IT202000013633A1 - Processo di estrazione di una condroitina solfato da un fungo, una condroitina solfato di origine vegetale e suo uso - Google Patents
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Classifications
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Description
DESCRIZIONE dell?invenzione avente per titolo:
?Processo di estrazione di una condroitina solfato da un fungo, una condroitina solfato di origine vegetale e suo uso?
La presente invenzione si riferisce a una miscela che comprende oppure, alternativamente, consiste di almeno un glicosamminoglicano, ottenuto da un materiale di partenza vegetale, scelto dal gruppo comprendente oppure, alternativamente, consistente di acido ialuronico o un suo sale (un sale dell?anione ialuronato) (in breve, assieme o separati, HA), e/o condroitina o un suo sale come una condroitina solfato o un suo sale (in breve, assieme o separati, CS), di origine vegetale ad elevato grado di purezza e ridotto contenuto di contaminanti e/o sottoprodotti.
Inoltre, la presente invenzione si riferisce a un uso della suddetta miscela come additivo, eccipiente, o ingrediente nella preparazione di prodotti farmaceutici, dispositivi medici, prodotti nutraceutici, alimenti a fini medici speciali (AFMS), prodotti alimentari o integratori alimentari.
Inoltre, la presente invenzione si riferisce a una composizione comprendente (i) detta miscela comprendente oppure, alternativamente, consistente di acido ialuronico o un suo sale (un sale dell?anione ialuronato) (in breve, assieme o separati, HA), e/o condroitina o un suo sale, come una condroitina solfato o un suo sale, (in breve CS), di origine vegetale, e (ii) opzionalmente additivi tecnologici ed eccipienti di grado farmaceutico o alimentare.
Inoltre, la presente invenzione si riferisce a detta composizione comprendente detta miscela per uso come medicamento.
Inoltre, la presente invenzione si riferisce a detta composizione comprendente detta miscela per uso in un metodo di trattamento, preventivo o curativo, di esseri umani e animali aventi specifici disturbi o disordini o patologie, scelti/e tra artrite, osteoartrite, artrosi, dolore articolare, infiammazioni degli arti e delle articolazioni, reflusso gastroesofageo.
Altres?, la presente invenzione si riferisce a un processo per la preparazione di detta miscela, e di detta composizione comprendente detta miscela, che comprende oppure, alternativamente, consiste di acido ialuronico o un suo sale (un sale dell?anione ialuronato) (in breve, assieme o separati, HA), e/o una condroitina o un suo sale, come una condroitina solfato o un suo sale, (in breve CS) di origine vegetale.
La presente invenzione si riferisce, infine, all?uso di un fungo come materiale di partenza vegetale per preparare un acido ialuronico o un suo sale e/o una condroitina o un suo sale, come una condroitina solfato o un suo sale, di origine vegetale ad elevato grado di purezza e ridotto contenuto di contaminanti e/o sottoprodotti.
L?acido ialuronico ? un glicosamminoglicano (GAG) anionico non-solfato che ? distribuito in modo abbondante nei tessuti connettivi, epiteliali e neurali dei vertebrati. L?acido ialuronico svolge funzioni strutturali, reologiche e fisiologiche importanti.
Le creste dei galli e i cordoni ombelicali umani hanno concentrazioni di acido ialuronico molto elevate, rispettivamente di 7,500 mg/l e 4,100 mg/l. Per tale motivo, nei primi anni ?80, Endre A. Balazs e suoi collaboratori svilupparono una procedura per isolare e purificare acido ialuronico proprio dalle creste dei galli e dai cordoni ombelicali umani. Da allora, l?acido ialuronico ? stato prodotto dalle creste di gallo su scala industriale.
La condroitina solfato ? un GAG solfato che si compone di una catena di unit? alternate di zuccheri, N-acetilgalattosamina e acido glucuronico. Una catena di condroitina solfato pu? essere composta da centinaia di unit? di zuccheri, ciascuna delle quali pu? essere solfatata in posizioni e quantit? variabili. In virt? della propria elevata resistenza a compressione, la condroitina solfato ? un componente strutturale importante della cartilagine.
La condroitina solfato ha un?unit? ripetitiva (disaccaride) della seguente formula generale (I):
(I)
in cui almeno uno tra R2, R4 e R6 ? un gruppo solfito (SO3-). Nella condroitina mono-solfato uno solo dei gruppi R2, R4 oppure R6 ? un gruppo solfito. Le tre possibili condroitine mono-solfate sono quindi la 6-condroitina solfato (R2 = H; R4 = H; R6 = SO3-), la 4-condroitina solfato (R2 = H; R4 = SO3-; R6 = H) e la 2-condroitina solfato (R2 = SO3-; R4 = H; R6 = H).
La maggior parte della condroitina solfato ? ottenuta da estratti di cartilagini animali, principalmente da tessuti bovini e suini (ad esempio: trachea, orecchio e naso), ma possono essere usate anche altre sorgenti quali le cartilagini di squalo, di pesce e di volatile. Nonostante le numerose e indiscusse - in termini di efficacia - applicazioni mediche dell?acido ialuronico e della condroitina solfato nei mammiferi, in particolare negli esseri umani, i processi di preparazione mediante estrazione da precursori animali si trovano oggi di fronte a crescenti preoccupazioni e timori, anche di natura etica, religiosa e morale. Le maggiori preoccupazioni e timori derivano dall?uso di prodotti derivati da animali o di origine animale per la preparazione di un acido ialuronico o un suo sale e/o una condroitina o un suo sale, come una condroitina solfato, specialmente quando questi composti o sali vengono destinati per applicazioni nutrizionali, biomediche o farmaceutiche. Inoltre, la condroitina solfato e l?acido ialuronico estratti da fonti animali presentano alti pesi molecolari, mentre sarebbe vantaggioso avere a disposizione una condroitina solfato e/o un acido ialuronico a basso peso molecolare in quanto sono dotati di migliori propriet? di penetrazione transcutanea.
Nell?arte sono note condroitine solfato, non di origine animale, ottenute per inserimento di un gruppo solfato su una condroitina non-solfatata ottenuta da processi di fermentazione batterica.
Pertanto nel settore dei prodotti farmaceutici, dei dispositivi medici, dei prodotti nutraceutici, degli alimenti a fini medici speciali (AFMS), degli integratori alimentari o prodotti alimentari, ? sentita fortemente l?esigenza e la necessit? da parte degli operatori del mercato di poter disporre di un acido ialuronico o un suo sale e/o una condroitina o un suo sale, come una condroitina solfato, che siano preparati in modo alternativo agli esistenti e che siano fruibili da tutte le categorie di consumatori ivi inclusi i vegani, i vegetariani, i soggetti che soffrono di allergie e da tutti coloro a cui - per motivi religiosi o ideologici ? un accesso a prodotti o medicamenti contenenti acido ialuronico o un suo sale e/o una condroitina o un suo sale, ? attualmente precluso. Inoltre, ? sentita l?esigenza di produrre condroitina solfato e/o acido ialuronico di origine non animale con processi economicamente vantaggiosi rispetto a quanto noto nell?arte e di facile applicazione.
La Richiedente, dopo una lunga e intensa attivit? di ricerca e sviluppo, ha sviluppato una tecnologia e un processo di preparazione in grado di fornire una risposta adeguata ai limiti, agli inconvenienti e ai problemi esistenti.
Pertanto, forma oggetto della presente invenzione una miscela che comprende oppure, alternativamente, consiste di almeno un glicosamminoglicano ottenuto da un materiale di partenza vegetale e selezionato dal gruppo comprendente oppure, alternativamente, consistente di acido ialuronico o un suo sale (un sale dell?anione ialuronato) (in breve, assieme o separati, HA), e/o condroitina o un suo sale, come una condroitina solfato o un suo sale, (in breve, assieme o separati, CS), e loro combinazioni, di origine vegetale, avente le caratteristiche come definite nelle unite rivendicazioni.
Forma, inoltre, oggetto della presente invenzione un uso della suddetta miscela come additivo, eccipiente, o ingrediente nella preparazione di prodotti farmaceutici, dispositivi medici, prodotti nutraceutici, alimenti a fini medici speciali (AFMS), prodotti alimentari o integratori alimentari, detto uso avente le caratteristiche come definite nelle unite rivendicazioni.
Forma un altro oggetto della presente invenzione una composizione comprendente (i) detta miscela comprendente oppure, alternativamente, consistente di acido ialuronico o un suo sale (un sale dell?anione ialuronato) (in breve, assieme o separati, HA), e/o condroitina o un suo sale, come una condroitina solfato, (in breve CS) di origine vegetale, e (ii) opzionalmente additivi tecnologici ed eccipienti di grado farmaceutico o alimentare, avente le caratteristiche come definite nelle unite rivendicazioni.
Forma un altro oggetto della presente invenzione una miscela e almeno un additivo tecnologico o eccipiente, o una composizione per uso come medicamento (primo uso medico), avente le caratteristiche come definite nelle unite rivendicazioni.
Forma un altro oggetto della presente invenzione una miscela o una composizione comprendente detta miscela per uso in un metodo di trattamento, preventivo o curativo, di esseri umani o animali, aventi specifici disturbi o disordini o patologie, scelti/e tra artrite, osteoartrite, artrosi, dolore articolare, infiammazioni degli arti e delle articolazioni, reflusso gastroesofageo (secondo uso medico), detto uso avente le caratteristiche come definite nelle unite rivendicazioni.
Forma, inoltre, un altro oggetto della presente invenzione un processo per la preparazione di detta miscela, o di detta composizione comprendente detta miscela, che comprende oppure, alternativamente, consiste di acido ialuronico o un suo sale (un sale dell?anione ialuronato) (in breve, assieme o separati, HA), e/o una condroitina o un suo sale, come una condroitina solfato, (in breve CS) di origine vegetale, avente le caratteristiche come definite nelle unite rivendicazioni.
Forma, infine, oggetto della presente invenzione un uso di un fungo come materiale di partenza vegetale per preparare un acido ialuronico o un suo sale e/o una condroitina o un suo sale, come condroitina solfato o un suo sale, ad elevato grado di purezza e ridotto contenuto di contaminanti e/o sottoprodotti, avente le caratteristiche come definite nelle unite rivendicazioni.
Qui di seguito si descriveranno ora forme di realizzazione preferite della presente invenzione, con l?ausilio delle allegate tavole, in cui:
- le figure da 1 a 4 mostrano diagrammi di flusso del processo, oggetto della presente invenzione, in accordo a diverse forme di realizzazione (prima forma di realizzazione, P1);
- le figure 5 e 6 mostrano diagrammi di flusso del processo, oggetto della presente invenzione, in accordo alla seconda forma di realizzazione (P2);
- le figure 7 e 8 mostrano diagrammi di flusso del processo, oggetto della presente invenzione, in accordo alla terza forma di realizzazione (P3);
- le figure 9 e 10 illustrano due spettri HPLC per la determinazione di disaccaridi insaturi rispettivamente in un campione contenente HA e in un campione contenente CS.
Si precisa che, all?interno della presente descrizione, l?espressione ?HA? indica acido ialuronico o un suo sale, o un ialuronato, oppure combinazioni di questi. L?espressione ?CS? indica invece una condroitina, un sale di condroitina, preferibilmente una condroitina solfato o un suo sale, oppure loro miscele.
Si precisa che, in questa descrizione, le espressioni ?materiale di partenza vegetale? e ?materiale di partenza di origine vegetale? sono tra loro sinonimi, e sono pertanto impiegati in modo intercambiabile.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE
Forma oggetto della presente invenzione una miscela (m) comprendente oppure, alternativamente, consistente di almeno un glicosamminoglicano ottenuto da un materiale di partenza di origine vegetale. Detto materiale di origine vegetale ? selezionato dal gruppo comprendente oppure, alternativamente, consistente di uno o pi? funghi naturali.
