JP2014514424A - 同じ多糖鎖の4位または6位でバイオテクノロジー的に硫酸化されたコンドロイチン硫酸、およびその調整方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、硫酸化されていないコンドロイチン主鎖から出発する化学硫酸化によるコンドロイチン硫酸の製造方法に関する。本発明の方法では、同じ多糖鎖内で、N−アセチル−D−ガラクトサミン残基の4位または6位が同時に硫酸化する。今までに記載された合成法で得られたものとは異なり、このようにして得られたコンドロイチン硫酸には、天然のコンドロイチン硫酸で観察されたものと同じ硫酸化パターンが存在する。
コンドロイチン硫酸(CS)は、異なる位置で硫酸化されベータ1−3結合によって結合されたグルクロン酸(GlcA)およびN−アセチル−D−ガラクトサミン(GalNAc)の残基によって形成された二糖配列からなるグリコサミノグリカン(GAG)類に属する、天然の複合多糖である。
表1に示すように、陸生動物に由来するCSは、類似した分子量パラメーラー(MnおよびMw)を有するが、それは、より高い分子量値を有する魚属に由来するCSの分子量パラメーラーとは異なる。陸生のCSサンプルは1.0未満の電荷密度(CD)値によって特徴づけられるが、水生CSサンプルは常に1.0を超えるCD値を有する。この特性は、硫酸化された二糖の異なる分布による。一般的に、硫酸化された二糖は、陸生のCS中に微量で発見され、ポリ硫酸化された二糖(トリ−およびテトラ−硫酸塩)は天然のCS中では観察されない。
a)全ての存在するN−アセチルガラクトサミン(GalNAc)残基の6位を選択的に保護することによってCS 4Sを合成し、従って、全てのN−アセチルガラクトサミン(GalNAc)残基の4位でだけ選択的に硫酸化されたポリマーを得るステップ、
b)同様にして、好適には4位に存在するヒドロキシル残基を保護しながら、全てのGalNAc残基の6位のヒドロキシル基が硫酸化されたポリマーを得るステップ、
の可能性を開示し、権利を主張している。
本発明は、硫酸化されていないコンドロイチン主鎖(CH)から出発する化学硫酸化に続くCSの生産法を記載し、このCHは、特許出願MI2010A001300およびMI2010A001264に記載のように、天然の微生物の多糖i.l.(K4)の酸加水分解によって得られ、またはE.coli株DSM23644等の遺伝子操作を行ったE.coliから直接、生産される。本明細書に記載の菌株は、K4のフルクトース化(fructosylation)用のKfoE遺伝子の不活性化を引き起こす突然変異体を保有する。
白血球、すなわち、人間の白血球エラスターゼによる炎症プロセスの間に生産されるタンパク質分解酵素を阻害する能力(Kostoulas G.ら、Biol Chem 378、1481、1997;Volpi N.Chem Biol Interact 105,157,1997;Ying QLら、Am J Physiol.272,L533,1997);人間の好中球におけるフリーラジカルによる抗走化性、食作用活性、リゾチーム遊離、および生体膜への損傷を阻害する能力(Matzner Y.ら、Thromb Haemost 52,134,1984;Ronca F,Palmieri Lら、Osteoarthritis Cartilage 6 Suppl A,14、1998)
等の特異的試験を用いた、起こりえる抗炎症活性について評価した。
a)全て、またはほとんど全てのGalNAc残基が、6位または4位でモノ硫酸化される;
b)使用される合成条件に応じて、4Sおよび6S残基比(4S/6S)は完全に、陸生生物および魚起源の両方のCSで発見された4S/6Sに類似する。
a)コンドロイチンナトリウム塩の遊離酸への変換、または、代わりに、テトラメチル−、テトラエチル−、もしくはテトラブチル−アンモニウム等の第4級アンモニウムイオン、またはピリジンを有するその塩への変換。好ましくは、テトラブチルアンモニウム(TBA)塩が使用される。
−6位、2’位および4’位のヒドロキシルがアシル化され、4位のヒドロキシルが自由であり、前記単位が式IIIaで表される構造を有する二糖単位;
−4位、2’位および4’位のヒドロキシルがアシル化され、6位のヒドロキシルが自由であり、前記単位が式IIIbで表される構造を有する二糖単位
が形成される。
多糖K4またはE.Coli株DSM23644の発酵により得られた多糖から出発し、上記の方法によって加水分解、精製、および乾燥の後に得られたCHナトリウム塩を、水性媒体中に溶解させる。完全な溶解後、溶液を、Amberjet 1200 H、Rohm and Haas等のカチオン交換樹脂、あるいは同等のもので充填されたカラムの中に導入される。
