KR20230035577A - 진균으로부터 히알루론산 추출 방법, 식물 기원의 히알루론산 및 그 용도 - Google Patents
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Abstract
중량 평균 분자량 10 kDa 내지 600 kDa 범위의 히알루론산 또는 이의 염 (HA)을 제조하기 위한 진균과 같은 식물성 출발 물질로부터의 추출 방법.
Description
본 발명은 고 순도이며 오염물질 및/또는 부산물의 함량이 낮은 식물 기원의, 히알루론산 또는 이의 염 (히알루론산 음이온 염)(간단히, 함께 또는 개별적으로, HA) 및/또는 콘드로이틴 또는 이의 염, 예를 들어 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 염 (간단히, 함께 또는 개별적으로, CS)을 포함하거나 또는 대안적으로 이들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 식물성 출발 물질로부터 수득한, 하나 이상의 글리코스아미노글리칸을 포함하거나 또는 대안적으로 이로 이루어진 혼합물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 의약품, 의료 기기, 뉴트라슈티컬 제품 (nutraceutical product), 특수 의료용 식품 (FSMP: food for special medical purpose), 식품 또는 식이 보충제의 제조에 있어 첨가제, 부형제 또는 구성성분으로서 상기한 혼합물의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 (i) 식물 기원의, 히알루론산 또는 이의 염 (히알루론산 음이온 염)(간단히, 함께 또는 개별적으로, HA) 및/또는 콘드로이틴 또는 이의 염, 예를 들어 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 염 (간단히, CS)을 포함하거나 또는 대안적으로 이들로 이루어진 상기한 혼합물, 및 (ii) 선택적으로, 기술적 첨가제 또는 약학 등급 또는 식품 등급의 부형제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 의약제로서 사용하기 위한 상기한 혼합물을 포함하는 전술한 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 관절염 (arthritis), 골관절염 (osteoarthritis), 관절증 (arthrosis), 관절 통증 (joint pain), 사지 및 관절의 염증 (inflammation of the limbs and joints), 위식도 역류 (gastroesophageal reflux)로부터 선택되는 특이 장애 또는 병태 또는 질환을 가진 인간 및 동물에 대한 예방 또는 근치적 치료 (curative treatment) 방법에 사용하기 위한, 전술한 혼합물을 포함하는 전술한 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 전술한 혼합물의 제조 방법, 및 식물 기원의 히알루론산 또는 이의 염 (히알루론산 음이온 염) (간단히, 함께 또는 개별적으로, HA) 및/또는 콘드로이틴 또는 이의 염, 예를 들어 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 염 (간단히, CS)을 포함하거나 또는 대안적으로 이들로 이루어진 전술한 혼합물을 포함하는 전술한 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
마지막으로, 본 발명은 고 순도이며 오염물질 및/또는 부산물의 함량이 낮은 식물 기원의, 히알루론산 또는 이의 염 및/또는 콘드로이틴 또는 이의 염, 예를 들어 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 염을 제조하기 위한 식물성 출발 물질로서 진균 (fungus)의 용도에 관한 것이다.
히알루론산은 음이온성 비-설페이트 (non-sulfate) 글리코스아미노글리칸 (GAG)으로서, 척추동물의 결합 조직, 상피 조직 및 신경 조직에 풍부히 분포되어 있다. 히알루론산은 중요한 구조적, 유변학적 및 생리학적 기능을 가지고 있다.
수탉의 볏과 인간의 탯줄은 각각 7,500 mg/l 및 4,100 mg/l으로 매우 높은 농도로 히알루론산을 함유하고 있다. 이러한 이유로, 1980년대 초, Endre A. Balazs와 동료들은 수탉의 볏과 인간의 탯줄에서 히알루론산을 분리 및 정제하는 방법을 개발하였다. 그 이후로 히알루론산은 수탉 볏으로부터 산업적 규모로 생산되었다.
콘드로이틴 설페이트는 당, N-아세틸갈락토사민 및 글루쿠론산의 교대 단위 사슬로 구성된 설페이트 GAG이다. 콘드로이틴 설페이트 사슬은 수백 개의 당 단위로 구성될 수 있으며, 각 당은 다양한 위치 및 수준으로 설페이트화될 수 있다. 콘드로이틴 설페이트는 높은 압축 강도로 인해 연골의 중요한 구조 성분이다.
콘드로이틴 설페이트는 하기 일반식 (I)의 반복 단위(이당류)를 가진다:
상기 식에서, R2, R4 및 R6 중 하나 이상은 설파이트 기 (SO3 -)이다. 콘드로이틴 모노-설페이트에서, R2, R4 또는 R6 기 중 하나만 설파이트 기이다. 따라서, 가능성 있는 모노-설페이트화 콘드로이틴 3종은 6-콘드로이틴 설페이트 (R2 = H; R4 = H; R6 = SO3 -), 4-콘드로이틴 설페이트 (R2 = H; R 4 = SO3 -; R6 = H) 및 2-콘드로이틴 설페이트 (R2 = SO3 -; R4 = H; R6 = H)이다.
대부분의 콘드로이틴 설페이트는 동물 연골의 추출물, 주로 소와 돼지의 조직 (예를 들어, 기관, 귀, 코)으로부터 수득되지만, 상어, 어류 및 조류 연골과 같은 다른 공급원도 이용할 수 있다.
포유동물, 특히 인간에서 히알루론산 및 콘드로이틴 설페이트의 - 효율성 측면에서 - 논쟁의 여지가 없는 수많은 의학적 활용에도 불구하고, 동물 전구체로부터 추출을 통한 제조 방법은 오늘날 또한 윤리적, 종교적 및 도덕적 측면에서 우려 및 두려움 증가에 직면해 있다. 주된 우려와 두려움은, 특히 이러한 화합물 또는 염을 영양, 생의학 또는 약제학적 용도로 의도할 경우, 히알루론산 또는 이의 염 및/또는 콘드로이틴 또는 이의 염, 예를 들어, 콘드로이틴 설페이트를 제조하는데 동물 유래 생산물 또는 동물 기원을 사용하는 것에서 비롯한다. 또한, 동물성 공급원에서 추출된 콘드로이틴 설페이트 및 히알루론산은 분자량이 높지만, 저 분자량의 콘드로이틴 설페이트 및/또는 히알루론산이 경피 침투성이 우수하므로 이를 확보하는 것이 유리할 것이다.
박테리아 발효 과정을 이용해 수득한 비-설페이트화 콘드로이틴에 설페이트 기를 삽입함으로써 수득되는, 동물 기원이 아닌 콘드로이틴 설페이트가 종래 기술에 공지되어 있다.
따라서, 의약품, 의료 기기, 뉴트라슈티컬 제품, 특수 의료용 식품 (FSMP), 식이 보충제 또는 식품 분야에서, 기존 방법에 대해 대안적인 방식으로 제조되고 완전 채식주의자, 채식주의자, 알레르기를 앓고 있는 개체, 및 종교적 또는 이념적 이유로 히알루론산 또는 이의 염 및/또는 콘드로이틴 또는 이의 염이 함유된 제품 또는 의약제에 대한 접근이 현재 금기되는 임의의 개체를 포함한 모든 부류의 소비자들에게 사용될 수 있는, 히알루론산 또는 이의 염 및 /또는 콘드로이틴 또는 이의 염, 예를 들어, 콘드로이틴 설페이트에 대한 시장 운영자들의 강력한 필요와 수요가 존재한다. 또한, 당업계에 공지된 것과 관련하여 경제적으로 유리하고 적용하기 쉬운 방법으로 비-동물성 기원의 콘드로이틴 설페이트 및/또는 히알루론산을 생산할 필요성을 절감하고 있다.
본 출원인은 장기간의 집중적인 연구와 개발 활동을 통해, 기존의 한계, 단점 및 문제에 적절히 대응할 수 있는 제조 기술 및 공정을 개발하게 되었다.
이에, 본 발명의 과제를 형성하는 것은, 첨부된 청구항에 정의된 바와 같은 특징을 가진, 식물 기원의, 히알루론산 또는 이의 염 (히알루론산 음이온 염)(간단히, 함께 또는 개별적으로, HA) 및/또는 콘드로이틴 또는 이의 염, 예를 들어 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 염 (간단히, 함께 또는 개별적으로, CS)을 포함하거나 또는 대안적으로 이들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 식물성 출발 물질로부터 수득한, 하나 이상의 글리코스아미노글리칸을 포함하거나 또는 대안적으로 이로 이루어진 혼합물이다.
또한, 본 발명의 과제를 형성하는 것은, 의약품, 의료 기기, 뉴트라슈티컬 제품, 특수 의료용 식품 (FSMP), 식품 또는 식이 보충제의 제조에 있어 첨가제, 부형제 또는 구성성분으로서의 전술한 혼합물의 용도로서, 첨부된 청구항에 정의된 바와 같은 특징을 가지는 용도이다.
본 발명의 또 다른 과제를 형성하는 것은, (i) 식물 기원의, 히알루론산 또는 이의 염 (히알루론산 음이온 염)(간단히, 함께 또는 개별적으로, HA) 및/또는 콘드로이틴 또는 이의 염, 예를 들어 콘드로이틴 설페이트 (간단히, CS)를 포함하거나 또는 대안적으로 이들로 이루어진 전술한 혼합물과, (ii) 선택적으로, 기술적 첨가제 또는 약학 등급 또는 식품 등급의 부형제를 포함하는, 첨부된 청구항에 정의된 바와 같은 특징을 가지는 조성물이다.