Detto glicosamminoglicano ? selezionato dal gruppo comprendente oppure, alternativamente, consistente di: (a) un acido ialuronico o un suo sale, un anione ialuronato (in breve, HA);
(b) una condroitina o un suo sale, quale una condroitina solfato (in breve, CS) o un suo sale;
(c) una combinazione di (a) e (b).
Il materiale di partenza vegetale ? un fungo. Il fungo ? un fungo che cresce e si trova in natura, ad esempio si pu? trovare e raccogliere nei boschi, ma si pu? anche coltivare in serra.
Il fungo appartiene al sottoregno Dikarya, preferibilmente ? della divisione Basidiomycota.
Dikarya ? un sottodominio di funghi che comprende le divisioni Ascomycota e Basidiomycota. I basidiomiceti (Basidiomycota R.T. Moore, 1980) ? uno dei pi? grandi phyla che compongono il regno dei funghi.
In accordo con una forma di realizzazione, il materiale di partenza vegetale ? un fungo della specie Tremella fuciformis o detto materiale di partenza di origine vegetale comprende o, alternativamente, consiste di un fungo della specie Tremella fuciformis.
La Tremella fuciformis Berk. (1856) (nota anche come fungo della neve, o fungo dell?orecchio argento) ? un fungo originario delle zone tropicali e subtropicali, dove prospera sui tronchi morti delle latifoglie, e che viene anche coltivato per far fronte al consumo intensivo - soprattutto in Giappone e in Cina - in cucina e nella medicina tradizionale. La Tremella fuciformis produce corpi fruttiferi (basidiocarpi) gelatinosi, di colore bianco, simili a fronde.
L?impiego della Tremella fuciformis nella presente invenzione ? particolarmente vantaggioso in quanto, a partire da questo materiale di partenza vegetale, ? possibile, con la tecnologia di estrazione qui messa a punto (prima forma di realizzazione (P1), seconda forma di realizzazione (P2) e terza forma di realizzazione (P3)), produrre sia HA, sia CS completamente di origine vegetale (e a basso peso molecolare). I glicosamminoglicani HA e/o CS contenuti nella miscela (m) e ottenuti dal processo della presente invenzione hanno caratteristiche peculiari che li rendono particolarmente efficaci soprattutto in virt? del loro ridotto peso molecolare, rispetto a HA e/o CS ottenibili da cartilagini animali secondo la tecnica nota. Un basso peso molecolare consente di avere glicosamminoglicani HA e/o CS con migliorate propriet? di penetrazione transcutanea.
Pi? precisamente, l?acido ialuronico o il suo sale (ialuronato) ottenuto dal processo della presente invenzione (P1 e/o P2) ha un peso molecolare medio ponderale compreso da 10 kDa a 600 kDa, preferibilmente compreso da 100 kDa a 500 kDa, ancora pi? preferibilmente compreso da 200 kDa a 400 kDa o da 100 kDa a 300 kDa, ad esempio un peso molecolare medio ponderale di circa 50 kDa, 150 kDa, o 250 kDa, o 300 kDa, o 350 kDa, o 450 kDa, o 550 kDa. Preferibilmente, detto HA contiene una percentuale in peso di condroitina (preferibilmente di condroitina non-solfata) compresa da 0,01% a 5%, preferibilmente compresa da 0,1% a 3%, ancora pi? preferibilmente compresa da 0,5% a 2%, ad esempio 1% oppure 2%, rispetto al peso totale di detto HA estratto da fungo.
Secondo un aspetto vantaggioso della presente invenzione, l?HA che possiede un peso molecolare medio ponderale che ricade in tali intervalli presenta un potere di penetrazione transcutanea elevato in virt? delle dimensioni limitate della molecola.
La condroitina o il suo sale, come la condroitina solfato o il suo sale (CS) ottenuta dal processo della presente invenzione (P1 e/o P3) ha un peso molecolare medio ponderale compreso da 1 kDa a 50 kDa o da maggiore di 5 kDa a minore di 50 kDa, preferibilmente compreso da 3 kDa a 40 kDa, ancora pi? preferibilmente compreso da 5 kDa o maggiore di 5 kDa a 25 kDa o da maggiore di 5 kDa a 10 kDa, ad esempio un peso molecolare medio ponderale di circa 4 kDa, o 6 kDa, o 8 kDa, o 10 kDa, o 12 kDa, o 14 kDa, o 16 kDa, o 18 kDa, o 22 kDa, o 24 kDa.
Secondo un aspetto vantaggioso ulteriore della presente invenzione, anche la CS con un peso molecolare medio ponderale compreso negli intervalli qui menzionati si ? rivelata efficace in una riduzione del danno osseo da osteoartrosi del ginocchio e dell?anca.
La CS contenuta nella miscela (m) della presente invenzione comprende una condroitina solfato avente un peso molecolare medio ponderale compreso da 1 kDa
3
(1.000,00 Da=1x10 Da) a 50 kDa, preferibilmente compreso da 3 kDa a 40 kDa, ancora pi? preferibilmente compreso da 5 kDa a 25 kDa, ad esempio un peso molecolare medio ponderale di circa 4 kDa, o 6 kDa, o 8 kDa, o 10 kDa, o 12 kDa, o 14 kDa, o 16 kDa, o 18 kDa, o 22 kDa, o 24 kDa.
Preferibilmente, detta CS ha una densit? di carica compresa da 0,70 a 0,99 o da 0,70 a 1,50, preferibilmente compresa da 0,75 a 0,98 o da 0,75 a 1,20, ancor pi? preferibilmente compresa da 0,80 a 0,97, ad esempio 0,85, 0,87, 0,90, 0,92, 0,94, oppure 0,96. Pi? preferibilmente, detta CS (ottenuta dal processo P1 e/o P3) ha una percentuale in peso di 6-condroitina solfato compresa da 50% a 99,5%, pi? preferibilmente da 50% a 95%, preferibilmente compresa da 75% a 88%, ancora pi? preferibilmente compresa da 78% a 86%, ad esempio circa 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oppure 98%, rispetto al peso totale di detta CS (o rispetto al totale di disaccaridi contenuti nella condroitina solfato; % determinate, ad esempio, mediante HPLC).
Detta CS preferibilmente comprende, in aggiunta alla 6-condroitina solfato, condroitina non-solfata (condroitina non-solfatata).
Preferibilmente, la condroitina non-solfata ha una percentuale in peso compresa da 0,1% a 25%, preferibilmente da 0,5% a 20% o da 5% a 20%, pi? preferibilmente compresa da 7% a 15%, ancora pi? preferibilmente compresa da 8% a 13%, ad esempio circa 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5,5%, 6%, 8%, 9%, 10%, 11% oppure 12%, rispetto al peso totale di detta CS (o rispetto al totale di disaccaridi contenuti nella condroitina solfato; % determinate, ad esempio, mediante HPLC).
Detta CS preferibilmente comprende, in aggiunta alla 6-condroitina solfato e alla condroitina non-solfata, la 2,6-condroitina disolfato.
Preferibilmente, la 2,6-condroitina disolfato ha una percentuale in peso compresa da 0,1% a 10%, preferibilmente compresa da 0,2% a 8%, ancora pi? preferibilmente compresa da 0,3% a 5%, ad esempio circa 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4% oppure 4,5%, rispetto al peso totale di detta CS (o rispetto al totale di disaccaridi contenuti nella condroitina solfato; % determinate, ad esempio, mediante HPLC).
Detta CS preferibilmente comprende, in aggiunta alla 6-condroitina solfato, alla condroitina non-solfata e alla 2,6-condroitina disolfato, la 4-condroitina solfato (o rispetto al totale di disaccaridi contenuti nella condroitina solfato; % determinate, ad esempio, mediante HPLC).
Preferibilmente, la 4-condroitina solfato ha una percentuale in peso compresa da 0,01% a 5%, preferibilmente compresa da 0,05% a 3%, ancora pi? preferibilmente compresa da 0,1% a 1,5%, ad esempio circa 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% oppure 1%, rispetto al peso totale di detta CS (o rispetto al totale di disaccaridi contenuti nella condroitina solfato; % determinate, ad esempio, mediante HPLC).
Detta CS preferibilmente comprende, in aggiunta alla 6-condroitina solfato, alla condroitina non-solfata, alla 2,6-condroitina disolfato e alla 4-condroitina solfato, la 4,6-condroitina disolfato.
Preferibilmente, la 4,6-condroitina disolfato ha una percentuale in peso compresa da 0,01% a 5%, preferibilmente compresa da 0,05% a 3%, ancora pi? preferibilmente compresa da 0,1% a 1,5%, ad esempio circa 0,02%, 0,03%, 0,04% 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% oppure 1%, rispetto al peso totale di detta CS (o rispetto al totale di disaccaridi contenuti nella condroitina solfato; % determinate, ad esempio, mediante HPLC).
Detta CS preferibilmente comprende, in aggiunta alla 6-condroitina solfato, alla condroitina non-solfata, alla 2,6-condroitina disolfato, alla 4-condroitina solfato e alla 4,6-condroitina disolfato, la 2,4-condroitina disolfato (o rispetto al totale di disaccaridi contenuti nella condroitina solfato; % determinate, ad esempio, mediante HPLC).
Preferibilmente, la 2,4-condroitina disolfato ha una percentuale in peso compresa da 0,01% a 5%, preferibilmente compresa da 0,05% a 3%, ancora pi? preferibilmente compresa da 0,1% a 1,5%, ad esempio circa 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% oppure 1,0%, rispetto al peso totale di detta CS (o rispetto al totale di disaccaridi contenuti nella condroitina solfato; % determinate, ad esempio, mediante HPLC).
Detta CS preferibilmente comprende, in aggiunta alla 6-condroitina solfato, alla condroitina non-solfata, alla 2,6-condroitina disolfato, alla 4-condroitina solfato, alla 4,6-condroitina disolfato e alla 2,4-condroitina disolfato, acido ialuronico o ialuronato (preferibilmente non-solfato). Preferibilmente, detto HA ? presente in una percentuale in peso compresa da 0,01% a 5%, preferibilmente compresa da 0,05% a 3%, ancora pi? preferibilmente compresa da 0,1% a 1,5%, ad esempio 0,8% oppure 1,0%, rispetto al peso totale di detta CS.
In accordo con una forma di realizzazione, la CS contenuta nella miscela (m) e ottenuta dal processo della presente invenzione (P1 e/o P3) comprende:
- una 6-condroitina solfato in una percentuale in peso compresa da 50% a 99,5%, preferibilmente da 50% a 95?0,5%, pi? preferibilmente compresa da 75% a 88%, ancora pi? preferibilmente compresa da 78% a 86%;
- una condroitina non-solfata in una percentuale in peso compresa da 0,1% a 25%, preferibilmente da 0,5% a 20%, pi? preferibilmente compresa da 7% a 15%, ancora pi? preferibilmente compresa da 8% a 13%;
- una 2,6-condroitina disolfato in una percentuale in peso compresa da 0,1% a 10%, preferibilmente compresa da 0,2% a 8%, ancora pi? preferibilmente compresa da 0,3% a 5%; e, ulteriormente,
- una 4-condroitina solfato in una percentuale in peso compresa da 0,01% a 5%, preferibilmente compresa da 0,05% a 3%, ancora pi? preferibilmente compresa da 0,1% a 1,5%,
- una 4,6-condroitina disolfato in una percentuale in peso compresa da 0,01% a 5%, preferibilmente compresa da 0,05% a 3%, ancora pi? preferibilmente compresa da 0,1% a 1,5%, e
- una 2,4-condroitina disolfato ciascuna in una percentuale in peso compresa da 0,01% a 5%, preferibilmente compresa da 0,05% a 3%, ancora pi? preferibilmente compresa da 0,1% a 1,5%.
