｔｅｒｓｏｎにより開発されたような）の反応
性はいくぶん硫酸化の程度に依存しており、免疫検定に
おいて絶対グラタン硫酸レベルの不確定さの程度をいく
らか上げている事も仰られている。それにもかかわらず
、ＥＬＩＳＡはグラタン硫酸の異常レベルを明瞭に検出
するためには十分定型的である。Ｅ’ＬＩＳＡはたとえ
異った技術者で実施しても同一の試料においては良好な
再現性を持っている。さらに、特定の患者のグラタン硫
酸の末梢血レベルは２４時間の間はどの時間においても
全く安定に残存する傾向がある事が観談されている。そ
れ故、患者のグラタン硫酸レベルの有意な変化は患者の
状態の悪化または処置に対する応答を表わしている。

正常成人末梢ヒト血液血清または血漿は約３０００から
約９０００　ｎｇ／ｖｄｌ、ＢＮＰ当量を含んでおり、
約３００から約９００　ｎ９／ｍｌのヒトケラタン硫酸
に相当する。約９００　ｎｆｌ／ｍ１以上のグラタン硫
酸レベルがヒト成人においては異常に高いと考えられ、
例えば骨関節炎のごとき軟骨群組織の悪化全示す。成人
において３００　ｎ９／−以下のグラタン硫酸レベルは
異常に低いと考えられグラタン硫酸欠乏を示す。ヒト成
人において１１００ｎ　９　／ｍ１以上または１００　
ｎ９／ｍｌ以下のケラタン硫酸レベルは異常な軟骨代謝
を強く示していると考えられる。これらのレベルは特屋
の標品によって数値的に表わされたものであり、他の標
品ではこれらの参考値が変わる事を理解されたい。より
一般的には、平均より約１０Ｘ以上、特に平均より約３
０％以上のグラタン硫酸レベルが異常に冒いと考えられ
、平均より約２０％以下特に平均より約４’ＯＮ以下が
異常に低いと考えられる。ヒト成人の正常グラタン硫酸
レベルはいくぶん年令依存性であり、正常グラタン硫酸
レベルはより密接に年令群に相関する事に注目しなけれ
ばならない。

小児は一般的に成人よりも高いグラタン硫酸レベルを持
ち、種々の発達段階での小児のための正常値を決めなけ
ればならない。

骨関節炎患者はグラタン硫酸の異常に高いレベルを持つ
傾向が明瞭に示されたけれども、一方斑状変性症の患者
の末梢血はグラタン硫酸が実質的にないかまたはグラタ
ン硫酸がきわめて上昇したレベルである事が観察され、
正常軟骨群組織金持つ患者と軟骨群組織の異常な発現ま
たは劣化を持つ患者の間のレベル範囲にいくらかの車り
がある。

それ故異常グラタン伏酸レベルは必ずしも結論的に軟骨
群組織異常を示すわけではなく、グラタン硫酸が正常レ
ベルであるといって軟骨群組織異常を除外するわけでは
ない。しかし、ある種の異常レベルにおいては、軟骨群
組織異常を持っている可能性は有意に上昇する。

本発明は特定の実施例によりさらに詳細に以下に記載さ
れる。

実施例１゜ ９つのポリスチレンプレートａ５ＯＮエタノール中に３
０分間置く。プレートを風乾し、ＢＮＰを含有する２０
０マイクロリツトルの２０ｍＭ炭散塩／炭酸水素塩、０
．０２％ナトリウムアジド、ｐＢ’９．２緩衝液を９６
のウェルの各々に入れる。

各々のプレー１プラスチツクの袋に入れ４℃で保存し、
９０日以内に使用する。

検定自身は以下のごと〈実施する。１５０μｌの未類の
血液血清検体および５から０゜０４μ！９／ｍｌの濃度
範囲の１５０μｌのＢＮＰ標準品を１５０μｌの抗−グ
ラタン硫酸１／２０１５−１）−４抗体ＣＣａｔｅｒｓ
ｏｎ＋前記文献）と１／２０００で、５ｍＭＥＤＴＡを
含む１％ＢＳＡ、＋）ン酸緩衝化塩溶液、０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ２０中で１時間インキュベートする。