본 발명의 다른 과제를 형성하는 것은, 첨부된 청구항에 정의된 바와 같은 특징을 가지는, 의약제로 사용하기 위한 (제1 의약 용도), 혼합물 및 하나 이상의 기술적 첨가제 또는 부형제 또는 조성물이다.
본 발명의 또 다른 과제를 형성하는 것은, 첨부된 청구항에 정의된 바와 같은 특징을 가지는 용도로서 관절염, 골관절염, 관절증, 관절 통증, 사지 및 관절의 염증, 위식도 역류로부터 선택되는 특이 장애 또는 병태 또는 질환을 가진 인간 및 동물에 대한 예방 또는 근치적 처치 방법에 사용하기 위한 (제2 의약 용도), 혼합물 또는 전술한 혼합물을 포함하는 조성물이다.
또한, 본 발명의 또 다른 과제를 형성하는 것은, 첨부된 청구항에 정의된 바와 같은 특징을 가지는, 전술한 혼합물의 제조 방법, 또는 식물 기원의, 히알루론산 또는 이의 염 (히알루론산 음이온 염)(간단히, 함께 또는 개별적으로, HA) 및/또는 콘드로이틴 또는 이의 염, 예를 들어 콘드로이틴 설페이트 (간단히, CS)를 포함하거나 또는 대안적으로 이들로 이루어진 전술한 혼합물을 포함하는 전술한 조성물의 제조 방법이다.
마지막으로, 본 발명의 과제를 형성하는 것은, 첨부된 청구항에 정의된 바와 같은 특징을 가지는, 높은 순도를 가지며 오염물질 및/또는 부산물의 함량이 낮은, 히알루론산 또는 이의 염 및/또는 콘드로이틴 또는 이의 염, 예를 들어 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 염을 제조하기 위한 식물성 출발 물질로서의 진균의 용도이다.
이제 본 발명에 대한 바람직한 구현예들이 첨부된 도면을 참조하여 설명될 것이다:
- 도 1 내지 도 4는 여러가지 구현예들 (제1 구현예, P1)에 따른, 본 발명의 대상인 공정 흐름도를 도시한 것이다.
- 도 5 및 6은 제2 구현예 (P2)에 따른, 본 발명의 대상인 공정 흐름도를 도시한 것이다.
- 도 7 및 도 8은 제3 구현예 (P3)에 따른, 본 발명의 대상인 공정 흐름도를 도시한 것이다.
- 도 9 및 10은 HA를 함유하는 샘플 및 CS를 함유하는 샘플 각각에서 불포화 이당류를 측정한 HPLC 스펙트럼 2개를 도시한 것이다.
- 도 1 내지 도 4는 여러가지 구현예들 (제1 구현예, P1)에 따른, 본 발명의 대상인 공정 흐름도를 도시한 것이다.
- 도 5 및 6은 제2 구현예 (P2)에 따른, 본 발명의 대상인 공정 흐름도를 도시한 것이다.
- 도 7 및 도 8은 제3 구현예 (P3)에 따른, 본 발명의 대상인 공정 흐름도를 도시한 것이다.
- 도 9 및 10은 HA를 함유하는 샘플 및 CS를 함유하는 샘플 각각에서 불포화 이당류를 측정한 HPLC 스펙트럼 2개를 도시한 것이다.
본원의 맥락에서, 용어 "HA"는 히알루론산 또는 이의 염, 또는 히알루로네이트, 또는 이들의 조합을 나타내기 위해 사용되는 것으로, 주지하여야 한다. 한편, 용어 "CS"는 콘드로이틴, 콘드로이틴 염, 바람직하게는 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 염, 또는 이들의 혼합물을 나타내기 위해 사용된다.
본 발명의 설명에서, 용어 "식물성 출발 물질 (plant starting material)"과 "식물 기원의 출발 물질 (starting material of plant origin)"은 동의어이며, 따라서 상호 호환적으로 사용된다.
발명에 대한 상세한 설명
본 발명의 과제를 형성하는 것은, 식물 기원의 출발 물질로부터 수득한 하나 이상의 글리코스아미노글리칸을 포함하거나 또는 대안적으로 이로 이루어진 혼합물 (m)이다. 이러한 식물 기원의 물질은 하나 이상의 천연 진균을 포함하거나 또는 대안적으로 이로 이루어진 군으로부터 선택된다.
글리코스아미노글리칸은 하기를 포함하거나 또는 대안적으로 이로 이루어진 군로부터 선택된다:
(a) 히알루론산 또는 이의 염, 히알루론산 음이온 (간단히, HA);
(b) 콘드로이틴 또는 이의 염, 예를 들어 콘드로이틴 설페이트 (간단히, CS) 또는 이의 염;
(c) (a)와 (b)의 조합물.
식물성 출발 물질은 진균이다. 진균은 자연에서 생장하며 발견되는 곰팡이이다. 예를 들어, 진균은 숲에서 발견 및 채집할 수 있지만, 온실에서도 재배할 수 있다.
진균은 쌍핵균류 아계 (Dikarya subkingdom)에 속하며, 바람직하게는 담자균 문 (Basidiomycota Division)에 속한다.
쌍핵균류는 자낭균 문 (Ascomycota Division) 및 담자균 문을 포함하는 진균 아계이다. 담자균 문 (Basidiomycota R.T. Moore, 1980)은 진균의 계 (kingdom)를 형성하는 가장 큰 문 (phyla) 중 하나이다.
일 구현예에 따라, 식물성 출발 물질은 트레멜라 푸치포르미스 (Tremella fuciformis) 종의 진균이거나, 또는 식물성 출발 물질은 트레멜라 푸치포르미스 종의 진균을 포함하거나 또는 대안적으로 이로 이루어진다.
트레멜라 푸치포르미스 (Berk. 1856)(눈 곰팡이 (snow fungus) 또는 은귀 곰팡이 (silver ear fungus)라고도 함)는 열대 및 아열대 지역으로부터 기원한 진균으로서, 죽은 활엽수 원목에서 번성하며, 특히 일본 및 중국에서 - 요리 및 전통 의학에서의 - 매우 높은 수요에 대처하기 위해 재배되고 있다. 트레멜라 푸치포르미스는 잎 (frond)과 유사한, 백색 젤라틴성 열매-보유체 (fruit-bearing body)(담자과 (basidiocarps))를 생산한다.
본 발명에서 트레멜라 푸치포르미스의 이용은, 이 식물성 출발 물질로부터 시작하여, 본원에서 개발한 추출 기술 (제1 구현예 (P1), 제2 구현예 (P2) 및 제3 구현예 (P3))로 식물 기원의 (및 저분자량의) HA 및 CS 둘다 완벽하게 생산할 수 있다는 점에서 특히 유리하다. 혼합물 (m)에 함유되고 본 발명의 방법을 통해 수득되는, HA 및/또는 CS 글리코스아미노글리칸은, 종래 기술에 따른 동물 연골로부터 수득가능한 HA 및/또는 CS와 비교해, 무엇보다도 낮은 분자량으로 인해 이를 특히 유용하게 만드는 독특한 특징을 가진다. 저분자량으로 인해, 개선된 경피 침투 특성을 가진 HA 및/또는 CS 글리코스아미노글리칸을 확보할 수 있다.
보다 정확하게는, 본 발명의 방법 (P1 및/또는 P2)을 통해 수득되는 히알루론산 또는 이의 염 (히알루로네이트)은 10 kDa 내지 600 kDa, 바람직하게는 100 kDa 내지 500 kDa, 보다 더 바람직하게는 200 kDa 내지 400 kDa 또는 100 kDa 내지 300 kDa을 포함하는 중량 평균 분자량, 예를 들어 약 50 kDa, 150 kDa 또는 250 kDa, 또는 300 kDa, 또는 350 kDa, 또는 450 kDa, 또는 550 kDa을 포함하는 중량 평균 분자량을 갖는다. 바람직하게는, HA는 진균으로부터 추출한 HA의 총 중량에 대해 0.01% 내지 5%, 바람직하게는 0.1% 내지 3%, 보다 더 바람직하게는 0.5% 내지 2%, 예를 들어 1% 또는 2%로 구성되는 중량%로 콘드로이틴 (바람직하게는 비-황산화 콘드로이틴)을 함유한다.
본 발명의 유리한 측면에 따라, 이러한 범위에 속하는 중량 평균 분자량을 가진 HA는, 제한된 분자 크기로 인해 높은 경피 침투성을 가진다.
콘드로이틴 또는 이의 염, 예를 들어 본 발명의 방법 (P1 및/또는 P3)을 통해 수득되는 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 염 (CS)은 1 kDa 내지 50 kDa 또는 5 kDa 초과 내지 50 kDa 미만, 바람직하게는 3 kDa 내지 40 kDa, 보다 더 바람직하게는 5 kDa 이상 또는 5 kDa 초과 내지 25 kDa 또는 5 kDa 초과 내지 10 kDa로 구성되는 중량 평균 분자량, 예를 들어 약 4 kDa, 또는 6 kDa, 또는 8 kDa, 또는 10 kDa, 또는 12 kDa, 또는 14 kDa, 또는 16 kDa, 또는 18 kDa, 또는 22 kDa, 또는 24 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는다.
본 발명의 또 다른 유리한 측면에 따르면, 전술한 범위에 포함되는 중량 평균 분자량을 가진 CS는 또한 무릎 및 고관절의 골관절염으로 인한 골 손상을 감소시키는 데 효과적인 것으로 입증되었다.