A titolo di esempio, la CS contenuta nella miscela (m) e ottenuta dal processo della presente invenzione ha una composizione CS.1, CS.2, CS.3, CS.4, CS.5 oppure una composizione CS.6, secondo la seguente Tabella 1 (i valori essendo espressi come percentuale in peso di ciascun componente rispetto al peso totale di detta CS.n con n=1-6).
Tabella 1
Forma oggetto della presente invenzione una composizione comprendente: (i) la suddetta miscela (m) comprendente oppure, alternativamente, consistente di (a) HA avente un peso molecolare medio ponderale compreso da 10 kDa a 600 kDa (preferibilmente compreso da 100 kDa a 500 kDa, ancora pi? preferibilmente compreso da 200 kDa a 400 kDa, o da 100 kDa a 300 kDa, ad esempio circa 150 kDa, o 250 kDa, o 300 kDa, o 350 kDa, o 450 kDa, o 550 kDa), e/o (b) CS avente un peso molecolare medio ponderale compreso da 1 kDa a 50 kDa o da maggiore di 5 kDa a minore di 50 kDa (preferibilmente compreso da 3 kDa a 40 kDa, ancora pi? preferibilmente compreso da 5 o maggiore di 5 kDa a 25 kDa, ad esempio circa 4 kDa, o 6 kDa, o 8 kDa, o 10 kDa o 12 kDa, o 14 kDa, o 16 kDa, o 18 kDa, o 22 kDa, o 24 kDa), e (ii) opzionalmente additivi tecnologici ed eccipienti di grado farmaceutico o alimentare.
Tale composizione pu? essere una composizione farmaceutica, una composizione per dispositivo medico (EU) 2017/745, una composizione con funzione nutraceutica, una composizione per alimento ai fini medici speciali (AFMS), una composizione per integratore alimentare, o una composizione per prodotto alimentare, o una composizione per Novel food (EU) 2015/2283.
Tale composizione ? utilizzabile come medicamento, oppure come composizione per uso nel trattamento, preventivo e/o curativo, di artrite, osteoartrite, artrosi, dolore articolare, infiammazioni degli arti e delle articolazioni, reflusso gastroesofageo.
Forma oggetto della presente invenzione una tecnologia e un processo per la preparazione di acido ialuronico o ialuronato (HA) (processo P1 e/o P2) e/o condroitina solfato o condroitina o un loro sale (CS) (processo P1 e/o P3), detto processo comprendente almeno una fase di estrazione di acido ialuronico o ialuronato e/o di condroitina solfato o condroitina da un materiale di partenza di origine vegetale, ad esempio un materiale di partenza di origine vegetale comprendente o, alternativamente, consistente di almeno un fungo naturale appartenente al sottoregno Dikarya, preferibilmente divisione Basidiomycota, pi? preferibilmente specie Tremella fuciformis.
I processi della presente invenzione (prima forma di realizzazione (P1), seconda forma di realizzazione (P2) e terza forma di realizzazione (P3)) non comprendono fasi di fermentazione e/o digestione con batteri, come ad esempio le fermentazioni batteriche riportate nei documenti brevettuali WO 2012/152872 A1 e EP 2852437 B1 per la preparazione di condroitina o condroitina solfato.
Diverse forme di realizzazione di tale processo sono esemplificate nei diagrammi di flusso delle figure da 1 a 8.
Secondo una prima forma di realizzazione (P1), il processo oggetto della presente invenzione comprende le seguenti fasi:
(i) identificazione di uno o pi? funghi naturali come materiale di partenza vegetale di un glicosamminoglicano; ad esempio uno o pi? funghi naturali in forma secca o essiccata, preferibilmente comprendente o, alternativamente, consistente di almeno un fungo appartenente al sottoregno Dikarya, preferibilmente divisione Basidiomycota, pi? preferibilmente specie Tremella fuciformis;
(ii) opzionalmente, realizzare una frantumazione o polverizzazione del materiale di partenza vegetale;
(iii) estrazione di detto glicosamminoglicano (HA o CS) dal materiale di partenza vegetale ottenuto dalla fase (i) oppure dalla fase (ii) con un solvente di estrazione, preferibilmente un solvente acquoso, ancora pi? preferibilmente acqua (ad esempio acqua distillata o bidistillata) a dare un estratto acquoso di detto glicosamminoglicano;
(iv) aggiunta di un solvente, preferibilmente etanolo, all?estratto acquoso ottenuto dalla fase (iii) a dare un prodotto liquido;
(v) eseguire una centrifugazione e/o una filtrazione del prodotto liquido ottenuto dalla fase (iv) a dare una fase liquida e un residuo solido;
(vi) effettuare una lavorazione della fase liquida ottenuta dalla centrifugazione e/o filtrazione della fase (v) tramite la seguente fase (vi.a), e/o lavorazione del residuo solido ottenuto dalla centrifugazione e/o filtrazione della fase (v) tramite le seguenti fasi (vi.b), (vi.c), (vi.d) e (vi.e):
(vi.a) essiccamento, preferibilmente concentrazione e essiccamento, della fase liquida ottenuta dalla fase (v) a dare l?acido ialuronico o il suo sale avente un peso molecolare medio ponderale compreso da 10 kDa a 600 kDa; e/o
(vi.b) recupero e purificazione del residuo solido ottenuto dalla fase (v) a dare condroitina o il suo sale (CS) avente un peso molecolare medio ponderale compreso da 1 kDa a 50 kDa;
(vi.c) trattamento della condroitina o del suo sale (CS) ottenuta/o dalla fase (vi.b) con una sorgente di acido solforico, preferibilmente selezionata dal gruppo comprendente oppure, alternativamente, consistente di acido solforico, un complesso zolfo-triossido piridina, un complesso zolfo-triossido dimetil-formammide e loro miscele, a dare un prodotto acidificato;
(vi.d) neutralizzazione del prodotto acidificato ottenuto dalla fase (vi.c) con un agente basico a dare un prodotto neutralizzato;
(vi.e) concentrazione e essiccamento del prodotto neutralizzato ottenuto dalla fase (vi.d) a dare condroitina solfato o un suo sale avente un peso molecolare medio ponderale compreso da 1 kDa a 50 kDa. Il materiale di partenza vegetale sottoposto a estrazione nella fase (iii) potrebbe essere integro (vale a dire un pezzo unico, ad esempio un fungo intero), oppure potrebbe essere materiale vegetale frantumato (a pezzetti o a scaglie) oppure polverizzato (in granuli, polvere o pellet) nella fase (ii).
I diagrammi di flusso di figura 1 e di figura 2 mostrano forme di realizzazione del processo oggetto della presente invenzione secondo la prima forma di realizzazione (P1) in cui il fungo naturale, o la pluralit? di essi, identificato/a nella fase (i) viene estratto nella fase (iii) oppure nelle fasi (iii.a) e (iii.b) a dare l?estratto acquoso.
I diagrammi di flusso di figura 3 e di figura 4 mostrano forme di realizzazione del processo oggetto della presente invenzione secondo la prima forma di realizzazione (P1) (processo realizzato secondo tecniche e apparecchiature note al tecnico del ramo) in cui il fungo naturale, o la pluralit? di essi, identificato/a nella fase (i) viene frantumato/a o polverizzato/a nella fase (ii). Successivamente, il fungo naturale, o la pluralit? di essi, frantumato/a o polverizzato/a nella fase (ii) viene estratto nella fase (iii) oppure nelle fasi (iii.a) e (iii.b) a dare l?estratto acquoso.
Nel caso in cui il materiale di partenza vegetale sia frantumato o polverizzato (secondo una tecnica e una apparecchiatura nota al tecnico del ramo) nella fase (ii), una distribuzione media delle dimensioni delle particelle di detto materiale di partenza vegetale ? preferibilmente compresa da 500 ?m a 2.500 ?m, pi? preferibilmente compresa da 800 ?m a 1.800 ?m, ancora pi? preferibilmente compresa da 900 ?m a 1.200 ?m.
In accordo con una forma di realizzazione, il materiale di partenza vegetale fornito nella fase (iii) (dalla fase (i) o (ii)) ? un materiale vegetale frantumato a pezzetti o scaglie, oppure polverizzato o in granuli o pellet.
Il materiale di partenza vegetale fornito nella fase (iii) (dalla fase (i) o (ii)) ? preferibilmente secco o essiccato, vale a dire ? un materiale di partenza vegetale contenente una quantit? in peso di acqua compresa da circa il 2% al 20%, preferibilmente compresa dal 5% a 15%, ancora pi? preferibilmente compresa dall?8% a 10%, rispetto al peso totale del materiale di partenza vegetale.
Nella fase (iii), il solvente di estrazione ? selezionato tra un solvente acquoso e acqua.
Il solvente acquoso (o soluzione acquosa) ? preferibilmente una miscela idroalcolica in cui l?alcool (ad esempio etanolo) ? presente in una percentuale in peso compresa da 0,1% a 50%, pi? preferibilmente compresa da 0,5% a 25%, ancora pi? preferibilmente compresa da 1% a 15%, rispetto al peso totale del solvente di estrazione, ad esempio in una percentuale in peso di circa 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5% 7,5%, 10%, 20%.
L?acqua ? preferibilmente acqua distillata o bidistillata.
Nella fase (iii), il materiale di partenza vegetale viene caricato in continuo o in batch in un contenitore o apparecchiatura di estrazione munito ad esempio di mezzi meccanici di agitazione, mezzi di riscaldamento, mezzi di filtraggio e mezzi di controllo della temperatura e pressione.
Nella fase (iii), il materiale di partenza vegetale viene quindi estratto in detto contenitore o apparecchiatura di estrazione tramite il solvente di estrazione, in modo che l?acido ialuronico o il suo sale passi in soluzione nella fase liquida, all?interno dell?estratto acquoso, e in modo che la condroitina permanga nel residuo solido.
L?estrazione della fase (iii) viene condotta utilizzando un rapporto tra [peso del materiale di partenza vegetale] : [volume del solvente di estrazione] compreso da 1:1: a 1:90, preferibilmente compreso da 1:10 a 1:90, pi? preferibilmente compreso da 1:20 a 1:75, ancora pi? preferibilmente compreso da 1:40 a 1:60, ad esempio di 1:3, 1:5, 1:15, 1:25, 1:45, di 1:50 oppure di 1:55. L?estrazione della fase (iii) viene condotta in un tempo compreso da 1 minuto a 12 ore, preferibilmente da 10 minuti a 9 ore, ancor pi? preferibilmente da 15 minuti a 4 ore, ad esempio in circa 30 minuti, 45 minuti, 60 minuti, 90 minuti, 120 minuti, 150 minuti, o 180 minuti. La fase (iii) ? condotta, preferibilmente, a pressione atmosferica (P=1 Atm. a 20-25?C), e a una temperatura del solvente di estrazione compresa da 10?C a 90?C, preferibilmente compresa da 20?C a 60?C, ancor pi? preferibilmente da 35?C a 55?C, ad esempio di circa 25?C, 30?C, 40?C, 44?C, 48?C, oppure 50?C.
Preferibilmente, un valore di pH del solvente di estrazione nella fase (iii) ? compreso da 3 a 10, preferibilmente da 3,5 a 9, pi? preferibilmente da 4 a 8, ancora pi? preferibilmente compreso da 5 a 7, ad esempio ad un valore di pH di circa 4,5; 5,5; 6; 6,5; 7,5; 8,5; o 9,5.
Nell?estrazione della fase (iii) ? preferibilmente impiegato un enzima proteolitico per degradare le pectine superficiali del materiale di origine vegetale, e quindi aumentare la resa del processo.
Preferibilmente, l?enzima proteolitico comprende oppure, alternativamente, consiste di bromelina o estratto di bromelina.
La bromelina (o bromelaina) ? un estratto enzimatico del frutto e/o del gambo dell?ananas contenente enzimi proteolitici e altre sostanze in quantit? minori.