１時間インキュベートが終了したら２００μｌのインキ
ュベーション混合物を調製したプレートのウェル中へ入
れ３７℃で１時間置く。続いてリン酸緩衝化塩溶液ＣＴ
ｗｅｅｎ　Ｏ，０５％〕　で洗浄しく３×５分）、続い
てウェルの水気を切り、２００μｌのペルオキシダーゼ
とつながった抗−マウスＩ（７Ｇ（１％ＥＳＡ、リン酸
緩衝化塩溶液、Ｔｗｅｅｎ２０．０．（ｊＳＸ中）を各
々のウェルに添加する。

１時間後、溶ｇ、ヲ除きウェルを洗浄する（３×５分〕
。

ペルオキシダーゼの存在を示すための基質溶液（１９８
２）前記文献）’！ｉ−加え、６０分間放置して発色せ
しめる。ＴｉｔｅｒｔｅｋマルチスキャンｔＵｔ（Ｆｌ
ｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　ｆ用いて、記載
したごとぐ各々の場合で生じる色の量全決定する。検定
の最後に得たλ４，２値を既仰量の精製ＥＮＰで得たλ
４９２値から構成した標準曲線と比較する。

実施例２゜ 盲目試験においては、患者の名前または病歴を提供せず
に４０の血清試料を検定に洪した。検定実施後、試料の
６つが斑状変性症を持つと診断された患者（患者１と示
されている）から得たものであり、試料の３つば斑状変
性症に関連する角膜障害ケ持つと診断された第２の患者
（患者２と示さｔている）からの試料である。結果全以
下の表１の表にした。

表　１ 患者１（反復検体） ９９９．１００９，１０３３゜ １０７５．１０８１．１０９３　。

１１０９．１１２０，１１２５゜ １１３２．１２５６，１２５６゜ １２７６．１３０２．１３４６ 患者１は事実上血清にグラタン硫酸を持たない。

患者２はその血清中のグラタン硫酸が非常に高いレベル
である。それ放血中のグラタン硫酸の異常なレベルは斑
状変性症および関係する障害を示した。反復検体はこの
検定の結果の良好な再現性をさらに示した。

実施例３ 関節の疾病の治療の患者を除いて一般的な病院患者の集
団から１８０の血清検体を得た。（これは一般的な集団
を示すわけではなく、また関節の疾病を持っているが他
の理由で病院へかかつている患者を排除しない）同一の
病院において関節疾病の治療している患者から１１７の
血液検体もまた得た。すべての血液試料は実施例１の方
法によりグラタン硫酸を検定し７た。

結果が決定された後、関節疾病の患者の病歴を調べ、骨
関節炎を持つと以前に診断されたすべての１１７関節疾
病患者の結果を再計算した。結果を表２に要約した。

表　２ ヒト成人血清中のグラタン硫酸含量 一般的病院患者集団　１８０　８３２±３９７　３４．
４関節疾病の患者　１１７　．９８６±２６８　５７．
３骨関節炎の患者　１１　１１９５±２８６　８１．１
３一般および症候性群の血液試料中のグラタン硫酸レベ
ルは重なっているが、末梢血血清中に約９００　ｎｇ／
　ｍ１以上のグラタン硫酸レベルを持つ患者は関節疾病
集団の方が一般の集団よりもより以上に多いらしい事が
観察できるようである。骨関節炎を持つ事が知られてい
る群においては結果はより劇的で、グラタン硫酸レベル
が上昇しており軟骨変質の本質的な指標を提供している
。

前記の表から、９００　ｒｖｇ／　ｍｌまたはそれ以上
のグラタン硫酸レベルは軟骨組織変質の指標であり、グ
ラタン硫酸のレベルが上昇している患者（特に老人患者
）は軟骨組織変質の他の指標を更に検青しなければなら
ないと結論される。一般的病院患者集団の約３分の１が
選択された域値９００ｎｇ／ｍ１３以上のグラタン硫酸
レベルを持っている事は真実であるが、この集団は本当
の一般的な集団ではなく、むしろ多くのヒトが骨関節炎
を持つ事が予想される老人患者を不釣合いに高いパーセ
ントで含有する事を思い起こさねばならない。