본 발명의 혼합물 (m)에 함유된 CS는 1 kDa (1,000.00 Da=1x103 Da) 내지 50 kDa, 바람직하게는 3 kDa 내지 40 kDa, 보다 더 바람직하게는 5 kDa 내지 25 kDa으로 구성되는 중량 평균 분자량, 예를 들어 약 4 kDa, 또는 6 kDa, 또는 8 kDa, 또는 10 kDa, 또는 12 kDa, 또는 14 kDa, 또는 16 kDa, 또는 18 kDa, 또는 22 kDa 또는 24 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는, 콘드로이틴 설페이트를 포함한다.
바람직하게는, CS는 0.70 내지 0.99 또는 0.70 내지 1.50, 바람직하게는 0.75 내지 0.98 또는 0.75 내지 1.20, 보다 더 바람직하게는 0.80 내지 0.97로 구성되는, 예를 들어 0.85, 0.87, 0.90, 0.92, 0.94 또는 0.96의 전하 밀도 (charge density)를 갖는다.
더 바람직하게는, CS (P1 및/또는 P3 방법으로 수득)는 CS의 총 중량에 대해 (또는, 콘드로이틴 설페이트에 함유된 전체 이당류에 대해; 예를 들어, HPLC를 이용해 % 결정), 50% 내지 99.5%, 바람직하게는 50% 내지 95%, 보다 바람직하게는 75% 내지 88%, 보다 더 바람직하게는 78% 내지 86%로 구성되는, 예를 들어 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 중량%로 6-콘드로이틴 설페이트를 포함한다.
CS는 6-콘드로이틴 설페이트 외에도, 바람직하게는 비-설페이트 콘드로이틴 (non-sulfated chondroitin)을 포함한다.
바람직하게는, 비-설페이트화 콘드로이틴은 CS의 총 중량에 대해 (또는 콘드로이틴 설페이트에 함유된 전체 이당류에 대해; 예를 들어, HPLC를 이용해 % 결정) 0.1% 내지 25%, 바람직하게는 0.5% 내지 20% 또는 5% 내지 20%, 더 바람직하게는 7% 내지 15%, 보다 더 바람직하게는 8% 내지 13%로 구성되는 중량%, 예를 들어 약 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5.5%, 6%, 8%, 9%, 10%, 11% 또는 12%의 중량%로 포함된다.
CS는 6-콘드로이틴 설페이트 및 비-설페이트화 콘드로이틴 외에도, 바람직하게는 2,6-콘드로이틴 다이설페이트 (2,6-chondroitin disulfate)를 포함한다.
바람직하게는, 2,6-콘드로이틴 다이설페이트는 CS의 총 중량에 대해 (또는 콘드로이틴 설페이트에 함유된 전체 이당류에 대해; 예를 들어, HPLC를 이용해 % 결정) 0.1% 내지 10%, 바람직하게는 0.2% 내지 8%, 보다 더 바람직하게는 0.3% 내지 5%로 구성되는 중량%, 예를 들어 약 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4% 또는 4.5%의 중량%로 포함된다.
CS는 6-콘드로이틴 설페이트, 비-설페이트화 콘드로이틴 및 2,6-콘드로이틴 다이설페이트 외에도, 바람직하게는 (또는 콘드로이틴 설페이트에 함유된 전체 이당류에 대해; 예를 들어, HPLC를 이용해 % 결정) 4-콘드로이틴 설페이트를 포함한다.
바람직하게는, 4-콘드로이틴 설페이트는 CS의 총 중량에 대해 (또는 콘드로이틴 설페이트에 함유된 전체 이당류에 대해; 예를 들어, HPLC를 이용해 % 결정) 0.01% 내지 5%, 바람직하게는 0.05% 내지 3%, 보다 더 바람직하게는 0.1% 내지 1.5%로 구성되는 중량%, 예를 들어 약 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%의 중량%로 포함된다.
CS는 6-콘드로이틴 설페이트, 비-설페이트화 콘드로이틴, 2,6-콘드로이틴 다이설페이트 및 4-콘드로이틴 설페이트 외에도, 바람직하게는 4,6-콘드로이틴 다이설페이트를 포함한다.
바람직하게는, 4,6-콘드로이틴 다이설페이트는 CS의 총 중량에 대해 (또는 콘드로이틴 설페이트에 함유된 전체 이당류에 대해; 예를 들어, HPLC를 이용해 % 결정) 0.01% 내지 5%, 바람직하게는 0.05% 내지 3%, 보다 더 바람직하게는 0.1% 내지 1.5%로 구성되는 중량%, 예를 들어 약 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%의 중량%로 포함된다.
CS는 6-콘드로이틴 설페이트, 비-설페이트화 콘드로이틴, 2,6-콘드로이틴 다이설페이트, 4-콘드로이틴 설페이트 및 4,6-콘드로이틴 다이설페이트 외에도, 바람직하게는 (또는 콘드로이틴 설페이트에 함유된 전체 이당류에 대해; 예를 들어, HPLC를 이용해 % 결정) 2,4-콘드로이틴 다이설페이트를 포함한다.
바람직하게는, 2,4-콘드로이틴 다이설페이트는 CS의 총 중량에 대해 (또는 콘드로이틴 설페이트에 함유된 전체 이당류에 대해; 예를 들어, HPLC를 이용해 % 결정) 0.01% 내지 5%, 바람직하게는 0.05% 내지 3%, 보다 더 바람직하게는 0.1% 내지 1.5%로 구성되는 중량%, 예를 들어 약 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1.0% 의 중량%로 포함된다.
6-콘드로이틴 설페이트, 비-설페이트화 콘드로이틴, 2,6-콘드로이틴 다이설페이트, 4-콘드로이틴 설페이트, 4,6-콘드로이틴 다이설페이트 및 2,4-콘드로이틴 다이설페이트 외에도, CS는 바람직하게는 히알루론산 또는 히알루로네이트 (바람직하게는 비-설페이트화)를 포함한다. 바람직하게는, HA는 CS의 총 중량에 대해 0.01% 내지 5%, 바람직하게는 0.05% 내지 3%, 보다 더 바람직하게는 0.1% 내지 1.5%로 구성되는 중량%, 예를 들어 0.8% 또는 1.0%의 중량%로 존재한다.
일 구현예에 있어서, 혼합물 (m)에 함유되고 본 발명의 방법 (P1 및/또는 P3)을 통해 수득되는 CS는 하기를 포함한다:
- 50% 내지 99.5%, 바람직하게는 50% 내지 95±0.5%, 더 바람직하게는 75% 내지 88%, 보다 더 바람직하게는 78% 내지 86%로 구성되는 중량%의, 6-콘드로이틴 설페이트;
- 0.1% 내지 25%, 바람직하게는 0.5% 내지 20%, 더 바람직하게는 7% 내지 15%, 보다 더 바람직하게는 8% 내지 13%로 구성되는 중량%의, 비-설페이트화 콘드로이틴;
- 0.1% 내지 10%, 바람직하게는 0.2% 내지 8%, 보다 더 바람직하게는 0.3% 내지 5%로 구성되는 중량%의, 2,6-콘드로이틴 다이설페이트; 및, 또한,
- 0.01% 내지 5%, 바람직하게는 0.05% 내지 3%, 보다 더 바람직하게는 0.1% 내지 1.5%로 구성되는 중량%의, 4-콘드로이틴 설페이트,
- 0.01% 내지 5%, 바람직하게는 0.05% 내지 3%, 보다 더 바람직하게는 0.1% 내지 1.5%로 구성되는 중량%의, 4,6-콘드로이틴 다이설페이트, 및
- 0.01% 내지 5%, 바람직하게는 0.05% 내지 3%, 보다 더 바람직하게는 0.1% 내지 1.5%로 구성되는 중량%의, 2,4-콘드로이틴 다이설페이트.
예를 들어, 혼합물 (m)에 함유되고 본 발명의 방법을 통해 수득되는 CS는, 하기 표 1에 따른, 조성물 CS.1, CS.2, CS.3, CS.4, CS.5 또는 조성물 CS.6을 갖는다 (수치는 CS.n의 총 중량에 대한 각 성분의 중량%로 나타냄, n=1-6).
| 혼합물 (m)에 함유된 CS | CS.1 | CS.2 | CS.3 | CS.4 | CS.5 | CS.6 |
| 비-설페이트화 콘드로이틴 | 10.6 | 11.5 | 10.8 | 8.9 | 2.9 | 1.7 |
| 6-콘드로이틴 설페이트 | 85.3 | 79.7 | 84.7 | 87.9 | 92.6 | 95.7 |
| 4-콘드로이틴 설페이트 | 0.0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.1 | 0.4 |
| 2,6-콘드로이틴 다이설페이트 | 4.1 | 0.5 | 2.4 | 1.9 | 3.4 | 0.5 |
| 4,6-콘드로이틴 다이설페이트 | 0.0 | 0.9 | 0.8 | 0.3 | 0.4 | 0.9 |
| 2,4-콘드로이틴 다이설페이트 | 0.0 | 1.0 | 0.9 | 0.4 | 0.6 | 0.8 |
| 전하 밀도 | 0.94 | 0.85 | 0.95 | 0.92 | 0.94 | 0.96 |
본 발명의 과제를 형성하는 것은, (i) (a) 10 kDa 내지 600 kDa (바람직하게는 100 kDa 내지 500 kDa, 보다 더 바람직하게는 200 kDa 내지 400 kDa, 또는 100 kDa 내지 300 kDa, 예를 들어 약 150 kDa, 또는 250 kDa, 또는 300 kDa, 또는 350 kDa, 또는 450 kDa, 또는 550 kDa)으로 구성되는 중량 평균 분자량의 HA, 및 /또는 (b) 1 kDa 내지 50 kDa 또는 5 kDa 초과 내지 50 kDa 미만 (바람직하게는 3 kDa 내지 40 kDa, 보다 더 바람직하게는 5 kDa 또는 5 kDa 초과 내지 25 kDa, 예를 들어 약 4 kDa, 또는 6 kDa, 또는 8 kDa, 또는 10 kDa 또는 12 kDa, 또는 14 kDa, 또는 16 kDa, 또는 18 kDa, 또는 22 kDa, 또는 24 kDa)으로 구성되는 중량 평균 분자량의 CS를 포함하거나 또는 대안적으로 이들로 이루어진 전술한 혼합물 (m), 및 (ii) 선택적으로, 기술적 첨가제 및 약학 등급 또는 식품 등급의 부형제를 포함하는 조성물이다.