Al fine di aumentare la resa dell?estrazione, la fase (iii) ? preferibilmente condotta in due fasi, come di seguito descritto:
(iii.a) una prima estrazione dal materiale di partenza vegetale con un primo volume di solvente di estrazione a una temperatura compresa da 10?C a 90?C, preferibilmente compresa da 20?C a 60?C, ancor pi? preferibilmente compresa da 35?C a 55?C, per un tempo compreso da 1 minuto o 30 minuti a 12 ore, preferibilmente da 10 minuti a 9 ore, ancor pi? preferibilmente da 15 minuti a 4 ore, a dare un primo estratto acquoso; e
(iii.b) una seconda estrazione dal materiale di partenza vegetale (o da un residuo solido di detta fase (iii.a) di prima estrazione) con un secondo volume di solvente di estrazione a una temperatura compresa da 80?C a 120?C, preferibilmente compresa da 90?C a 110?C, preferibilmente compresa da 95?C a 105?C, ancor pi? preferibilmente compresa da 98?C a 102?C, preferibilmente sotto pressione o a pressione ridotta, per un tempo compreso da 10 minuti a 6 ore o da 30 minuti a 8 ore, preferibilmente da 20 minuti a 4 ore, ancor pi? preferibilmente da 40 minuti a 2 ore, ad esempio per un tempo di circa 30 minuti, 60 minuti, o 90 minuti, a dare un secondo estratto acquoso.
Preferibilmente, nella prima estrazione (iii.a) viene utilizzato un primo volume di solvente di estrazione compreso da 25 a 75 volte il peso del materiale di partenza vegetale, preferibilmente compreso da 35 a 65 volte, ancor pi? preferibilmente compreso da 45 a 55 volte, ad esempio circa 30 volte, o 50 volte.
Preferibilmente, nella seconda estrazione (iii.b) viene utilizzato un secondo volume di solvente di estrazione compreso da 10 a 150 volte, preferibilmente compreso da 75 a 125 volte il peso del materiale di partenza vegetale, pi? preferibilmente compreso da 85 a 115 volte, ancor pi? preferibilmente compreso da 95 a 105 volte, ad esempio circa 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 volte.
Secondo detta prima forma di realizzazione del processo di preparazione di HA e/o CS (P1), il primo estratto acquoso ottenuto dalla fase (iii.a) e il secondo estratto acquoso ottenuto dalla fase (iii.b) vengono quindi uniti, e ad essi viene aggiunto il solvente secondo la fase (iv).
Nella fase (iv), all?estratto acquoso ottenuto dalla fase (iii), oppure al primo estratto acquoso ottenuto dalla fase (iii.a) e al secondo estratto acquoso ottenuto dalla fase (iii.b), viene aggiunto il solvente, preferibilmente etanolo, a dare il prodotto liquido.
Nella fase (v), il prodotto liquido ottenuto dalla fase (iv) e il materiale di partenza vegetale presente (ad esempio come surnatante o come corpo di fondo) in tale prodotto vengono centrifugati, e/o vengono fatti transitare attraverso un mezzo filtrante (prima filtrazione) che trattiene la parte solida (un residuo solido), e che lascia transitare la fase liquida.
Nella fase (vi), successiva alla fase (v), la fase liquida ottenuta dalla centrifugazione e/o filtrazione viene lavorata tramite la fase (vi.a), e/o il residuo solido viene lavorato tramite le fasi (vi.b), (vi.c), (vi.d) e (vi.e).
Nella fase preferita (vi.a), la fase liquida ottenuta dalla fase (v) viene essiccata, opzionalmente concentrata e essiccata, a dare l?acido ialuronico o il suo sale avente un peso molecolare medio ponderale compreso da 10 kDa a 600 kDa.
La fase liquida da essiccare, preferibilmente da concentrare e essiccare, nella fase (vi.a) deve essere preferibilmente priva di sedimenti, quando lasciata raffreddare a 20-25?C. Pertanto, in presenza di sedimenti, la fase liquida ottenuta dalla fase (v) viene ulteriormente centrifugata e/o filtrata prima della fase (vi.a).
La concentrazione della fase liquida centrifugata e/o filtrata ? preferibilmente condotta a una temperatura compresa da 60?C a 90?C, pi? preferibilmente compresa da 65?C a 85?C, ancor pi? preferibilmente compresa da 70?C a 80?C, ad esempio a 70?C, a 75?C oppure a 80?C. La durata della fase di concentrazione ? dipendente, oltre che dalla temperatura, anche dalla quantit? desiderata delle sostanze disciolte nella fase liquida.
La concentrazione della fase liquida centrifugata e/o filtrata prevede preferibilmente un aumento di una quantit? di sostanze disciolte (tra cui l?HA) nella fase liquida fino a un intervallo compreso da 1 g a 35 g ogni 100 ml di fase liquida, preferibilmente compreso da 5 g a 25 g, ancor pi? preferibilmente compreso da 8 g a 18 g.
Preferibilmente, la fase liquida ottenuta dalla fase di concentrazione (vi.a) ha una densit? relativa (definita come rapporto tra [densit? della fase liquida centrifugata e/o filtrata] : [densit? della fase liquida al termine della concentrazione]) compresa da 1,01 a 1,20, preferibilmente compresa da 1,02 a 1,15, ancor pi? preferibilmente compresa da 1,05 a 1,08.
Preferibilmente la concentrazione della fase liquida viene eseguita a pressione ridotta (inferiore a 1 atm. a 25?C), pi? preferibilmente ad una pressione compresa da -1,5 mPa a -0,1 mPa, ancora pi? preferibilmente compresa da -1,0 mPa a -0,5 mPa, ad esempio a -0,8 mPa.
Preferibilmente, l?HA ottenuto dalla fase (vi.a) ha una purezza (% in peso rispetto al peso totale di HA) compresa dal 90% al 100%, preferibilmente compresa dal 95% al 99,5%, ancora pi? preferibilmente compresa dal 97% al 99% (% determinate, ad esempio, mediante HPLC).
Nelle fasi preferite (vi.b), (vi.c), (vi.d) e (vi.e), il residuo solido ottenuto dalla centrifugazione e/o filtrazione della fase (v) viene lavorato a dare condroitina solfato o un sale avente un peso molecolare medio ponderale compreso da 1 kDa a 50 kDa.
Nella fase preferita (vi.b), il residuo solido ottenuto dalla centrifugazione e/o dalla filtrazione della fase (v) viene recuperato e purificato a dare condroitina o suo sale (CS) avente un peso molecolare medio ponderale compreso da 1 kDa a 50 kDa.
Nella fase preferita (vi.c) (fase di solfonazione (o solfatazione), intesa quale fase di reazione in grado di inserire sul dimero della condroitina un gruppo solfato) successiva alla fase (vi.b), il residuo solido viene trattato con la sorgente di acido solforico (preferibilmente selezionata dal gruppo comprendente oppure, alternativamente, consistente di acido solforico, un complesso zolfo-triossido piridina, un complesso zolfo-triossido dimetil-formammide e loro miscele), a dare il prodotto acidificato (in cui detta fase di solfonazione ? eseguita secondo una tecnica e una apparecchiatura nota al tecnico del ramo).
La quantit? della sorgente di acido solforico utilizzata nella fase (vi.c) ? tale da ottenere una percentuale in peso di 6-condroitina solfato compresa dal 51% al 99%, o circa 95?0,5% (preferibilmente compresa da 78% a 85%, o 86%) rispetto al contenuto di disaccaridi totale della CS nel residuo solido della fase (vi.b).
Preferibilmente, nella fase (vi.c) vengono usati da 1 ml a 50 ml del complesso zolfo-triossido dimetil-formammide (SO3 DMF), preferibilmente da 2 ml a 40 ml, ancor pi? preferibilmente da 4 ml a 30 ml, per ogni 100 g della condroitina o del suo sale (CS) ottenuta/o dalla fase (vi.b), ad esempio 5 ml, 10 ml, 15 ml, 18 ml, 22 ml oppure 25 ml del complesso zolfo-triossido dimetilformammide ogni 100 g della condroitina o del suo sale (CS) ottenuta/o dalla fase (vi.b). Pi? preferibilmente, il complesso zolfo-triossido dimetil-formammide viene aggiunto alla condroitina o al suo sale (CS) ottenuta/o dalla fase (vi.b) in pi? fasi, ad esempio aggiungendo da 2 ml a 8 ml, poi aggiungendo da 8 ml a 12 ml, e infine aggiungendo ulteriormente da 8 ml a 12 ml del complesso zolfo-triossido dimetil-formammide.
Il trattamento della fase (vi.c) ? condotto per un tempo compreso da 1 minuto a 4 ore, preferibilmente compreso da 10 minuti a 2 ore, ancor pi? preferibilmente compreso da 20 minuti a 1 ora, ad una temperatura compresa da 20?C a 80?C, preferibilmente compresa da 30?C a 70?C, ancor pi? preferibilmente compresa da 40?C a 60?C. Nella fase (vi.d), il prodotto ottenuto dalla fase (vi.c) viene neutralizzato con un agente basico.
Pertanto, nella fase (vi.d) la sorgente di acido solforico ancora libera nel prodotto acidificato della fase (vi.c) (vale a dire la sorgente di acido solforico non legata alla condroitina come condroitina solfato nel prodotto acidificato) viene eliminata tramite neutralizzazione con l?agente basico a dare il prodotto neutralizzato.
Nella presente descrizione, con l?espressione ?neutralizzato/a? o ?neutralizzazione? si intende un raggiungimento di un valore di pH compreso da 6 a 8, preferibilmente compreso da 6,4 a 7,6, ancora pi? preferibilmente compreso da 6,6 a 7,4, ad esempio ad un valore di pH di 7,0?0,2.
L?agente basico utilizzato nella fase (vi.d) ? preferibilmente un agente basico inorganico.
L?agente basico ? preferibilmente selezionato dal gruppo comprendente oppure, alternativamente, consistente di: ammoniaca, idrossido di sodio, idrossido di potassio e loro miscele.
Preferibilmente, l?idrossido di sodio utilizzabile nella fase (vi.d) ? in una concentrazione 1 M, 2 M oppure 4 M. Nella fase preferita (vi.e), successiva alla fase (vi.d), il prodotto neutralizzato ottenuto dalla fase (vi.d) viene concentrato ed essiccato per ottenere la condroitina solfato avente un peso molecolare medio ponderale compreso da 1 kDa a 50 kDa
La concentrazione della fase (vi.e) prevede un raggiungimento di densit? relativa (definita come rapporto tra [densit? del prodotto neutralizzato ottenuto dalla fase (vi.d)] : [densit? del prodotto concentrato ottenuto dalla fase (vi.e)]) compreso da 1,0 a 1,30, preferibilmente compreso da 1,01 a 1,20, ancor pi? preferibilmente compreso da 1,05 a 1,15.
Preferibilmente, la concentrazione della fase (vi.e) viene condotta tramite dialisi e/o tramite concentrazione sottovuoto.
Pi? preferibilmente, la dialisi viene condotta tramite una sacca per dialisi, in modo da rimuovere piccole impurit? eventualmente presenti.
La fase di concentrazione (vi.e) ? preferibilmente conclusa quando il contenuto di solidi nel prodotto concentrato ottenuto dalla fase (vi.e) ? compreso da 10 g a 60 g ogni 100 ml, preferibilmente compreso da 20 g a 50 g ogni 100 ml, ancor pi? preferibilmente compreso da 35 g a 45 g ogni 100 ml, ad esempio 40 g / 100ml.
L?essiccazione della fase (vi.e) ? eseguita successivamente alla concentrazione della fase (vi.e), preferibilmente tramite un forno sottovuoto.
Forma oggetto della presente invenzione un uso di un materiale di partenza vegetale, preferibilmente un fungo, pi? preferibilmente del sottoregno Dikarya, ancora pi? preferibilmente della divisione Basidiomycota, ulteriormente preferibilmente della specie Tremella fuciformis, per preparare un acido ialuronico o un suo sale (HA), un sale dell?anione ialuronato, e/o una condroitina o un suo sale, come una condroitina solfato o un suo sale (CS).