テトラブチルアンモニウム(TBA)塩等のコンドロイチンから得られた塩を、フラスコ中でジメチルホルムアミド(DMF)とそれぞれ、5.2gおよび130mlの量で混合する。8.49gのトリメチルオルト酢酸をフラスコ中に滴下し、次いで、300mgのカンファースルホン酸を添加し、反応混合物を70℃で72時間、維持する。次いで、反応物は真空下で蒸発乾固され、更に40℃で20時間、温室乾燥され(stove-dried)、固体の形態の6.1gのコンドロイチン−MOE TBAを得る。
環状メチルオルトエステル(CH−cMOE)(4.79g)として保護された、先行するステップから生じるコンドロイチンが、23.95mlのアセトニトリル、15.69mlのトリエチルアミン(TEA)、6.21mlの無水酢酸、および78.96mgの4−ジメチルアミノピリジン(DMAP)を有する反応フラスコに導入される。25〜26℃での2時間の攪拌後、94mlのジ−イソプロピルエーテルが添加され、粘着性の固体が得られ、その固体は次いで濾紙を通して濾過され、真空下、45℃で24時間、温室乾燥される。このように得られた環状オルトエステル中間体は、ピンクの固体の外観を有する。
先行するステップから得られた中間体(2.42g)は、反応フラスコ中に導入され、反応フラスコには、18.8mlの96%酢酸および2.35mlの脱塩水が添加される。100mlの0.6M NaCl溶液を添加後、混合物を室温で38時間、攪拌し、混合物を5kDaの膜を通して限外濾過し、透析してpH3.32の保持液を回収する。
先行するステップから得られた2.42gの環状オルトエステル中間体を、14.52mlの96%酢酸、および9.8mlの脱塩水を有する反応フラスコ中に導入し、17.5時間、60℃まで加熱し、次いで、100mlの0.6MのNaClを添加し、溶液(pH2.27)を限外濾過し、透析してpH3.56の保持液を回収する。
実施例4に記載のようにして得られた中間体(0.76g)を、46.0mlのDMFを有するフラスコ中に導入し、混合物を30℃で10分間、攪拌する。0.72gの三酸化硫黄ピリジニウムを添加し、出発物質が溶解した時(約10分)、30℃で1時間、攪拌のもとで溶液を残す。次いで、更に0.72gの三酸化硫黄ピリジニウムを添加し、続いて、更に0.72gの三酸化硫黄ピリジニウムを添加する。溶液を更に1時間、30℃で攪拌する。
−コンドロチナーゼABCを用いた95%を超える消化率;
−18/82の4S/6S比;
−約0.9の全電荷密度値;
−本発明の特徴である、4−硫酸化単位および6−硫酸化単位の両方の同一の多糖鎖上での存在に起因するオリゴ糖の存在によって示される、コンドロチナーゼCを用いた最適な(only)部分消化率
を示す。
実施例5に記載のようにして得られた中間体(1.12g)を、67.2mlのDMFを有するフラスコ中に導入し、混合物を50℃で10分間、攪拌する。1.05gの三酸化硫黄ピリジニウムを添加し、出発物質が溶解した時(約10分)、50℃で1時間、攪拌のもとで溶液を残す。次いで、更に1.05gの三酸化硫黄ピリジニウムを添加する。溶液を更に1時間、50℃で攪拌する。
3リットルのフラスコ中で、室温で2時間、攪拌した1.3Lのメタノールおよび14.43gのアセチルクロライドの溶液に、酸の形態の10.0gのCHを添加し、得られた懸濁液を20時間、攪拌したままとする。
窒素を流しながら、塩化カルシウムバルブを有する500mlのフラスコ中に、150mlのジメチルホルムアミド(DMF)と先行するステップで得られた6.0gの生成物を導入する。次いで、20.06gのトリメチルオルト酢酸と0.71gのカンファースルホン酸を添加する。得られた溶液を50℃(内部温度)で18時間、加熱する。
窒素を流しながら、塩化カルシウムバルブを有する250mlのフラスコ中に、室温で、先行するステップで得られた8.0gの生成物、40mlのDMF、28.6gのトリエチルアミン、17.15gの無水酢酸、および96mgのジメチルアミノピリジンが導入される。
先行するステップで得られた7.0gの生成物、72.8gの氷酢酸、および8.7mlの水を、250mlのフラスコ中に導入して溶液を得て、溶液をRTで3時間、攪拌したままとする。次いで、溶液を0.6Mの塩化ナトリウム150mlで希釈し、得られた溶液を5kDaの膜を通した限外濾過により精製する。透析後、得られた溶液を真空下で濃縮して、6.7gの固体生成物を回収する。
窒素を流しながら、塩化カルシウムバルブを有し、40mlのDMFを有する250mlのフラスコ中に、先行するステップで得られた670mgの生成物が導入される。