이러한 조성물은 약학적 조성물, 의료 기기 조성물 (EU) 2017/745, 뉴트라슈티컬 기능성 조성물, 특수 의료용 식품 (SFMP) 조성물, 식이 보충제 조성물, 또는 식품 조성물, 또는 새로운 식품 조성물 (EU) 2015/2283일 수 있다.
이러한 조성물은 관절염, 골관절염, 관절증, 관절 통증, 사지 및 관절의 염증, 위식도 역류의 예방 및/또는 근치적 치료에 사용하기 위한 의약제로서 또는 조성물로서 사용될 수 있다.
본 발명의 과제를 형성하는 것은, 히알루론산 또는 히알루로네이트 (HA)의 제조 기술 및 공정 (공정 P1 및/또는 P2) 및/또는 콘드로이틴 설페이트 또는 콘드로이틴 또는 이의 염 (CS)의 제조 기술 및 공정 (공정 P1 및/또는 P3)으로서, 이러한 공정은 식물 기원의 출발 물질, 예를 들어 쌍핵균류 아계, 바람직하게는 담자균 문, 더 바람직하게는 트레멜라 푸치포르미스 종에 속하는 하나 이상의 천연 진균을 포함하거나 또는 대안적으로 이로 이루어진 식물 기원의 출발 물질로부터 히알루론산 또는 히알루로네이트 및/또는 콘드로이틴 설페이트 또는 콘드로이틴을 추출하는 하나 이상의 단계를 포함한다.
본 발명의 공정 (제1 구현예 (P1), 제2 구현예 (P2) 및 제3 구현예 (P3))은, 예를 들어 콘드로이틴 또는 콘드로이틴 설페이트의 제조에 대해 특허 문헌 WO 2012/152872 A1 및 EP 2852437 B1에 발표된 박테리아 발효와 같은 박테리아의 발효 및/또는 분해 (digestion) 단계를 포함하지 않는다.
본 공정의 다양한 구현예들이 도 1-8에서 흐름도로 예시된다.
제1 구현예 (P1)로서, 본 발명의 공정은 하기 단계들을 포함한다:
(i) 글리코스아미노글리칸의 식물성 출발 물질로서 하나 이상의 천연 진균을, 예를 들어, 바람직하게는, 쌍핵균류 아계, 바람직하게는 담자균 문, 더 바람직하게는 트레멜라 푸치포르미스 종에 속하는 하나 이상의 진균을 포함하거나 또는 대안적으로 이로 이루어진, 건조물 또는 건조된 형태의 하나 이상의 천연 진균을 식별하는 단계;
(ii) 선택적으로, 식물성 출발 물질의 파쇄 (crushing) 또는 분쇄 (pulverisation)를 수행하는 단계;
(iii) 추출 용매, 바람직하게는 수성 용매, 더 바람직하게는 물 (예를 들어 증류수 또는 2차 증류수)을 사용하여 단계 (i) 또는 단계 (ii)에서 수득한 식물성 출발 물질로부터 글리코스아미노글리칸 (HA 또는 CS)을 추출하여, 글리코스아미노글리칸의 수성 추출물을 수득하는 단계;
(iv) 단계 (iii)에서 수득한 수성 추출물에 용매, 바람직하게는 에탄올을 첨가하여 액체 생성물을 수득하는 단계;
(v) 단계 (iv)에서 수득한 액체 생성물을 원심분리 및/또는 여과하여 액체 상 (liquid phase) 및 고체 잔류물 (solid residue)을 수득하는 단계;
(vi) 단계 (v)의 원심분리 및/또는 여과에 의해 수득한 액체 상에 대해 하기 단계 (vi.a)를 통해 가공 처리를 수행하는 단계, 및/또는 단계 (v)의 원심분리 및/또는 여과에 의해 수득한 고체 잔류물을 하기 단계 (vi.b), (vi.c), (vi.d) 및 (vi.e)를 통해 가공 처리를 수행하는 단계:
(vi.a) 단계 (v)에서 수득한 액체 상을 건조, 바람직하게는 농축 및 건조하여, 10 kDa 내지 600 kDa으로 구성되는 중량 평균 분자량의 히알루론산 또는 이의 염을 수득하는 단계; 및/또는
(vi.b) 단계 (v)에서 수득한 고체 잔류물을 회수 및 정제하여 1 kDa 내지 50 kDa으로 구성되는 중량 평균 분자량의 콘드로이틴 또는 이의 염(CS)을 수득하는 단계;
(vi.c) 단계 (vi.b)에서 수득한 콘드로이틴 또는 이의 염 (CS)에 황산 공급원, 바람직하게는 황산, 삼산화황 피리딘 착물, 삼산화황 다이메틸-포름아미드 착물 및 이들의 혼합물을 포함하거나 또는 대안적으로 이들로 이루어진 군에서 선택되는 황산 공급원을 처리하여, 산성화된 생성물을 수득하는 단계;
(vi.d) 단계 (vi.c)에서 수득한 산성화된 생성물을 염기성 제제로 중화하여, 중화된 생성물을 수득하는 단계;
(vi.e) 단계 (vi.d)에서 수득한 중화된 생성물을 농축 및 건조하여 1 kDa 내지 50 kDa으로 구성되는 중량 평균 분자량의 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 염을 수득하는 단계.
단계 (iii)에서 추출 대상으로서 식물성 출발 물질은 온전한 것일 수 있거나 (즉, 단일 조각 (single piece), 예를 들어 전체 진균 (whole fungus)), 또는 단계 (ii)에서 파쇄 (조각 또는 플레이크로) 또는 (과립, 분말 또는 펠렛으로) 분쇄된 식물 물질일 수 있다.
도 1 및 도 2의 흐름도는, 단계 (i)에서 식별한 천연 진균 또는 이의 복수를 단계 (iii) 또는 단계 (iii.a) 및 (iii.b)에서 추출하여 수성 추출물을 수득하는, 제1 구현예 (P1)에 따른 본 발명의 공정에 대한 구현예를 보여준다.
도 3 및 도 4의 흐름도는, 단계 (i)에서 식별한 천연 진균 또는 이의 복수를 단계 (ii)에서 파쇄 또는 분쇄하는, 제1 구현예 (P1)에 따른 본 발명의 공정 (당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 기술 및 장치에 따라 수행되는 공정)에 대한 구현예를 보여준다. 후속적으로, 단계 (ii)에서 파쇄 또는 분쇄한 천연 진균 또는 이의 복수는 단계 (iii) 또는 단계 (iii.a) 및 (iii.b)에서 추출하여, 수성 추출물을 수득한다.
단계 (ii)에서 식물성 출발 물질을 (당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 기술 및 장치에 따라) 파쇄 또는 분쇄하는 경우, 식물성 출발 물질의 평균 입자 크기 분포는 바람직하게는 500 ㎛ 내지 2,500 ㎛, 보다 바람직하게는 800 ㎛ 내지 1,800 ㎛, 보다 더 바람직하게는 900 ㎛ 내지 1,200 ㎛이다.
일 구현예에서, (단계 (i) 또는 (ii)로부터) 단계 (iii)에 공급되는 식물성 출발 물질은 조각 또는 플레이크로 파쇄되거나, 또는 과립 또는 펠렛으로 분쇄된 식물 물질이다.
(단계 (i) 또는 (ii)로부터) 단계 (iii)에 공급되는 식물성 출발 물질은 바람직하게는 건조물이거나 또는 건조되며, 즉, 식물성 출발 물질의 총 중량에 대한 물 함량이 약 2 중량% 내지 약 20 중량%, 바람직하게는 5 중량% 내지 15 중량%, 보다 더 바람직하게는 8 중량% 내지 10 중량% 범위인 식물성 출발 물질이다.
단계 (iii)에서, 추출 용매는 수성 용매 및 물로부터 선택된다.
수성 용매 (또는 수성 용액)는, 바람직하게는, 알코올 (예를 들어, 에탄올)이 추출 용매의 총 중량에 대해 0.1% 내지 50%, 더욱 바람직하게는 0.5% 내지 25%, 보다 더 바람직하게는 1% 내지 15% 범위의 중량%, 예를 들어 약 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 7.5%, 10%, 20%의 중량%로 존재하는, 하이드로알코올성 혼합물 (hydroalcoholic mixture)이다.
물은 바람직하게는 증류수 또는 2차 증류수이다.