Alle forme di realizzazione della miscela, dell?uso di detta miscela, della composizione comprendente detta miscela come additivo, o eccipiente, o ingrediente (o ingrediente non attivo), dell?uso della composizione come medicamento, dell?uso della composizione nel trattamento di specifici disturbi o disordini o patologie, del processo per la preparazione di detta miscela o di detta composizione comprendente detta miscela, dell?uso di detta composizione per uso come additivo, o eccipiente, o ingrediente, e del materiale di partenza vegetale suddetti, un tecnico del ramo potrebbe apportare sostituzioni o modifiche alle caratteristiche descritte a seconda delle contingenze. Anche tali forme di realizzazione sono da ritenersi ricomprese nell?ambito di tutela formalizzato nelle seguenti rivendicazioni.
Inoltre, si precisa che qualsiasi forma di realizzazione potr? essere implementata in modo indipendente dalle altre forme di realizzazione descritte.
Forme di realizzazione della presente invenzione (FRn) sono riportate di seguito:
FR1. Una miscela (M) comprendente oppure, alternativamente, consistente di almeno un glicosamminoglicano ottenuto da un materiale di partenza vegetale; detto glicosamminoglicano essendo selezionato dal gruppo comprendente oppure, alternativamente, consistente di:
(a) acido ialuronico o un suo sale, un anione ialuronato, (HA) avente un peso molecolare medio ponderale compreso da 10 kDa a 600 kDa;
(b) condroitina o un suo sale (CS) quale condroitina solfato, avente un peso molecolare medio ponderale compreso da 1 kDa a 50 kDa;
(c) una combinazione di (a) e (b).
FR2. La miscela (M) secondo la FR precedente, in cui: (a) l?acido ialuronico o il suo sale (HA) ha un peso molecolare medio ponderale compreso da 100 kDa a 500 kDa, preferibilmente compreso da 200 kDa a 400 kDa; e/o (b) la condroitina o il suo sale (CS) ha un peso molecolare medio ponderale compreso da 1 kDa a 50 kDa, preferibilmente compreso da 3 kDa a 40 kDa, ancora pi? preferibilmente compreso da 5 kDa a 25 kDa.
FR3. La miscela (M) secondo una qualsiasi delle FR precedenti, in cui detto materiale di partenza vegetale ? un fungo, preferibilmente del sottoregno Dikarya, ancora pi? preferibilmente della divisione Basidiomycota.
FR4. La miscela (M) secondo la FR precedente, in cui il fungo ? della specie Tremella fuciformis.
FR5. Uso della miscela (M) secondo una qualsiasi delle FR precedenti, come additivo, eccipiente, o ingrediente nella preparazione di prodotti farmaceutici, di dispositivi medici, di prodotti nutraceutici, di alimenti a fini medici speciali (AFMS), di integratori alimentari o di prodotti alimentari.
FR6. Una composizione comprendente: (i) la miscela secondo una qualsiasi delle FR1-4, e (ii) additivi tecnologici o eccipienti di grado farmaceutico o alimentare.
FR7. La composizione secondo la FR precedente, per uso come medicamento.
FR8. La composizione secondo la FR6, per uso nel trattamento, preventivo o curativo, di esseri umani o animali, aventi specifici disturbi o disordini o patologie, scelti/e tra artrite, osteoartrite, artrosi, dolore articolare, infiammazioni degli arti e delle articolazioni, oppure reflusso gastroesofageo, e/o per uso come additivo, o eccipiente, o ingrediente nella preparazione di prodotti farmaceutici, prodotti per dispositivi medici, prodotti nutraceutici, alimenti a fini medici speciali (AFMS), prodotti alimentari o integratori alimentari.
FR9. Un processo per la preparazione di acido ialuronico o ialuronato (HA), e/o condroitina solfato o condroitina (CS), detto processo comprendente almeno una fase di estrazione di acido ialuronico o ialuronato, e/o di condroitina solfato o condroitina, da un materiale di partenza di origine vegetale.
FR10. Il processo secondo la FR precedente, comprendente le seguenti fasi:
(i) identificazione di uno o pi? funghi naturali come materiale di partenza vegetale di un glicosamminoglicano;
(ii) opzionalmente realizzare una frantumazione o polverizzazione del materiale di partenza vegetale;
(iii) estrazione di detto glicosamminoglicano dal materiale di partenza vegetale ottenuto dalla fase (i) oppure dalla fase (ii) con un solvente di estrazione, preferibilmente un solvente acquoso, ancora pi? preferibilmente acqua a dare un estratto acquoso di detto glicosamminoglicano;
(iv) aggiunta di un solvente, preferibilmente etanolo, all?estratto acquoso ottenuto dalla fase (iii) a dare un prodotto liquido;
(v) centrifugazione e/o filtrazione del prodotto liquido ottenuto dalla fase (iv) a dare una fase liquida e un residuo solido;
(vi) lavorazione della fase liquida ottenuta dalla centrifugazione e/o filtrazione della fase (v) tramite la seguente fase (vi.a), e/o lavorazione del residuo solido ottenuto dalla centrifugazione e/o filtrazione della fase (v) tramite le seguenti fasi (vi.b), (vi.c), (vi.d) e (vi.e):
(vi.a) essiccamento, preferibilmente concentrazione e essiccamento, della fase liquida ottenuta dalla fase (v) a dare l?acido ialuronico o il suo sale avente un peso molecolare medio ponderale compreso da 10 kDa a 600 kDa; e/o
(vi.b) recupero e purificazione del residuo solido ottenuto dalla fase (v) a dare condroitina o il suo sale (CS) avente un peso molecolare medio ponderale compreso da 1 kDa a 50 kDa;
(vi.c) trattamento della condroitina o del suo sale (CS) ottenuta/o dalla fase (vi.b) con una sorgente di acido solforico, preferibilmente selezionata dal gruppo comprendente oppure, alternativamente, consistente di acido solforico, un complesso zolfo-triossido piridina, un complesso zolfo-triossido dimetil-formammide e loro miscele, a dare un prodotto acidificato;
(vi.d) neutralizzazione del prodotto acidificato ottenuto dalla fase (vi.c) con un agente basico a dare un prodotto neutralizzato;
(vi.e) concentrazione e essiccamento del prodotto neutralizzato ottenuto dalla fase (vi.d) a dare condroitina solfato avente un peso molecolare medio ponderale compreso da 1 kDa a 50 kDa.
FR11. Uso di un materiale di partenza vegetale, preferibilmente un fungo, pi? preferibilmente del sottoregno Dikarya, ancora pi? preferibilmente della divisione Basidiomycota, ulteriormente preferibilmente della specie Tremella fuciformis, per preparare un acido ialuronico o un suo sale, un sale dell?anione ialuronato, e/o una condroitina o un suo sale, come una condroitina solfato.
Una seconda forma di realizzazione del processo della presente invenzione (in breve, P2) si riferisce ad un processo per la preparazione di acido ialuronico o un suo sale (HA), il processo comprende o, alternativamente, consiste delle seguenti fasi:
(i) identificare uno o pi? funghi naturali come materiale di partenza vegetale di acido ialuronico; ad esempio uno o pi? funghi naturali in forma secca o essiccata, preferibilmente comprendente o, alternativamente, consistente di almeno un fungo appartenente al sottoregno Dikarya, preferibilmente divisione Basidiomycota, pi? preferibilmente specie Tremella fuciformis;
(ii) opzionalmente, realizzare una frantumazione o polverizzazione del materiale di partenza vegetale (distribuzione media delle dimensioni delle particelle preferibilmente compresa da 500 ?m a 1.800 ?m, preferibilmente da 700 ?m a 1.000 ?m, ad esempio circa 20 mesh = 841 ?m);
(pre-iii) realizzare una idrolisi enzimatica del materiale di partenza vegetale ottenuto dalla fase (i) oppure dalla fase (ii) in un solvente di idrolisi acquoso, preferibilmente acqua, a una temperatura compresa da 10?C a 90?C in cui al materiale di partenza vegetale disperso in un volume di solvente di idrolisi ? aggiunto un enzima, preferibilmente un enzima proteolitico, a dare una miscela di fase (pre-iii);
(iii) estrarre detta miscela di fase (pre-iii) con un solvente di estrazione acquoso, preferibilmente acqua, a una temperatura compresa da 91?C a 110?C, preferibilmente compresa da 95?C a 110?C, ancor pi? preferibilmente da 98?C a 105?C (ad esempio circa 100?C o temperatura di ebollizione del solvente di estrazione), a dare un estratto acquoso;
(iv) aggiungere un solvente di precipitazione (precipitazione mediante aggiunta di un solvente), preferibilmente un solvente alcolico, pi? preferibilmente etanolo, all?estratto acquoso ottenuto dalla fase (iii) a dare un prodotto liquido di fase (iv); preferibilmente, precipitare con etanolo mediante aggiunta lenta di etanolo al 95% in detto estratto acquoso ottenuto dalla fase (iii) in un rapporto volume/volume compreso da 2 a 4, preferibilmente 3, e mantenere in agitazione in un tempo compreso da 8 ore a 16 ore, ad esempio circa 12 ore;
(vii) lavorare detto prodotto liquido di fase (iv) applicando la fase (vii.a) e, opzionalmente, la fase (vii.b):
(vii.a) rimuovere detto solvente di precipitazione (ad esempio per distillazione o per riscaldamento ad un valore di pressione inferiore alla pressione ambiente), preferibilmente etanolo, a ottenere un prodotto liquido di fase (vii.a);
(vii.b) aggiungere acqua a detto prodotto liquido di fase (vii.a) (ad esempio per dissolvere prodotti solidi) a ottenere un prodotto liquido di fase (vii.b);
(viii) essiccare detto prodotto liquido di fase (vii.b), preferibilmente concentrare e/o essiccare (ad esempio rimuovere acqua e l?eventuale solvente di precipitazione residuo (e.g. etanolo) mediante concentrazione e/o essiccamento e/o liofilizzazione, preferibilmente liofilizzazione) a dare un prodotto PR1 comprendente o, alternativamente, consistente di acido ialuronico o un suo sale avente un peso molecolare medio ponderale compreso da 10 kDa a 600 kDa, preferibilmente da 50 kDa a 350 kDa, pi? preferibilmente da 100 kDa a 300 kDa, e una purezza compresa da 85% a circa 100% rispetto al peso totale di detto prodotto PR1, preferibilmente compresa da 95% a 99,5%, ancora pi? preferibilmente compresa da 97% a 99% (% determinate, ad esempio, mediante HPLC).