0.2Mのソーダ33mlを有する、100mlのフラスコ中に、先行するステップで得られた生成物が導入される。溶液を40℃(内部温度)で2時間、加熱し、その後、RTまで冷却され、1MのHClで中性化される。
ジメチルホルムアミド(101ml)中で、上記のようにして得られた、コンドロイチンテトラブチルアンモニウム塩(4.07g;6.535ミリモル)の懸濁液を、攪拌し、窒素を流したまま室温(20〜25℃)に維持した。トリメチルオルト酢酸(9.03ml、71.89ミリモル)、およびカンファースルホン酸(1.82g;7.84ミリモル)を添加した。懸濁液を70℃(内部温度)まで加熱し、ほんの数分後に完全な溶解が観察された。反応は攪拌下、同じ温度で18〜20時間、維持された。次の日、真空下での蒸発によって溶媒を除去して反応物を濃縮し、鮮黄色の弾力のある残留物の形態の13.67gの生成物を得た。
コンドロイチンオルトエステル(3.00g)、水(3.14ml)、および酢酸(26.25g;437ミリモル)が、250mlの三つ口フラスコに導入された。得られた懸濁液を36時間、室温(20〜25℃)で加熱した。次いで、水が添加され、全体積が100mlの溶液を形成した。このように得られた溶液を、限外濾過した(5KDの膜)。捕集された保持液を透析して少量の体積(20ml)とし、次いで、真空下での蒸発による乾燥により所望の生成物(トリアセチルコンドロイチン)に対応する1.55gの固体残留物が得られるまで濃縮した。
体重が150〜190gの、40匹のオスのルイスラットを無作為に選び、10匹の動物ごとの4つのグループに分け、22±2℃の温度に維持された環境中でポリプロピレンのカゴの中で飼育し、水の利用を無制限として標準実験食を与えた。
1)未治療の健康な参照グループ
2)アジュバント−誘発関節炎(AA)に罹患した、未治療の参照グループ
3)AAの誘発後、28日間、体重kg当たり900mg/日の投与量で、LMW−CS BIOTECを経口で治療した関節炎ラットのグループ(実験の0〜28日)
4)AA(Articles of Association)の誘発前14日間とAAの誘発後28日間、体重kg当たり900mg/日の投与量で、LMW−CS BIOTECを経口で前治療したグループ(実験の−14日〜28日)。
測定に好適なカリパス(caliper)で後足の体積増加を観察することにより、関節炎の結果として発生した浮腫を測定した。測定は、AAの誘発前および研究の28日目に行われた。
酸化的ストレスは、LMW−CS BIOTECによる治療の最後にラットから採取された関節組織のホモジネート中のγ−グルタミントランスフェラーゼの活性を測定することによって評価した。γ−グルタミントランスフェラーゼは酸化的ストレスのマーカーであると考えられている。
実験の最後に、ラットから血液サンプルが採取され、抗凝固剤としてヘパリンを含む試験管中に入れられた;血漿は、遠心分離による血液細胞および炎症サイトカイン(IL−1、IL−6)からなる血球部から分離され、特定の市販のキットを用いたELISA技術を用いて分析された。
食細胞活性および酸化的破壊の評価の最後に、ラットの血液から好中球の集団を抽出した。フルオレセインでラベルしたオプソニン化したスタフィロコッカス・オーレアス(Staphylococus aureus)(SPA−FITC)(Invitrogen Molecular Probes、米国)を用いた制御した条件下で、食細胞、すなわち、細菌の摂取の測定を行った。次いで、リチウム−ヘパリン中の末梢血のアリコートを、ヒドロエチジン(hydroethidine)(Invitrogen molecular probes、米国)(5mlのジメチルホルムアミド中の15.75mg、メルク、ドイツ)を用いて37℃で15分間、培養した。37℃で15分間、SPA−FITCでの処理後、試験管を氷中に置くことによって反応を停止させた。続く赤血球の溶解は、冷塩化アンモニウム/塩化カリウム(200mlの脱イオン水、1.658gのNH4Cl、0.2gのKHCO3、および7.4mgのNa2EDTA、pH7.2〜7.4)からなる溶解溶液を用いて、15分間、行われた。食細胞の平均割合はSPA−FITCの少なくとも一つの粒子を摂取した顆粒球の割合を表し、呼吸バーストの平均割合はエチジウムでラベル化された顆粒球の割合を表す。
Claims (19)
- 同じ多糖鎖中の全てのN−アセチル−D−ガラクトサミン単位が、ランダムに、または4位もしくは6位でモノ硫酸化される、コンドロイチン硫酸ナトリウム塩の調製方法であって、
前記方法は以下のステップ
a.コンドロイチンナトリウム塩の、その遊離酸、またはテトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウムもしくはテトラブチルアンモニウムから選択された第4級アンモニウムカチオンとの塩、あるいは、ピリジニウム塩、またはメチルエステルへの変換ステップ;