ある良好な具体例によって本発明を記載してきたが、本
発明の範囲から離れる事なく改変できる事は通常の当事
者には明らかである。例えば、免疫検定に使用する抗体
はモノクローナルである必要がなく、もしグラタン硫酸
に対して十分特異的であればポリクローナル抗体分画も
使用する事ができる。しかしながら、モノクローナル抗
体が入手可能である事実を考えると、モノクローナル抗
体の使用は確かに良好である。本発明は王としてヒト末
梢血中のグラタン硫酸レベルの測定について記載してお
り、その中で軟骨組織変質の診断が最も興味ある点であ
る；しかしながら本方法は同様に下等動物にも適用でき
、種々の哺乳種類においてグラタン硫酸の構造が保存さ
れているため下等動物におけるグラタン硫酸の異常レベ
ルの診断に同一のモノクローナル抗体を１更用して多く
の場合本明細書に記載した検定を使用する事ができる。

本発明の種々の特色を特許請求の範囲に示した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　動物の末梢血の血清または血漿検体中のグラタン
   硫酸のレベルを測定し、検体中のグラタン硫酸の異常レ
   ベルに注目する事を特徴とする哺乳類動物の軟骨、椎間
   板および角膜ｍ織の異常性を示す方法。 ２、　前記末梢血検体中のグラタン硫酸のレベルを免疫
   検定により決定する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ａ　前記検体中のグラタン硫酸のレベルを酵素連結免疫
   吸着検定法により決定する特許請求の範囲第２項記載の
   方法。 ４、　前記免疫検定がグラタン硫酸に反応性のあるモノ
   クローナル抗体を利用する特許請求の範囲第２項記載の
   方法。 ５　’ｐ’ｒＪ記動物かヒトである特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 Ｇ　グラタン硫酸含有物質を固体支持体に結合せタン硫
   酸抗体複合体形成を阻止 シ、 前記のインキュベートした検体および抗体を前記固体支
   持体に暴露して遊離抗体をグラタン硫酸含有物質に結合
   せしめ、 前記支持体に結合されたグラタン硫酸含有物質への抗体
   結合量を決定し、および 前記検体中のグラタン償酸レベルへ抗体結合の程度を相
   関せしめる事を特徴とする哺乳類末梢血の血漿または血
   清検体中のグラタン硫酸レベルを測定する方法。 ７　前記抗体がモノクローナル抗体である特許請求の範
   囲第６項記載の方法。 ＆　前記第１抗体と反応性のある第２抗体を前記固体支
   持体に暴露して結合せしめ、前記結合第２抗体を可視化
   する事により、支持体結合、グラタン硫酸含有物質に結
   合された前記抗体を決定する特許請求の範囲第６項記載
   の方法。 ９．　前記第２抗体が結合した酵素を運搬し、前記結合
   第２抗体の可視化を前記酵素の存在下色を発現する基質
   系に前記支持体を暴露する事により達成し、固定時間内
   に発現する色のレベルを測定する特許請求の範囲第８項
   記載の方法。 １α同様の方法により既矢口の濃度のグラタン硫酸を検
   定し、標準曲線を決定し、標準曲線全参考にして前記検
   体中のグラタン硫酸濃度を決定する特許請求の範囲第６
   項記載の方法。 １１、ケラタン硫酸反応性抗体を固体支持体に結合せし
   め、 グラタン硫酸含有物質ケ標識し、 前記標識グラタン硫酸含有物質の一定量を含有する検体
   を前記支持体結合グラタン硫酸反応性抗体に暴露せしめ
   、 前記支持体に結合している標識の量を決定し、および 結合標識量を検体中のグラタン硫酸量と相関せしめる事
   を特徴とする末梢血の検体中のグラタン硫酸レベルを測
   定する方法。