Una terza forma di realizzazione del processo della presente invenzione (in breve, P3) si riferisce ad un processo per la preparazione di condroitina solfato, preferibilmente 6-condroitina solfato, il processo comprende o, alternativamente, consiste delle seguenti fasi:
(i) identificare uno o pi? funghi naturali come materiale di partenza vegetale di acido ialuronico; ad esempio uno o pi? funghi naturali in forma secca o essiccato, preferibilmente comprendente o, alternativamente, consistente di almeno un fungo appartenente al sottoregno Dikarya, preferibilmente divisione Basidiomycota, pi? preferibilmente specie Tremella fuciformis;
(ii) opzionalmente, realizzare una frantumazione o polverizzazione del materiale di partenza vegetale (distribuzione media delle dimensioni delle particelle preferibilmente compresa da 500 ?m a 1.800 ?m, preferibilmente da 700 ?m a 1.000 ?m, ad esempio circa 20 mesh = 841 ?m);
(pre-iii) realizzare una idrolisi enzimatica del materiale di partenza vegetale ottenuto dalla fase (i) oppure dalla fase (ii) in un solvente di idrolisi acquoso, preferibilmente acqua, a una temperatura compresa da 10?C a 90?C, in cui al materiale di partenza vegetale disperso in un volume di solvente di idrolisi ? aggiunto un enzima, preferibilmente un enzima proteolitico, a dare una miscela di fase (pre-iii);
(iii) estrarre detta miscela di fase (pre-iii) con un solvente di estrazione acquoso, preferibilmente acqua, a una temperatura compresa da 91?C a 110?C, preferibilmente compresa da 95?C a 110?C, ancor pi? preferibilmente da 98?C a 105?C (ad esempio circa 100?C o temperatura di ebollizione del solvente di estrazione), a dare un estratto acquoso;
(vi.c.) trattare con una fonte di acido solforico (fase di solfonazione) detto estratto acquoso a dare un prodotto liquido di fase (vi.c), in cui detta sorgente di acido solforico preferibilmente ? selezionata dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di acido solforico, un complesso zolfo-triossido piridina, un complesso zolfo-triossido dimetil-formammide e loro miscele; pi? preferibilmente il complesso zolfotriossido dimetil-formammide (SO3-DMS);
(vi.d) neutralizzare detto prodotto liquido di fase (vi.c) mediante aggiunta di una base a dare un prodotto neutralizzato, in cui detta base preferibilmente ? una base inorganica, pi? preferibilmente NaOH o KOH o Ca(OH)2 o Mg(OH)2, fino a pH neutro;
(vi.e) concentrare e essiccare detto prodotto neutralizzato ottenuto dalla fase (vi.d) a dare un prodotto PR2 comprendente o, alternativamente, consistente di condroitina solfato o un suo sale (in breve, CS), avente un peso molecolare medio ponderale compreso da 1 kDa a 45 kDa o 50 kDa (o da maggiore di 5 kDa a minore di 50 kDa), preferibilmente compreso da 3 kDa a 40 kDa, ancora pi? preferibilmente compreso da 5 kDa o maggiore di 5 kDa a 25 kDa o da 5 kDa o maggiore di 5 kDa a 10 kDa, ad esempio circa 5 kDa, o 6 kDa, o 7 kDa, o 8 kDa, o 9 kDa, o 10 kDa.
Con il termine ?condroitina solfato o un suo sale (in breve, CS)? ottenuta da detta terza forma di realizzazione del processo della presente invenzione (P3) viene inteso l?insieme di condroitina non-solfatata e condroitina mono-, di- e/o tri- solfatata nelle diverse posizioni possibili, preferibilmente prevalentemente 6-condroitina solfato.
Alternativamente, con il termine ?condroitina solfato o un suo sale (in breve, CS)? ottenuta da detta terza forma di realizzazione del processo della presente invenzione (P3) viene inteso l?insieme di condroitina mono-, di- e/o tri- solfatata nelle diverse posizioni possibili, preferibilmente prevalentemente 6-condroitina solfato.
Preferibilmente, detta condroitina solfato (CS) ottenuta da detta terza forma di realizzazione del processo della presente invenzione (P3) ha un peso molecolare medio ponderale negli intervalli descritti (preferibilmente da 5 kDa o maggiore di 5 kDa a 10 kDa, ad esempio circa 6 kDa, o 7 kDa, o 8 kDa, o 9 kDa), comprende 6-condroitina solfato in una percentuale in peso compresa da 51% a circa 95?0,5%, preferibilmente da 75% a 90%, ancora pi? preferibilmente da 78% a 86%, rispetto al peso totale di detta condroitina solfato (CS) (o rispetto al totale di disaccaridi contenuti nella condroitina solfato), e ha una purezza compresa da 80% a 99,99% (ad esempio, 94,5%, 94,6%,94,7%,94,8% o 94,9%) rispetto al peso totale del prodotto PR2 ottenuto dalla fase (vi.e), preferibilmente compresa da 85% a 98% (ad esempio, 86%, 87%, 88%, 89% o 89,5%), ancora pi? preferibilmente compresa da 90% a 94,9%, ad esempio 91%, 92%, 93% , 94%, o 94,5% (% determinate, ad esempio, mediante HPLC).
Ancora pi? preferibilmente, detta condroitina solfato (CS) ottenuta da detta terza forma di realizzazione del processo della presente invenzione (P3) ha un peso molecolare medio ponderale negli intervalli descritti (preferibilmente da 5 kDa o maggiore di 5 kDa a 10 kDa, ad esempio circa 6 kDa, o 7 kDa, o 8 kDa, o 9 kDa), comprende 6-condroitina solfato in una percentuale in peso compresa da 51% a circa 95?0,5%, (preferibilmente da 75% a 90%, pi? preferibilmente da 78% a 86%), e 4-condroitina solfato in una percentuale in peso compresa da 0,01% a circa 5%, (preferibilmente 0,05% a 3%, pi? preferibilmente da 0,1% a 1,5%) rispetto al peso totale di detta condroitina solfato (CS) (o rispetto al totale di disaccaridi contenuti nella condroitina solfato), e ha una purezza compresa da 80% a 99,99% rispetto al peso totale del prodotto PR2 ottenuto dalla fase (vi.e), preferibilmente compresa da 85% a 98% (ad esempio, 86%, 87%, 88% o 89%), pi? preferibilmente compresa da 90% a 95%, ad esempio 91%, 92%, 93%, 94% o 94,5% (% determinate, ad esempio, mediante HPLC).
Il peso molecolare medio ponderale di HA e/o CS pu? essere calcolato secondo metodi e strumenti comuni e noti al tecnico del ramo, ad esempio, mediante cromatografia ad esclusione dimensionale ad alte prestazioni (HPSEC); preferibilmente, il peso molecolare medio ponderale di HA e/o CS pu? essere determinato mediante HPSEC dotato di software specializzato integrato per cromatografia a permeazione di gel (GPC).
Nella fase (pre-iii) di idrolisi enzimatica, presente nella seconda e nella terza forma di realizzazione del processo della presente invenzione (P2 e P3), al materiale di partenza vegetale come descritto nella presente invenzione, in un volume di solvente di idrolisi (ad esempio un solvente acquoso o acqua compreso da 25 a 100 volte il peso del materiale di partenza vegetale, preferibilmente compreso da 35 a 75 volte, pi? preferibilmente compreso da 45 a 55 volte (ad esempio 50 volte), viene aggiunto l?enzima (ad esempio pectinasi e/o cellulasi e/o proteinasi) e scaldato a una temperatura compresa da 10?C a 90?C, preferibilmente da 20?C a 65?C, pi? preferibilmente da 45?C a 55?C (e.g. circa 50?C), per un tempo compreso da 0,5 ore a 12 ore, preferibilmente da 1 ora a 8 ore, ancor pi? preferibilmente da 2 ore a 6 ore (ad esempio circa 4 ore), a dare detta miscela di fase (pre-iii) da sottoporre alla fase di estrazione (iii) o alla fase di prima estrazione (iii.a) (come descritta nel seguito). Inoltre, vantaggiosamente, detta fase (pre-iii) di idrolisi enzimatica viene effettuata ad un valore di pH della soluzione di idrolisi enzimatica compreso da 2 a 9, preferibilmente da 3 a 5 o da 5 a 8, pi? preferibilmente da 3 a 4 (ad esempio 3,5) o da 6 a 7; e/o in detta fase (pre-iii) di idrolisi enzimatica viene utilizzata una quantit? di enzima (soluzione acquosa dell?enzima a 1%-20%, o 2%-10%, o 3%-6% peso/peso o peso/volume) in una percentuale in volume compresa da 0,001% a 1%, preferibilmente da 0,005% a 0,1%, pi? preferibilmente da 0,008% a 0,05% (ad esempio 0,01%), rispetto alla massa del materiale di partenza vegetale da estrarre (volume/massa) o, alternativamente, rispetto al volume della soluzione del materiale di partenza vegetale da estrarre nel solvente di idrolisi (volume/volume).
Secondo un esempio preferito, la fase (pre-iii) di idrolisi enzimatica avviene nelle seguenti condizioni (circa): volume 0,01%; temperatura 50?C; pH effettivo 3,5; durata 4 ore.
Detto enzima utilizzato nella fase (pre-iii) della seconda e/o terza forma di realizzazione (P2 e/o P3) pu? essere una pectinasi e/o cellulasi e/o proteinasi.
Esempi di enzimi utilizzabili nel processo della presente invenzione sono:
- prodotto commerciale Pectinex<? >Ultra Tropical, composizione: enzima: pectina liasi o pectinasi, conservanti: potassio sorbato, stabilizzanti: saccarosio, glicerolo, sorbitolo, sodio cloruro, potassio cloruro; attivit? composto: pectina liasi o pectinasi (PECTU) = 5.000 PECTU/g; densit? approssimata 1,18 (g/ml); la pectina liasi ? un enzima che catalizza la scissione eliminativa di (1,4)-alfa-D-galatturonano estere metilico che d? oligosaccaridi con gruppi 4-desossi-6-O-metil-alfa-D-galatto-4-enuronosile alle loro estremit? non riducenti; altre attivit?: cellulasi, poligalatturonasi, beta-glucanasi (endo-1,3(4)-).
- prodotto commerciale Pectinex<? >Ultra SP-L, composizione % p/p: 45% di glicerolo (CAS no. 56-81-5), 45% di acqua (CAS no. 7732-18-5), 5% di poligalatturonasi (CAS no.
9032-75-1; definito come concentrazione di enzima (su base secca)), 5% di potassio cloruro (CAS no. 7447-40-7); attivit? composto: poligalatturonasi (PGNU) = 3300 PGNU/g; densit? approssimata 1,17 (g/ml); poligalatturonasi ? un enzima che idrolizza legami (1,4)-alfa-D-galattosiduronici in pectato e altri galatturonani.
- prodotto commerciale Viscozyme <?>, composizione % p/p: 56,8% di acqua (CAS no. 7732-18-5), 9% di beta-glucanasi (endo-1,3(4)-) (CAS no. 62213-14-3; definito come concentrazione di enzima (su base secca)), 24% di saccarosio (CAS no. 57-50-1), 10% di sodio cloruro (CAS no. 7647-14-5), 0,20% di potassio sorbato (CAS no.
24634-61-5); attivit? composto: beta-glucanasi (endo-1,3(4)-) (FGB) = 100 FBG/g; densit? approssimata 1,21 (g/ml); endo-beta-glucanasi ? un enzima che idrolizza legami (1,3)- o (1,4)- in beta-D-glucani, altre attivit?: xilanasi, cellulasi, hemicellulasi.
Nella seconda e terza forma di realizzazione del processo della presente invenzione (P2 e/o P3), la fase (iii) di estrazione preferibilmente comprende o, alternativamente, consiste delle fasi (iii.a) di prima estrazione comprendente o, alternativamente, consistente di estrarre con un primo volume di solvente di estrazione a una temperatura compresa da 91?C a 110?C (ad esempio circa 100?C) o una temperatura di ebollizione del solvente di estrazione per un tempo compreso da 0,5 ore a 12 ore, preferibilmente da 1 ora a 9 ore, pi? preferibilmente da 1 ora a 4 ore (ad esempio circa 2 ore o 3 ore), a dare un primo estratto acquoso; seguita dalla fase (iii.b) di seconda estrazione comprendente o, alternativamente, consistente di estrarre con un secondo volume di solvente di estrazione a una temperatura compresa da 90?C a 110?C (ad esempio circa 100?C) o temperatura di ebollizione del solvente di estrazione per un tempo compreso da 0,5 ore a 8 ore, preferibilmente da 0,5 ore a 4 ore, pi? preferibilmente da 1 ora a 3 ore (ad esempio 1,5 ore, o 2 ore, o 2,5 ore), a dare un secondo estratto acquoso; detto primo estratto e detto secondo estratto sono riuniti a dare un estratto acquoso finale; e, opzionalmente, segue una fase (iii.c) di concentrare detto estratto acquoso finale a dare un estratto acquoso concentrato.