b.酸触媒作用の存在中で、ステップa)で得られた化合物と、式RC(OR1)3のオルトエステル、ただし、Rは水素、メチル、エチルまたはフェニルから選択され、R1はメチルまたはエチルから選択される、とを反応させ、コンドロイチン中に存在する繰り返し二糖単位が式Iを含む化合物を与えるステップ
c.ピリジン、あるいはトリエチルアミンまたはトリイソプロピルアミンから選択された第三級有機塩基、ならびに4−ジメチルアミノピリジン(DMAP)の存在中での、式(R2CO)2Oの無水物、ただし、R2はメチル、エチルまたはプロピルから選択される、との反応によって、前のステップで得られた化合物のグルクロン酸単位の2’位および3’位でヒドロキシル基を保護して、コンドロイチン中に存在する繰り返し二糖単位が式IIを含む化合物を与えるステップ
d.水溶性有機酸を用いた、ステップc)で得られた生成物中に存在するオルトエステル官能基(functionality)の転位により、トリアシル誘導体からなる多糖中の繰り返しGalNAc単位が式IIIIaまたはIIIbを含むエステル誘導体を与えるステップ
e.ステップd)で得られた化合物をモノ硫酸化した後、前のステップで得られた化合物IIIaおよびIIIb中に存在するO−アシル基を除去するステップ、
を有する方法。 - ステップa)のコンドロイチンナトリウム塩は、E.coli株O5:K4:H4の培養ブロスによって生産された莢膜多糖K4、またはE.coli株DSM23644の培養ブロスによって生産された多糖、の何れかから出発して得られる、請求項1の方法。
- ステップb)は、トリメチルオルト酢酸、トリエチルオルト酢酸、トリメチルオルトギ酸、トリエチルオルトギ酸、トリメチルオルトプロピオン酸、トリエチルオルトプロピオン酸、またはトリメチルオルト安息香酸から選択されたオルトエステル、好ましくはトリメチルオルト酢酸、またはトリエチルオルト酢酸、より好ましくはトリメチルオルト酢酸を用いて行われる、請求項1の方法。
- ステップb)の酸触媒作用は、カンファースルホン酸、パラトルエンスルホン酸、メタンスルホン酸から選択される酸、またはスルホン樹脂、好ましくはカンファースルホン酸、またはスルホン樹脂、より好ましくはカンファースルホン酸を用いて行われる、請求項1の方法。
- ステップc)は、無水酢酸を用いて行われる、請求項1の方法。
- ステップd)は、20〜40℃、好ましくは室温で行われる、請求項1の方法。
- ステップd)は、40〜70℃、好ましくは60℃で行われる、請求項1の方法。
- ステップd)は、水/水溶性有機酸混合物中、または水中だけで行われる、請求項1の方法。
- 有機酸は、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、酒石酸、クエン酸、またはプロピオン酸樹脂、好ましくは酢酸、またはプロピオン酸、より好ましくは酢酸から選択される、請求項8の方法。
- 得られたコンドロイチン硫酸ナトリウム塩は、10〜30kDaの平均分子量(Mw)を有する、請求項1の方法。
- コンドロイチン硫酸ナトリウム塩は、90/10の4S/6Sから10/90の4S/6Sまでの範囲の比のモノ硫酸基の分布を有する、請求項10の方法。
- 得られたコンドロイチン硫酸ナトリウム塩中の、4位および6位における硫酸化N−アセチル−D−ガラクトサミン単位間の比が、1未満である、請求項1の方法。
- 得られたコンドロイチン硫酸ナトリウム塩中の、4位および6位における硫酸化N−アセチル−D−ガラクトサミン単位間の比が、1を超える、請求項1の方法。
- 請求項1の方法により得られたコンドロイチン硫酸ナトリウム塩。
- 同じ多糖鎖中の全てのN−アセチル−D−ガラクトサミン単位が、ランダムに、または4位もしくは6位でモノ硫酸化されたバイオテクノロジー源からなり4000〜9000ダルトンの平均分子量を有する、コンドロイチン硫酸。
- 90/10の4S/6Sから10/90の4S/6Sまでの範囲の比のモノ硫酸基の分布を有する、請求項15のコンドロイチン硫酸。
- 骨関節炎の予防および治療での、ならびに/または筋骨格系の健康維持のための、請求項14〜16のコンドロイチン硫酸の使用。
- 請求項14〜16に記載のコンドロイチン硫酸、および1以上の薬理学的もしくは栄養補助的に許容できる添加剤を含む組成物。
- 骨関節炎の予防および治療での、ならびに/または筋骨格系の健康維持のために使用するための、請求項18に記載の組成物。
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