단계 (iii)에서, 식물성 출발 물질은, 예를 들어 기계적 교반 수단, 가열 수단, 여과 수단뿐 아니라 온도 및 압력 제어 수단이 구비된, 용기 또는 추출 장치로 연속적으로 또는 배치로 공급된다.
단계 (iii)에서, 식물성 출발 물질은 그 후 추출 용매에 의해 추출 용기 또는 장치에서 추출되며, 그래서, 히알루론산 또는 이의 염은 수성 추출물 내부 액체 상의 용액으로 통과하게 되고, 콘드로이틴은 고체 잔류물에 남게 된다.
단계 (iii)의 추출은 1:1: 내지 1:90, 바람직하게는 1:10 내지 1:90, 더 바람직하게는 1:20 내지 1:75, 보다 더 바람직하게는 1:40 내지 1:60 범위의, 예를 들어 1:3, 1:5, 1:15, 1:25, 1:45, 1:50 또는 1:55의 [식물성 출발 물질의 중량]:[추출 용매의 부피] 비율로 적용하여 이루어진다. 단계 (iii)의 추출은 1분 내지 12시간, 바람직하게는 10분 내지 9시간, 보다 더 바람직하게는 15분 내지 4시간으로 구성되는 기간 동안, 예를 들어 약 30분, 45분, 60분, 90분, 120분, 150분 또는 180분 동안 이루어진다.
단계 (iii)는 바람직하게는 대기압 (P=1 Atm., 20-25℃) 및 10℃ 내지 90℃, 바람직하게는 20℃ 내지 60℃, 보다 더 바람직하게는 35℃ 내지 55℃을 포함하는 추출 용매의 온도에서, 예를 들어 약 25℃, 30℃, 40℃, 44℃, 48℃ 또는 50℃에서 이루어진다.
바람직하게는, 단계 (iii)에서 추출 용매의 pH 값은 3 내지 10, 바람직하게는 3.5 내지 9, 더 바람직하게는 4 내지 8, 보다 더 바람직하게는 5 내지 7로 구성되며, 예를 들어 pH 약 4.5; 5.5; 6; 6.5; 7.5; 8.5 또는 9.5이다.
단계 (iii)의 추출에서, 바람직하게는 식물 기원 물질의 표면 펙틴을 분해하여 공정의 수율을 높이기 위해 단백질 분해효소를 이용한다. 바람직하게는, 단백질 분해효소는 브로멜라인 (bromelain) 또는 브로멜라인 추출물을 포함하거나 또는 대안적으로 이로 이루어진다.
브로멜라인은 단백질 분해효소 및 기타 물질을 소량 함유한 파인애플의 열매 및/또는 줄기의 효소 추출물이다.
추출 수율을 높이기 위해, 단계 (iii)는 바람직하게는 아래에 기술된 바와 같이 두 단계로 이루어진다:
(iii.a) 10℃ 내지 90℃, 바람직하게는 20℃ 내지 60℃, 보다 더 바람직하게는 35℃ 내지 55℃로 구성되는 온도에서, 1분 또는 30분 내지 12시간, 바람직하게는 10분 내지 9시간, 보다 더 바람직하게는 15분 내지 4시간으로 구성되는 시간 동안, 제1 부피의 추출 용매를 사용하여 식물성 출발 물질로부터 1차 추출을 수행하여, 제1 수성 추출물을 수득하는 단계; 및
(iii.b) 80℃ 내지 120℃, 바람직하게는 90℃ 내지 110℃, 바람직하게는 95℃ 내지 105℃, 보다 더 바람직하게는 98℃ 내지 102℃로 구성되는 온도에서, 바람직하게는 가압하 또는 감압하에서, 10분 내지 6시간 또는 30분 내지 8시간, 바람직하게는 20분 내지 4시간, 보다 더 바람직하게는 40분 내지 2시간으로 구성되는 기간 동안, 예를 들어 약 30분, 60분 또는 90분 동안, 제2 부피의 추출 용매를 사용하여 식물성 출발 물질 (또는 상기 1차 추출 단계 (iii.a)의 고체 잔류물)로부터 2차 추출을 수행하여, 제2 수성 추출물을 수득하는 단계. 바람직하게는, 1차 추출 (iii.a)에서, 식물성 출발 물질의 중량에 대해 25 내지 75배, 바람직하게는 35 내지 65배, 보다 더 바람직하게는 45 내지 55배, 예를 들어 약 30배, 또는 50배로 구성된 제1 부피로 추출 용매를 사용한다.
바람직하게는, 2차 추출 (iii.b)에서, 추출 용매는 식물성 출발 물질의 중량에 대해 10 내지 150배, 바람직하게는 75 내지 125배, 더욱 바람직하게는 85 내지 115배, 보다 더 바람직하게는 95 내지 105배로 구성되는 제2 부피로, 예를 들어 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100배로 사용된다.
HA 및/또는 CS 제조 공정에 대한 상기한 제1 구현예 (P1)에서, 단계 (iii.a)에서 수득한 제1 수성 추출물 및 단계 (iii.b)에서 수득한 제2 수성 추출물을 조합하고, 단계 (iv)에 따라 여기에 용매를 첨가한다.
단계 (iv)에서, 단계 (iii)에서 수득한 수성 추출물 또는 단계 (iii.a)에서 수득한 제1 수성 추출물 및 단계 (iii.b)에서 수득한 제2 수성 추출물에 용매, 바람직하게는 에탄올을 첨가하여, 액체 생성물을 수득한다.
단계 (v)에서, 단계 (iv)에서 수득한 액체 생성물 및 이러한 생성물에 (예를 들어, 상청액 또는 침전물로서) 존재하는 식물성 출발 물질을 원심분리하거나, 및/또는 이를 여과 수단으로 통과시켜 (제1 여과), 고체 부분 (고체 잔류물)은 체류시키고 액체 상은 통과시킨다.
단계 (vi)에서, 단계 (v)에 이어, 원심분리 및/또는 여과에 의해 수득한 액체 상을 단계 (vi.a)를 통해 가공 처리하고, 및/또는 고체 잔류물을 단계 (vi.b), (vi.c), (vi.d) 및 (vi.e)를 통해 가공 처리한다.
바람직한 단계 (vi.a)에서, 단계 (v)에서 수득한 액체 상을 건조시키고, 선택적으로 농축 및 건조하여, 10 kDa 내지 600 kDa으로 구성되는 중량 평균 분자량의 히알루론산 또는 이의 염을 수득한다.
단계 (vi.a)에서 건조하는, 바람직하게는 농축 및 건조하는 액체 상은 20-25℃로 냉각시 바람직하게는 침전물이 없어야 한다. 따라서, 침전물의 존재시, 단계 (v)에서 수득한 액체 상은 단계 (vi.a)에 앞서 추가로 원심분리 및/또는 여과한다.
원심분리 및/또는 여과한 액체 상의 농축은 바람직하게는 60℃ 내지 90℃, 보다 바람직하게는 65℃ 내지 85℃, 보다 더 바람직하게는 70℃ 내지 80℃로 구성되는 온도에서, 예를 들어 70℃, 75℃ 또는 80℃의 온도에서 이루어진다. 농축 단계에서 온도 외에도 지속 시간은 액체 상에 용해된 물질의 원하는 양에 따라 달라진다.
원심분리 및/또는 여과한 액체 상의 농축은 바람직하게는 액체 상 100 ml당 1 g 내지 35 g, 바람직하게는 5 g 내지 25 g, 보다 더 바람직하게는 8 g 내지 18 g으로 구성되는 범위까지 액체 상에 용해된 물질 (HA 포함)의 양을 증가시킨다.
바람직하게는, 농축 단계 (vi.a)에서 수득한 액체 상은 1.01 내지 1.20, 바람직하게는 1.02 내지 1.15, 보다 더 바람직하게는 1.05 내지 1.08로 구성되는 상대 밀도 ([원심분리 및/또는 여과된 액체 상의 밀도]: [농축 종료시 액체 상의 밀도]로 정의됨) 비율을 갖는다.
바람직하게는, 액체 상의 농축은 감압 (약 25℃에서 1 기압 미만), 더 바람직하게는 -1.5 mPa 내지 -0.1 mPa, 보다 더 바람직하게는 -1.0 mPa 내지 -0.5 mPa로 구성되는 압력, 예를 들어 -0.8 mPa의 압력에서 이루어진다.
바람직하게는, 단계 (vi.a)로부터 수득한 HA는 90% 내지 100%, 바람직하게는 95% 내지 99.5%, 보다 더 바람직하게는 97% 내지 99% (%는 예를 들어 HPLC을 이용해 결정됨)로 구성되는 순도 (HA의 총 중량에 대한 중량%)를 갖는다.
바람직한 단계 (vi.b), (vi.c), (vi.d) 및 (vi.e)에서, 단계 (v)의 원심분리 및/또는 여과로부터 수득한 고체 잔류물을 가공 처리하여, 1 kDa 내지 50 kDa으로 구성되는 중량 평균 분자량을 갖는 콘드로이틴 설페이트 또는 염을 수득한다.
바람직한 단계 (vi.b)에서, 단계 (v)의 원심분리 및/또는 여과에 의해 수득한 고체 잔류물을 회수 및 정제해, 1 kDa 내지 50 kDa으로 구성되는 중량 평균 분자량을 갖는 콘드로이틴 또는 이의 염 (CS)을 수득한다.