Nella seconda e terza forma di realizzazione del processo della presente invenzione (P2 e P3), preferibilmente, nella prima estrazione (iii.a) viene utilizzato un primo volume di solvente di estrazione compreso da 25 a 100 volte il peso del materiale di partenza vegetale, preferibilmente compreso da 35 a 65 volte, ancor pi? preferibilmente compreso da 45 a 55 volte, ad esempio 50 volte. Ad esempio, detto primo volume di estrazione compreso da 25 a 100 volte il peso del materiale di partenza vegetale si aggiunge al volume di solvente di idrolisi enzimatica, raggiungendo un volume totale di solvente compreso da 50 a 200 volte il peso del materiale vegetale (ad esempio circa 100 volte).
Nella seconda e terza forma di realizzazione del processo della presente invenzione (P2 e P3), preferibilmente, nella seconda estrazione (iii.b) viene utilizzato un secondo volume di solvente di estrazione compreso da 25 a 75 volte il peso del materiale di partenza vegetale, preferibilmente compreso da 35 a 65 volte, pi? preferibilmente compreso da 45 a 55 volte (ad esempio circa 50 volte).
Nella seconda e terza forma di realizzazione del processo della presente invenzione (P2 e P3), dopo la fase (iii.a) di prima estrazione viene eseguita una filtrazione di fase (iii.a): il filtrato corrisponde al primo estratto acquoso ottenuto dalla fase (iii.a) e il residuo viene sottoposto alla fase (iii.b) di seconda estrazione. Dopo la fase (iii.b) di seconda estrazione viene eseguita una filtrazione di fase (iii.b) e il filtrato corrisponde al secondo estratto acquoso ottenuto dalla fase (iii.b). Ad esempio, dette filtrazioni di fase (iii.a) e (iii.b) (o filtrazioni di fase di estrazione (iii)) sono effettuate con filtri da 140 a 270 mesh, preferibilmente 200 mesh. Opzionalmente, in detta seconda e terza forma di realizzazione (P2 e P3), il primo estratto acquoso ottenuto dalla fase (iii.a) e il secondo estratto acquoso ottenuto dalla fase (iii.b) vengono uniti e sottoposti alla fase (iii.c) di concentrare sottovuoto, ad esempio ad una temperatura compresa da 60?C a 90?C, preferibilmente da 70?C a 80?C, pi? preferibilmente a circa 75?C, fino ad una densit? relativa compresa circa da 0,8 a 1,5, preferibilmente da 1,00 a 1,20 (ad esempio circa 1,05-1,08).
Nella terza forma di realizzazione del processo della presente invenzione (P3), preferibilmente, nella fase (vi.c) (fase di solfonazione) vengono usati da 1 ml a 50 ml del complesso zolfo-triossido dimetil-formammide (SO3 DMF), preferibilmente da 2 ml a 40 ml, ancor pi? preferibilmente da 4 ml a 30 ml, per ogni 100 g di condroitina o di un suo sale (CS) ottenuta/o dalla fase (vi.b), ad esempio circa 5 ml, 10 ml, 15 ml, 18 ml, 22 ml, oppure 25 ml del complesso zolfo-triossido dimetilformammide ogni 100 g di condroitina o del suo sale (CS) ottenuta/o dalla fase (vi.b). Pi? preferibilmente, il complesso zolfo-triossido dimetil-formammide viene aggiunto alla condroitina o al suo sale (CS) ottenuta/o dalla fase (vi.b) in pi? fasi, ad esempio aggiungendo da 2 ml a 8 ml, poi aggiungendo da 8 ml a 12 ml, e infine aggiungendo ulteriormente da 8 ml a 12 ml del complesso zolfo-triossido dimetil-formammide. Il trattamento della fase (vi.c) ? condotto per un tempo compreso da 1 minuto a 4 ore, preferibilmente compreso da 10 minuti a 2 ore, ancor pi? preferibilmente compreso da 20 minuti a 60 minuti (ad esempio circa 30 minuti), ad una temperatura compresa da 20?C a 80?C, preferibilmente compresa da 30?C a 70?C, ancor pi? preferibilmente compresa da 40?C a 60?C (ad esempio circa 50?C). Secondo un esempio preferito, detta fase (vi.c.) di solfonazione viene eseguita addizionando a circa 100 ml di estratto acquoso derivante dalla fase (iii) o (iii.b) o (iii.c) (contenuto di solido 10-15g/100 ml e densit? relativa 1.05-1.08) SO3-DMF (5 ml, 15 ml, 25 ml) ad una temperatura compresa da 40?C a 60?C (ad esempio a 50?C) e per un tempo compreso da 20 minuti a 60 minuti (ad esempio 30 minuti).
Nella terza forma di realizzazione del processo della presente invenzione (P3), preferibilmente, l?agente basico utilizzato nella fase (vi.d) ? preferibilmente un agente basico inorganico selezionato dal gruppo comprendente oppure, alternativamente, consistente di: ammoniaca, idrossido di sodio, idrossido di potassio e loro miscele, preferibilmente idrossido di sodio (ad esempio, in una concentrazione 1 M, 2 M oppure 4 M).
Nella terza forma di realizzazione del processo della presente invenzione (P3), preferibilmente, detta fase (vi.e) comprende una filtrazione a membrana mediante dialisi, ad esempio mediante una borsa per dialisi 1.000 Da per un tempo compreso da 18 ore a 36 ore, preferibilmente 24 ore, fino al raggiungimento di una densit? relativa compresa da 1,3 a 1,5, preferibilmente circa 1,1; seguita da essiccamento, ad esempio in stufa sottovuoto.
Secondo un aspetto dell?invenzione, in detta prima e terza forma di realizzazione del processo della presente invenzione (P1 e P3), la condroitina solfato o un suo sale (CS) della presente invenzione ha un peso molecolare medio ponderale compreso da maggiore di 5 kDa a minore di 50 kDa, preferibilmente da maggiore di 5 kDa a 25 kDa, e comprende:
- una 6-condroitina solfato in una percentuale in peso compresa da 50% a 95?0,5%, preferibilmente da 75% a 90%; - una condroitina non-solfata in una percentuale in peso compresa da 5% a 20%, preferibilmente da 7% a 15%;
- una 2,6-condroitina disolfato in una percentuale in peso compresa da 0,1% a 10%, preferibilmente da 0,2% a 8%; e e
- una 4-condroitina solfato in una percentuale in peso compresa da 0,01% a 5%, preferibilmente da 0,05% a 3%, tutte le percentuali essendo espresse rispetto al totale di disaccaridi contenuti nella condroitina solfato o rispetto al peso totale della condroitina solfato.
Secondo un aspetto dell?invenzione preferito, la condroitina solfato o un suo sale (CS) della presente invenzione (processo P1 e/o P3) ha un peso molecolare medio ponderale da maggiore di 5 kDa a 10 kDa, e in cui detta condroitina solfato o il suo sale comprende:
- una 6-condroitina solfato in una percentuale in peso compresa da 78% a 86%;
- una condroitina non-solfata in una percentuale in peso compresa da 8% a 13%;
- una 2,6-condroitina disolfato in una percentuale in peso compresa da 0,3% a 5%; e
- una 4-condroitina solfato in una percentuale in peso compresa da 0,1% a 1,5%, tutte le percentuali essendo espresse rispetto al totale di disaccaridi contenuti nella condroitina solfato o rispetto al peso totale della condroitina solfato.
Secondo un ulteriore aspetto dell?invenzione preferito, la condroitina solfato o un suo sale (CS) della presente invenzione (processo P1 e/o P3) ha un peso molecolare medio ponderale compreso da maggiore di 5 kDa a minore di 50 kDa, preferibilmente da maggiore di 5 kDa a minore di 25 kDa, e in cui detta condroitina solfato o il suo sale comprende:
- una 6-condroitina solfato in una percentuale in peso compresa da 50% a 95?0,5%, preferibilmente da 75% a 90%; e
- una 4-condroitina solfato in una percentuale in peso compresa da 0,01% a 5%, preferibilmente da 0,05% a 3%, tutte le percentuali essendo espresse rispetto al totale di disaccaridi contenuti nella condroitina solfato o rispetto al peso totale della condroitina solfato.
Secondo un ulteriore aspetto dell?invenzione maggiormente preferito, la condroitina solfato o un suo sale (CS) della presente invenzione (processo P1 e/o P3) ha un peso molecolare medio ponderale compreso da maggiore di 5 kDa a 10 kDa, e in cui detta condroitina solfato o il suo sale comprende:
- una 6-condroitina solfato in una percentuale in peso compresa da 78% a 86%; e
- una 4-condroitina solfato in una percentuale in peso compresa da 0,1% a 1,5%, tutte le percentuali essendo espresse rispetto al totale di disaccaridi contenuti nella condroitina solfato o rispetto al peso totale della condroitina solfato.
Secondo un aspetto dell?invenzione, la condroitina solfato o un suo sale (CS) della presente invenzione (processo P1 e/o P3) ha un peso molecolare medio ponderale compreso da maggiore di 5 kDa a minore di 50 kDa, preferibilmente da maggiore di 5 kDa a minore di 25 kDa, e comprende:
- una 6-condroitina solfato in una percentuale in peso compresa da 50% a 95?0,5%, preferibilmente da 75% a 90%; - una condroitina non-solfata in una percentuale in peso compresa da 5% a 20%, preferibilmente da 7% a 15%;
- una 2,6-condroitina disolfato in una percentuale in peso compresa da 0,1% a 10%, preferibilmente da 0,2% a 8%;
- una 4-condroitina solfato in una percentuale in peso compresa da 0,01% a 5%, preferibilmente da 0,05% a 3%;
- una 4,6-condroitina disolfato in una percentuale in peso compresa da 0,01% a 5%, preferibilmente compresa da 0,05% a 3%; e
- una 2,4-condroitina disolfato in una percentuale in peso compresa da 0,01% a 5%, preferibilmente compresa da 0,05% a 3%, tutte le percentuali essendo espresse rispetto al totale di disaccaridi contenuti nella condroitina solfato o rispetto al peso totale della condroitina solfato.
In accordo con una forma di realizzazione, la condroitina solfato o un suo sale (CS) della presente invenzione (processo P1 e/o P3) ha un peso molecolare medio ponderale compreso da maggiore di 5 kDa a 10 kDa, e in cui detta condroitina solfato o il suo sale comprende:
- una 6-condroitina solfato in una percentuale in peso compresa da 78% a 86%;
- una condroitina non-solfata in una percentuale in peso compresa da 8% a 13%;
- una 2,6-condroitina disolfato in una percentuale in peso compresa da 0,3% a 5%; e, ulteriormente,
- una 4-condroitina solfato, 4,6-condroitina disolfato e 2,4-condroitina disolfato, ciascuna in una percentuale in peso compresa da 0,1% a 1,5%.