단계 (vi.b) 이후의 바람직한 단계 (vi.c)(설폰화 (또는 설페이트화) 단계, 콘드로이틴의 이량체에 설페이트 기를 삽입할 수 있는 반응 단계로 의도됨)에서, 고체 잔류물을 황산 공급원 (바람직하게는 황산, 삼산화황 피리딘 착물, 삼산화황 다이메틸-포름아미드 착물 및 이들의 혼합물을 포함하거나 또는 대안적으로 이로 이루어진 군으로부터 선택됨)으로 처리하여, 산성화된 생성물을 수득한다 (설폰화 단계는 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 기술 및 장치에 따라 수행됨).
단계 (vi.c)에서 사용되는 황산 공급원의 양은, 단계 (vi.b)의 고체 잔류물 내 CS의 이당류의 총 함량에 대해 6-콘드로이틴 설페이트가 51% 내지 99%, 또는 약 95±0.5% (바람직하게는 78% 내지 85% 또는 86%)로 구성되는 중량%로 수득되게 하는 양이다.
바람직하게는, 단계 (vi.c)에서는, 단계 (vi.b)로부터 수득한 콘드로이틴 또는 이의 염 (CS) 100 g에 대해 삼산화황 다이메틸-포름아미드 착물 (SO3 DMF) 1 ml 내지 50 ml, 바람직하게는 2 ml 내지 40 ml, 보다 더 바람직하게는 4 ml 내지 30 ml이, 예를 들어 단계 (vi.b)로부터 수득한 콘드로이틴 또는 이의 염 (CS) 100 g에 대해 삼산화황 다이메틸-포름아미드 착물 5 ml, 10 ml, 15 ml, 18 ml, 22 ml 또는 25 ml이 사용된다. 더 바람직하게는, 단계 (vi.b)로부터 수득한 콘드로이틴 또는 이의 염 (CS)에 삼산화황 다이메틸-포름아미드 착물은 여러 단계로 첨가되며, 예를 들어 삼산화황 다이메틸-포름아미드 착물을 2-8 ml 첨가한 다음 8-12 ml을 첨가하고 마지막으로 8-12 ml로 추가로 첨가한다.
단계 (vi.c)의 처리는 20℃ 내지 80℃, 바람직하게는 30℃ 내지 70℃, 보다 더 바람직하게는 40℃ 내지 60℃로 구성되는 온도에서, 1분 내지 4시간, 바람직하게는 10분 내지 120분, 보다 더 바람직하게는 20분 내지 60분으로 구성되는 기간 동안 수행된다. 단계 (vi.d)에서, 단계 (vi.c)로부터 수득한 생성물을 염기성 제제로 중화한다.
따라서, 단계 (vi.d)에서, 단계 (vi.c)의 산성화된 생성물내 여전히 자유로운 황산의 공급원 (즉, 산성화된 생성물에서 콘드로이틴 설페이트로서 콘드로이틴에 결합되지 않은 황산의 공급원)은 염기성 제제로 중화함으로써 제거하여, 중화된 생성물을 수득한다.
본 발명의 설명에서, "중화된" 또는 "중화"라는 표현은 pH 6 내지 8, 바람직하게는 6.4 내지 7.6, 보다 더 바람직하게는 6.6 내지 7.4로 구성되는 pH 값, 예를 들어 pH 7.0±0.2에 도달하는 것을 의미하기 위해 사용된다.
단계 (vi.d)에서 사용되는 염기성 제제는 바람직하게는 무기 염기성 제제이다.
염기성 제제는 바람직하게는 암모니아, 수산화나트륨, 수산화칼륨 및 이들의 혼합물을 포함하거나 또는 대안적으로 이로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 단계 (vi.d)에서 이용가능한 수산화나트륨은 1M, 2M 또는 4M 농도이다.
단계 (vi.d) 다음으로, 바람직한 단계 (vi.e)에서는, 단계 (vi.d)로부터 수득한 중화된 생성물을 농축 및 건조하여, 1 kDa 내지 50 kDa으로 구성되는 중량 평균 분자량의 콘드로이틴 설페이트를 수득한다.
단계 (vi.e)의 농축은 1.0 내지 1.30, 바람직하게는 1.01 내지 1.20, 보다 더 바람직하게는 1.05 내지 1.15로 구성되는 상대 밀도 ([단계 (vi.d)에서 수득한 중화된 생성물의 밀도]: [단계 (vi.e)에서 수득한 농축된 생성물의 밀도]로 정의됨) 비율을 달성한다.
바람직하게는, 단계 (vi.e)의 농축은 투석에 의해 및/또는 진공 농축을 통해 이루어진다.
더 바람직하게는, 투석은 존재할 수 있는 미량의 불순물을 제거하기 위해 투석 백을 이용해 이루어진다.
농축 단계 (vi.e)는, 바람직하게는 단계 (vi.e)로부터 수득한 농축된 생성물의 고형분이 100 ml 당 10 g 내지 60 g, 바람직하게는 100 ml 당 20 g 내지 50 g, 보다 더 바람직하게는 100 ml 당 35 g 내지 45 g 범위, 예를 들어 40 g/100 ml이 될 경우에, 완료된다.
단계 (vi.e)의 건조는, 바람직하게는 진공 오븐을 이용해 단계 (vi.e)의 농축 후 수행된다.
본 발명의 과제를 형성하는 것은, 히알루론산 또는 이의 염 (HA), 히알루로네이트 음이온 염, 및/또는 콘드로이틴 또는 이의 염, 예를 들어 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 염 (CS)을 제조하기 위한, 식물성 출발 물질, 바람직하게는 진균, 보다 바람직하게는 쌍핵균류 아계, 보다 더 바람직하게는 담자균 문, 더 바람직하게는 트레멜라 푸치포르미스 종의 용도이다.
혼합물, 이러한 혼합물의 용도, 이러한 혼합물을 첨가제 또는 부형제 또는 성분 (또는 비-활성 성분)으로서 포함하는 조성물, 의약제로서의 조성물의 용도, 특정 장애 또는 질환 또는 병리의 치료에 있어 조성물의 용도, 상기한 혼합물의 제조 방법 또는 상기한 혼합물을 포함하는 조성물의 제조 방법, 첨가제 또는 부형제 또는 성분으로서 사용을 위한 상기한 조성물의 용도, 및 전술한 식물성 출발 물질에 대한 구현예들은, 당해 기술 분야의 당업자에 의해, 상황에 따라 기술된 특징들에 대한 치환 또는 수정이 적용될 수 있다. 이러한 구현예들은 또한 후술한 청구범위에서 공식화된 보호 범위에 포함되는 것으로 간주되어야 한다.
또한, 임의의 구현예는 기술된 다른 구현예와 독립적으로 구현될 수 있는 것으로 주지하여야 한다.
본 발명에 대한 구현예 (FRn)를 아래에 대략적으로 기술한다:
FR1. 식물성 출발 물질로부터 수득한 글리코스아미노글리칸을 포함하거나 또는 대안적으로 이로 이루어진 혼합물 (M)로서; 상기 글리코스아미노글리칸이 하기를 포함하거나 또는 대안적으로 이로 이루어진 군에서 선택되는, 혼합물 (M):
(a) 10 kDa 내지 600 kDa으로 구성되는 중량 평균 분자량의, 히알루론산 또는 이의 염, 히알루로네이트 음이온 (HA);
(b) 1 kDa 내지 50 kDa으로 구성되는 중량 평균 분자량의 콘드로이틴 또는 이의 염 (CS), 예를 들어 콘드로이틴 설페이트;
(c) (a)와 (b)의 조합.
FR2. 전술한 FR에 있어서,
(a) 히알루론산 또는 이의 염 (HA)은 100 kDa 내지 500 kDa, 바람직하게는 200 kDa 내지 400 kDa으로 구성되는 중량 평균 분자량을 가지며; 및/또는
(b) 콘드로이틴 또는 이의 염 (CS)은 1 kDa 내지 50 kDa, 바람직하게는 3 kDa 내지 40 kDa, 보다 더 바람직하게는 5 kDa 내지 25 kDa으로 구성되는 중량 평균 분자량을 갖는, 혼합물 (M).
FR3. 전술한 FR들 중 어느 하나에 있어서, 상기 식물성 출발 물질이 진균, 바람직하게는 쌍핵균류 아계 (Dikarya subkingdom), 보다 더 바람직하게는 담자균 문 (Basidiomycota Division)의 진균인, 혼합물 (M).
FR4. 전술한 FR에 있어서, 진균이 트레멜라 푸치포르미스 (Tremella fuciformis) 종의 것인, 혼합물 (M).
FR5. 의약품, 의료 기기, 뉴트라슈티컬 제품, 특수 의료용 식품 (FSMP), 식이 보충제 또는 식품의 제조에 있어, 첨가제 또는 부형제 또는 성분으로서의 전술한 FR들 중 어느 하나에 따른 혼합물 (M)의 용도.
FR6. (i) FR1-4 중 어느 하나에 따른 혼합물, 및 (ii) 기술적 첨가제 또는 약학 등급 또는 식품 등급의 부형제를 포함하는, 조성물.
FR7. 의약제로서 사용하기 위한, 전술한 FR에 따른 조성물.
FR8. 관절염, 골관절염, 관절증, 관절 통증, 사지 및 관절의 염증 또는 위식도 역류로부터 선택되는 특정 장애 또는 질환을 가진 인간 또는 동물의 예방 또는 근치적 치료에 사용하기 위한, 및/또는 의약품, 의료 기기, 뉴트라슈티컬 제품, 특수 의료용 식품 (FSMP), 식품 또는 식품 보충제의 제조에 있어 첨가제 또는 부형제 또는 성분으로서 사용하기 위한, FR6에 따른 조성물.