PARTE SPERIMENTALE
I. Processo per la preparazione di acido ialuronico secondo la seconda forma di realizzazione (P2).
(i) predisporre i funghi secchi appartenenti alla specie Tremella fuciformis,
(ii) frantumare o polverizzare detti funghi secchi (circa 20 mesh) mediante macinazione a dare funghi secchi frantumati/polverizzati;
(pre-iii) realizzare un?idrolisi enzimatica utilizzando quale enzima una pectinasi mediante aggiunta ai funghi secchi frantumati/polverizzati e a un enzima pectinasi (Pectinex<? >Ultra Tropical, volume 0,01%) di acqua distillata (50 volume/peso) e riscaldare a circa 50?C per circa 3 ore a dare una miscela di idrolisi;
(iii.a) realizzare una prima estrazione mediante una aggiunta di acqua distillata (50 volume/peso) a detta miscela di idrolisi e riscaldare a circa 100?C (ebollizione) per circa 2,5 ore, e filtrare con setaccio 200 mesh e raccogliere un filtrato e un residuo solido; (iii.b) realizzare una seconda estrazione eseguita su detto residuo solido ottenuto da detta prima estrazione (iii.a) mediante aggiunta di acqua distillata (50 volume/peso) e riscaldare a circa 100?C (ebollizione) per circa 2 ore, seguita da filtrare con setaccio 200 mesh e raccogliere un filtrato; e combinare il filtrato ottenuto da detta prima estrazione (iii.a) con il filtrato ottenuto da detta seconda estrazione (iii.b) a dare un estratto acquoso;
(iii.c) concentrare detto estratto acquoso a circa 75?C a dare un estratto acquoso concentrato avente una densit? relativa di circa 1,05; seguita da
(iv) aggiungere lentamente sotto agitazione a detto estratto acquoso concentrato etanolo al 95% (volume/volume = 3) e lasciare per 12 ore; rimuovere l?etanolo e tenere l?estratto;
(vii) aggiungere acqua distillata a detto estratto e liofilizzare, ottenendo un prodotto PR1 comprendente o, alternativamente, consistente di acido ialuronico o un suo sale (HA) avente peso molecolare medio compreso da 100 a 300 kDa e una purezza in percentuale in peso compresa da 95% a 99% rispetto al peso totale di detto prodotto PR1.
II. Processo per la preparazione di condroitina solfato secondo la terza forma di realizzazione (P3).
(i) predisporre funghi secchi appartenenti alla specie Tremella fuciformis;
(ii) frantumare o polverizzare dei funghi secchi (20 mesh) mediante macinazione a dare funghi secchi frantumati/polverizzati;
(pre-iii) realizzare un?idrolisi enzimatica utilizzando quale enzima una pectinasi mediante aggiunta ai funghi secchi frantumati/polverizzati e un enzima pectinasi (Pectinex<? >Ultra Tropical, volume 0,01%) di acqua distillata (50 volume/peso) e riscaldamento a circa 50?C per circa 2 ore a dare una miscela di idrolisi (pH da 5-7);
(iii.a) realizzare una prima estrazione mediante aggiunta alla miscela di idrolisi di acqua distillata (50 volume/peso) e riscaldamento a 100?C (ebollizione) per circa 2,5 ore, e seguita da filtrazione con setaccio 200 mesh (se necessario centrifugare prima di filtrare) e raccolta di un filtrato e di un residuo solido;
(iii.b) realizzare una seconda estrazione di detto residuo solido ottenuto da detta prima estrazione mediante aggiunta di acqua distillata (50 volume/peso) e riscaldamento a 100?C (ebollizione) per circa 1,5 ore, seguita da una filtrazione con un setaccio 200 mesh e raccolta di un filtrato; e combinare detto filtrato ottenuto da detta prima estrazione (iii.a) con detto filtrato ottenuto da detta seconda estrazione (iii.b) a dare un estratto acquoso;
(iii.c) concentrare detto estratto acquoso a circa 75?C a dare un estratto acquoso concentrato avente una densit? relativa di circa 1,05-1,08; seguita da (vi.c) realizzare una reazione di solfonazione (o solfatazione) aggiungendo SO3 DMF 5 ml, 15 ml, 55 ml, per ogni 100 ml di estratto acquoso concentrato, a circa 75?C per circa 30 minuti;
(vi.d) neutralizzare con NaOH fino a circa un valore di pH 7;
(vi.e) mettere la soluzione ottenuta in una sacca da dialisi (1.000 Da) per almeno 24 ore, fino al raggiungimento di una densit? relativa della soluzione di circa 1,1. Seccare in stufa sottovuoto ad ottenere un prodotto PR2 comprendente o, alternativamente, consistente di condroitina solfato o un suo sale (CS) avente un peso molecolare medio compreso da maggiore di 5 kDa a 10 kDa (ad esempio, circa 8 kDa), in cui detta CS ha una composizione analoga al composto CS.1 riportato in Tabella 1 e una purezza in percentuale in peso compresa da 89% a 94,5%, rispetto al peso totale di detto prodotto PR2.
Claims (11)
1. Un processo per la preparazione di una condroitina solfato o un suo sale, comprendente le seguenti fasi: (i) identificare un materiale di origine vegetale comprendente o, alternativamente, consistente di almeno un fungo naturale appartenente al sottoregno Dikarya, preferibilmente divisione Basidiomycota;
(ii) opzionalmente, realizzare una frantumazione o polverizzazione del materiale di partenza vegetale ad ottenere detto materiale di partenza di origine vegetale frantumato o polverizzato;
(pre-iii) realizzare una idrolisi enzimatica di detto materiale di partenza vegetale ottenuto dalla fase (i) oppure dalla fase (ii) in un solvente di idrolisi acquoso, preferibilmente acqua, a una temperatura compresa da 10?C a 90?C in cui al materiale di partenza vegetale disperso in un volume di solvente di idrolisi ? aggiunto un enzima, preferibilmente un enzima proteolitico, a dare una miscela di fase (pre-iii);
(iii) realizzare una estrazione di detto materiale di origine vegetale compreso in detta miscela di fase (preiii) con un solvente di estrazione acquoso, preferibilmente acqua, a una temperatura compresa da 91?C a 110?C o a una temperatura di ebollizione a dare un estratto acquoso;
(vi.c) trattare detto estratto acquoso ottenuto dalla fase (iii) con una fonte di acido solforico, preferibilmente selezionata dal gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di: acido solforico, un complesso zolfo-triossido piridina, un complesso zolfotriossido dimetil-formammide e loro miscele, pi? preferibilmente un complesso zolfo-triossido dimetilformammide, a dare un prodotto acidificato;
(vi.d) neutralizzare detto prodotto acidificato ottenuto dalla fase (vi.c) con un agente basico, preferibilmente sodio idrossido, a dare un prodotto neutralizzato;
(vi.e) concentrare e/o essiccare detto prodotto neutralizzato ottenuto dalla fase (vi.d) a dare un prodotto PR2 comprendente o, alternativamente, consistente di condroitina solfato o un suo sale avente un peso molecolare medio ponderale compreso da 1 kDa a 50 kDa.
2. Il processo secondo la rivendicazione 1, in cui detto almeno un fungo appartiene alla specie Tremella fuciformis (Berk. 1856).
3. Il processo secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui in detta fase (pre-iii) detto enzima ? selezionato nel gruppo comprendente o, alternativamente, consistente di: una pectinasi, una cellulasi, una proteinasi e una loro miscela.
4. Il processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, in cui la fase (iii) di estrazione comprende o, alternativamente, consiste delle seguenti fasi:
(iii.a) eseguire una prima estrazione di detto materiale di origine vegetale compreso in detta miscela di fase (pre-iii) con un primo volume di solvente di estrazione a una temperatura compresa da 91?C a 110?C o a una temperatura di ebollizione per un tempo compreso da 0,5 ore a 12 ore a dare un primo estratto acquoso e un residuo solido; seguita da
(iii.b) eseguire una seconda estrazione di detto residuo solido ottenuto nella fase (iii.a) con un secondo volume di solvente di estrazione a una temperatura compresa da 90?C a 110?C, per un tempo compreso da 0,5 ore a 8 ore, a dare un secondo estratto acquoso; e riunire detto primo estratto e detto secondo estratto a dare un secondo estratto acquoso; e, opzionalmente,
(iii.c) concentrare detti primo estratto acquoso e secondo estratto acquoso a dare un estratto acquoso concentrato.
5. Il processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, in cui in detta fase (pre-iii) di idrolisi enzimatica al materiale di partenza vegetale viene aggiunta un quantit? di solvente acquoso, preferibilmente acqua, compresa da 25 a 100 volte il peso del materiale di partenza vegetale (massa/massa), preferibilmente compresa da 35 a 75 volte, viene aggiunto detto enzima in una % in volume compresa da 0,001% a 1%, preferibilmente da 0,005% a 0,01%, e la miscela risultante viene scaldata a una temperatura compresa da 10?C a 90?C, preferibilmente da 20?C a 65?C, per un tempo compreso da 0,5 ore a 12 ore, preferibilmente da 1 ora a 8 ore, a dare una miscela di fase (pre-iii) da sottoporre alla fase di estrazione (iii) o alla fase di prima estrazione (iii.a).
6. Il processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, in cui detta condroitina solfato, o il suo sale, ottenuta dal processo ha un peso molecolare medio ponderale compreso da 1 kDa a 50 kDa, preferibilmente da 5 kDa o maggiore di 5 kDa a 25 kDa; pi? preferibilmente da 5 kDa o maggiore di 5 kDa a 10 kDa; e
in cui detta condroitina solfato, o il suo sale, ottenuta dal processo comprende o, alternativamente, consiste di 6-condroitina solfato in una % in peso compresa da 50% a 95?0,5%, rispetto al totale di disaccaridi contenuti nella condroitina solfato.
7. Il processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6, in cui detta condroitina solfato, o il suo sale, ottenuta dal processo ha un peso molecolare medio ponderale compreso da 1 kDa a 50 kDa, preferibilmente da 5 kDa o maggiore di 5 kDa a 25 kDa; pi? preferibilmente da 5 o maggiore di 5 kDa a 10 kDa; e in cui detta condroitina solfato, o il suo sale, ottenuta dal processo comprende o, alternativamente, consiste di 6-condroitina solfato in una % in peso compresa da 50% a 95?0,5%, preferibilmente da 75% a 90%, pi? preferibilmente da 78% a 86%, e 4-condroitina solfato in una % in peso compresa da 0,01% a 5%, preferibilmente da 0,05% a 3%, pi? preferibilmente da 0,1% a 1,5%, rispetto al totale di disaccaridi contenuti nella condroitina solfato.
8. Una condroitina solfato o un suo sale ottenuta dal processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta condroitina solfato, o un suo sale, ha un peso molecolare medio ponderale compreso da maggiore di 5 kDa a minore di 50 kDa,
in cui detta condroitina solfato, o un suo sale, comprende 6-condroitina solfato in una % in peso compresa da 50% a 95?0,5%, e 4-condroitina solfato in una % in peso compresa da 0,01% a 5%, le % essendo espresse rispetto al totale di disaccaridi contenuti nella condroitina solfato, e
in cui detta condroitina solfato, o un suo sale, ha una purezza in percentuale in peso compresa da 80% a 94,5%, rispetto al peso totale di detto prodotto PR2 ottenuto da detto processo.
9. La condroitina solfato o il suo sale secondo la rivendicazione 8, in cui detta condroitina solfato, o un suo sale, ha un peso molecolare medio ponderale compreso da maggiore di 5 kDa a 25 kDa, preferibilmente da maggiore di 5 kDa a 10 kDa,
in cui detta condroitina solfato o il suo sale comprende: 6-condroitina solfato in una % in peso compresa da 75% a 90%, preferibilmente da 78% a 86%, e 4-condroitina solfato in una % in peso compresa da 0,05% a 3%, preferibilmente da 0,1% a 1,5%, le % essendo espresse rispetto al totale di disaccaridi contenuti nella condroitina solfato, e
in cui detta condroitina solfato, o un suo sale, ha una purezza in percentuale in peso compresa da 85% a 94,5%, preferibilmente da 90% a 94,5%, rispetto al peso totale di detto prodotto PR2 ottenuto da detto processo.
10. La condroitina solfato o un suo sale secondo la rivendicazione 8 o 9 per uso in un metodo di trattamento, preventivo e/o curativo, di artrite, osteoartrite, artrosi, dolore articolare, infiammazioni degli arti e delle articolazioni, oppure reflusso gastroesofageo, in soggetti umani o animali.
11. Uso della condroitina solfato o un suo sale secondo la rivendicazione 8 o 9 come additivo o eccipiente, nella preparazione di prodotti farmaceutici, di dispositivi medici, di prodotti nutraceutici, di alimenti a fini medici speciali (AFMS), di integratori alimentari o di prodotti alimentari.
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| CHEMICAL ABSTRACTS, Columbus, Ohio, US; abstract no. 24634-61-5 |
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