FR9. 히알루론산 또는 히알루로네이트 (HA), 및/또는 콘드로이틴 설페이트 또는 콘드로이틴 (CS)의 제조 방법으로서, 상기 방법은 식물 기원의 출발 물질로부터 히알루론산 또는 히알루로네이트, 및/또는 콘드로이틴 설페이트 또는 콘드로이틴을 추출하는 하나 이상의 단계를 포함하는, 방법.
FR10. 전술한 FR에 있어서, 하기 단계를 포함하는, 방법:
(i) 글리코스아미노글리칸의 식물성 출발 물질로서 하나 이상의 천연 진균을 식별하는 단계;
(ii) 선택적으로, 식물성 출발 물질을 파쇄 또는 분쇄하는 단계;
(iii) 단계 (i) 또는 단계 (ii)에서 수득한 식물성 출발 물질로부터 추출 용매, 바람직하게는 수성 용매, 보다 더 바람직하게는 물을 사용해 글리코스아미노글리칸을 추출하여, 글리코스아미노글리칸의 수성 추출물을 수득하는 단계;
(iv) 단계 (iii)에서 수득한 수성 추출물에 용매, 바람직하게는 에탄올을 첨가하여 액체 생성물을 수득하는 단계;
(v) 단계 (iv)에서 수득한 액체 생성물을 원심분리 및/또는 여과하여 액체 상 (liquid phase) 및 고체 잔류물 (solid residue)을 수득하는 단계;
(vi) 단계 (v)의 원심분리 및/또는 여과에 의해 수득한 액체 상을 하기 단계 (vi.a)를 통해 가공 처리하거나, 및/또는 단계 (v)의 원심분리 및/또는 여과에 의해 수득한 고체 잔류물을 하기 단계 (vi.b), (vi.c), (vi.d) 및 (vi.e)를 통해 가공 처리하는 단계:
(vi.a) 단계 (v)에서 수득한 액체 상을 건조, 바람직하게는 농축 및 건조시켜, 10 kDa 내지 600 kDa으로 구성되는 중량 평균 분자량의 히알루론산 또는 이의 염을 수득하는 단계; 및/또는
(vi.b) 단계 (v)에서 수득한 고체 잔류물을 회수 및 정제하여 1 kDa 내지 50 kDa으로 구성되는 중량 평균 분자량의 콘드로이틴 또는 이의 염 (CS)을 수득하는 단계;
(vi.c) 단계 (vi.b)에서 수득한 콘드로이틴 또는 이의 염 (CS)에 황산 공급원, 바람직하게는 황산, 삼산화황 피리딘 착물, 삼산화황 다이메틸-포름아미드 착물 및 이들의 혼합물을 포함하거나 또는 대안적으로 이들로 이루어진 군에서 선택되는 황산 공급원을 처리하여, 산성화된 생성물을 수득하는 단계;
(vi.d) 단계 (vi.c)에서 수득한 산성화된 생성물을 염기성 제제를 사용하여 중화시켜 중화된 생성물을 수득하는 단계;
(vi.e) 단계 (vi.d)에서 수득한 중화된 생성물을 농축 및 건조하여 1 kDa 내지 50 kDa으로 구성되는 중량 평균 분자량의 콘드로이틴 설페이트를 수득하는 단계.
FR11. 히알루론산 또는 이의 염, 히알루로네이트 음이온 염, 및/또는 콘드로이틴 또는 이의 염, 예를 들어 콘드로이틴 설페이트를 제조하기 위한, 식물성 출발 물질, 바람직하게는 진균, 보다 바람직하게는 쌍핵균류 아계 (Dikarya subkingdom), 보다 더 바람직하게는 담자균 문 (Basidiomycota Division), 더 바람직하게는 트레멜라 푸치포르미스 (Tremella fuciformis) 종의 용도.
본 발명의 공정에 대한 제2 구현예 (간단히, P2)는 히알루론산 또는 이의 염 (HA)을 제조하는 공정에 관한 것으로, 공정은 하기 단계들을 포함하거나 또는 대안적으로는 하기 단계들로 이루어진다:
(i) 히알루론산의 식물성 출발 물질로서 하나 이상의 천연 진균, 예를 들어, 바람직하게는, 쌍핵균류 아계 (Dikarya subkingdom), 바람직하게는 담자균 문 (Basidiomycota Division), 더 바람직하게는 트레멜라 푸치포르미스 (Tremella fuciformis) 종에 속하는 하나 이상의 진균을 포함하거나 또는 대안적으로 이로 이루어진, 건조물 또는 건조된 형태의 하나 이상의 천연 진균을 식별하는 단계;
(ii) 선택적으로, 식물성 출발 물질의 파쇄 또는 분쇄를 수행하는 단계 (평균 입자 크기 분포는 바람직하게는 500 ㎛ 내지 1,800 ㎛, 바람직하게는 700 ㎛ 내지 1,000 ㎛ 범위, 예를 들어 약 20 메쉬 = 841 ㎛임);
(pre-iii) 단계 (i) 또는 단계 (ii)로부터 수득한 식물성 출발 물질을 10℃ 내지 90℃로 구성되는 온도에서, 수성 가수분해 용매, 바람직하게는 물 중에 효소 가수분해를 수행하는 단계로서, 효소, 바람직하게는 단백질 분해효소를 일정 부피의 가수분해 용매에 분산된 식물성 출발 물질에 첨가하여 단계 (pre-iii)의 혼합물을 수득하는 단계;
(iii) 단계 (pre-iii)의 혼합물을, 91℃ 내지 110℃, 바람직하게는 95℃ 내지 110℃, 보다 더 바람직하게는 98℃ 내지 105℃ (예를 들어, 약 100℃ 또는 추출 용매의 끓는점)로 구성되는 온도에서, 수성 추출 용매, 바람직하게는 물을 이용하여 추출하여, 수성 추출물을 수득하는 단계;
(iv) 단계 (iii)에서 수득한 수성 추출물에, 석출 용매 (용매 첨가에 의한 석출), 바람직하게는 알코올성 용매, 보다 바람직하게는 에탄올을 첨가하여, 단계 (iv)의 액체 생성물을 수득하는 단계로서; 바람직하게는, 95% 에탄올을 단계 (iii)에서 수득한 수성 추출물에 2:4, 바람직하게는 3으로 구성되는 부피/부피 비율로 서서히 첨가하여 에탄올로 석출시키고, 8시간 내지 16시간, 예를 들어 약 12시간 동안 교반 하에 유지시키는 단계;
(vii) 단계 (vii.a) 및 선택적으로 단계 (vii.b)를 적용하여, 단계 (iv)의 액체 생성물을 가공 처리하는 단계:
(vii.a) (예를 들어, 증류에 의해 또는 주위 압력보다 낮은 압력 하에 가열함으로써) 석출 용매, 바람직하게는 에탄올을 제거하여, 단계 (vii.a)의 액체 생성물을 수득하는 단계;
(vii.b) (예를 들어, 고체 생성물을 용해하기 위해) 단계 (vii.a)의 액체 생성물에 물을 첨가하여 단계 (vii.b)의 액체 생성물을 수득하는 단계;
(viii) 단계 (vii.b)의 액체 생성물을 건조하는 단계로서, 바람직하게는 농축 및/또는 건조 (예를 들어, 농축 및/또는 건조 및/또는 동결 건조에 의해, 바람직하게는 동결 건조에 의해, 물 및 가능성 있는 잔류 석출 용매 (예를 들어, 에탄올)를 제거)하여, 10 kDa 내지 600 kDa, 바람직하게는 50 kDa 내지 350 kDa, 더 바람직하게는 100 kDa 내지 300 kDa으로 구성되는 중량 평균 분자량을 가지며 생성물 PR1의 총 중량에 대해 85% 내지 약 100%, 바람직하게는 95% 내지 99.5%, 보다 더 바람직하게는 97% 내지 99%로 구성되는 순도 (예를 들어, HPLC에 의해 측정된 %)를 갖는, 히알루론산 또는 이의 염을 포함하거나 또는 대안적으로 이로 이루어진 생성물 PR1을 수득하는 단계.
본 발명의 공정에 대한 제3 구현예 (간단히, P3)는 콘드로이틴 설페이트, 바람직하게는 6-콘드로이틴 설페이트의 제조 공정에 관한 것으로, 공정은 하기 단계들을 포함하거나 또는 대안적으로는 하기 단계들로 이루어진다:
(i) 히알루론산의 식물성 출발 물질로서 하나 이상의 천연 진균, 예를 들어, 바람직하게는, 쌍핵균류 아계 (Dikarya subkingdom), 바람직하게는 담자균 문 (Basidiomycota Division), 더 바람직하게는 트레멜라 푸치포르미스 (Tremella fuciformis) 종에 속하는 하나 이상의 진균을 포함하거나 또는 대안적으로 이로 이루어진, 건조물 또는 건조된 형태의 하나 이상의 천연 진균을 식별하는 단계;
(ii) 선택적으로, 식물성 출발 물질의 파쇄 또는 분쇄를 수행하는 단계 (평균 입자 크기 분포는 바람직하게는 500 ㎛ 내지 1,800 ㎛, 바람직하게는 700 ㎛ 내지 1,000 ㎛ 범위임, 예를 들어 약 20 메쉬 = 841 ㎛임);
(pre-iii) 단계 (i) 또는 단계 (ii)로부터 수득한 식물성 출발 물질을, 10℃ 내지 90℃로 구성되는 온도에서, 수성 가수분해 용매, 바람직하게는 물 중에 효소 가수분해를 수행하는 단계로서, 효소, 바람직하게는 단백질 분해효소를 일정 부피의 가수분해 용매에 분산된 식물성 출발 물질에 첨가하여 단계 (pre-iii)의 혼합물을 수득하는 단계;
(iii) 91℃ 내지 110℃, 바람직하게는 95℃ 내지 110℃, 보다 더 바람직하게는 98℃ 내지 105℃ (예를 들어, 약 100℃ 또는 추출 용매의 끓는점)로 구성되는 온도에서, 수성 추출 용매, 바람직하게는 물을 이용하여 단계 (pre-iii)의 혼합물을 추출하여, 수성 추출물을 수득하는 단계;
(vi.c.) 수성 추출물에 황산 공급원을 처리하여 (설폰화 단계), 단계 (vi.c)의 액체 생성물을 수득하는 단계로서, 황산 공급원은 바람직하게는 황산, 삼산화황 피리딘 착물, 삼산화황 다이메틸-포름아미드 착물 및 이들의 혼합물을 포함하거나 또는 대안적으로 이로 이루어진 군으로부터 선택되고; 보다 바람직하게는 삼산화황 다이메틸포름아미드 착물 (SO3-DMS)인, 단계;
(vi.d) 염기를 첨가하여 단계 (vi.c)의 액체 생성물을 중성 pH까지 중화시켜 중화된 생성물을 수득하는 단계로서, 염기가 바람직하게는 무기 염기, 더 바람직하게는 NaOH, KOH, Ca(OH)2 또는 Mg(OH)2 인, 단계;
(vi.e) 단계 (vi.d)에서 수득한 중화된 생성물을 농축 및 건조하여, 1 kDa 내지 45 kDa 또는 50 kDa (또는 5 kDa 초과 내지 50 kDa 미만), 바람직하게는 3 kDa 내지 40 kDa, 보다 더 바람직하게는 5 kDa 또는 5 kDa 초과 내지 25 kDa 또는 5 kDa 또는 5 kDa 초과 내지 10 kDa으로 구성되는 중량 평균 분자량, 예를 들어 약 5 kDa, 또는 6 kDa, 또는 7 kDa, 또는 8 kDa, 또는 9 kDa, 또는 10 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 염 (간단히, CS)을 포함하거나 또는 대안적으로 이로 이루어진 생성물 PR2를 수득하는 단계.
본 발명의 공정에 대한 제3 구현예 (P3)로부터 수득되는 "콘드로이틴 설페이트 또는 이의 염 (간단히, CS)"이라는 표현은 비-설페이트화된 콘드로이틴과 다양한 가능한 위치에서 모노-, 다이- 및/또는 트리-설페이트화된 콘드로이틴의 조합, 바람직하게는 주로 6-콘드로이틴 설페이트의 조합을 나타내기 위해 사용된다.
대안적으로, 본 발명의 공정에 대한 제3 구현예 (P3)로부터 수득되는 "콘드로이틴 설페이트 또는 이의 염 (간단히, CS)"이라는 표현은 다양한 가능한 위치에서 모노-, 다이- 및/또는 트리-설페이트화된 콘드로이틴 기, 바람직하게는 주로 6-콘드로이틴 설페이트를 나타내기 위해 사용된다.
바람직하게는, 본 발명의 공정에 대한 제3 구현예 (P3)로부터 수득되는 콘드로이틴 설페이트 (CS)는, 기술된 범위 (바람직하게는, 5 kDa 이상 또는 5 kDa 초과 내지 10 kDa, 예를 들어 약 6 kDa 또는 7 kDa 또는 8 kDa 또는 9 kDa)의 중량 평균 분자량을 가지며, 콘드로이틴 설페이트 (CS)의 총 중량에 대해 (또는 콘드로이틴 설페이트에 함유된 이당류의 총량에 대하여) 51% 내지 약 95±0.5%, 바람직하게는 75% 내지 90%, 보다 더 바람직하게는 78% 내지 86%로 구성되는 중량%로 6-콘드로이틴 설페이트를 포함하고, 단계 (vi.e)에서 수득한 생성물 PR2의 총 중량에 대해 80% 내지 99.99% (예를 들어, 94.5%, 94.6%, 94.7%, 94.8% 또는 94.9%)로 구성되는, 바람직하게는 85% 내지 98% (예를 들어, 86%, 87%, 88%, 89% 또는 89.5%), 보다 더 바람직하게는 90% 및 94.9%로 구성되는, 예를 들어 91%, 92%, 93%, 94% 또는 94.5%의 순도 (예를 들어, HPLC 로 측정된 %)를 갖는다.
보다 더 바람직하게는, 본 발명의 공정에 대한 제3 구현예 (P3)로부터 수득되는 콘드로이틴 설페이트 (CS)는, 기재된 범위 (바람직하게는 5 kDa 이상 또는 5 kDa 초과 내지 10 kDa, 예를 들어 약 6 kDa, 또는 7 kDa, 또는 8 kDa, 또는 9 kDa)의 중량 평균 분자량을 가지며, 콘드로이틴 설페이트 (CS)의 총 중량에 대해 (또는 콘드로이틴 설페이트에 함유된 이당류의 총량에 대하여) 51% 내지 약 95±0.5% (바람직하게는 75% 내지 90%, 더 바람직하게는 78% 내지 86%)로 구성되는 중량%로 6-콘드로이틴 설페이트를, 그리고 0.01% 내지 약 5% (바람직하게는 0.05% 내지 3%, 더 바람직하게는 0.1% 내지 1.5%)로 구성되는 중량%로 4-콘드로이틴 설페이트를 포함하고, 단계 (vi.e)로부터 수득한 생성물 PR2의 총 중량에 대해 80% 내지 99.99%로 구성되는, 바람직하게는 85% 내지 98% (예를 들어, 86%, 87%, 88%, 또는 89%), 보다 바람직하게는 90% 및 95%로 구성되는, 예를 들어 91%, 92%, 93%, 94% 또는 94.5%의 순도 (예를 들어, HPLC 로 측정된 %)를 갖는다.
HA 및/또는 CS의 중량 평균 분자량은 당해 기술 분야의 당업자에게 통상적이고 공지된 방법 및 장치에 따라, 예를 들어 고성능 크기 배제 크로마토그래피 (HPSEC)를 통해 계산할 수 있으며; 바람직하게는, HA 및/또는 CS의 중량 평균 분자량은 통합된 특수 겔 투과 크로마토그래피 (GPC) 소프트웨어와 함께 제공되는 HPSEC에 의해 결정할 수 있다.
본 발명의 공정에 대한 제2 및 제3 구현예 (P2 및 P3)에 존재하는 효소 가수분해 단계 (pre-iii)에서, 본 발명에 기술된 바와 같은 식물성 출발 물질에, 효소 (예를 들어, 펙티나제 및/또는 셀룰라제 및/또는 프로테이나제)를, 일정 부피의 가수분해 용매 (예를 들어, 식물성 출발 물질의 중량에 대해 25-100배, 바람직하게는 35-75배, 더 바람직하게는 45-55배 (예를 들어 50배)로 구성되는, 수성 용매 또는 물) 중에 첨가하고, 10℃ 내지 90℃, 바람직하게는 20℃ 내지 65℃, 더 바람직하게는 45℃ 내지 55℃로 구성되는 온도 (예를 들어, 약 50℃)에서, 0.5시간 내지 12시간, 바람직하게는 1시간 내지 8시간, 보다 더 바람직하게는 2시간 내지 6시간 (예를 들어, 약 4시간)으로 구성되는 시간 동안 가열하여, (후술한 바와 같이) 추출 단계 (iii) 또는 1차 추출 단계 (iii.a)에 투입할 단계 (pre-iii)의 혼합물을 수득한다.
또한, 유리하게는, 효소 가수분해 단계 (pre-iii)는 pH 2 내지 9, 바람직하게는 3 내지 5 또는 5 내지 8, 더 바람직하게는 3 내지 4 (예를 들어, 3.5)로 구성되는 효소 가수분해 용액의 pH 값에서 수행되거나; 및/또는 효소 가수분해 단계 (pre-iii)에서 효소의 일정 양 (1%-20%, 또는 2%-10%, 또는 3%-6% 중량/중량 또는 중량/부피의 효소 수용액)은, 추출할 식물성 출발 물질의 질량에 대해 (부피/질량) 또는 대안적으로 가수분해 용매 내 추출할 식물성 출발 물질의 용액의 부피에 대해 (부피/부피) 0.001% 내지 1%, 바람직하게는 0.005% 내지 0.1%, 더 바람직하게는 0.008% 내지 0.05% (예를 들어, 0.01%)로 구성되는 부피 %로 사용된다.
바람직한 예에서, 효소 가수분해 단계 (pre-iii)는 다음과 같은 조건 (대략) 하에 수행된다: 부피 0.01%; 온도 50℃; 실제 pH 3.5; 지속시간 4시간.
제2 및/또는 제3 구현예 (P2 및/또는 P3)의 단계 (pre-iii)에서 사용되는 효소는 펙티나제 및/또는 셀룰라제 및/또는 프로테이나제일 수 있다.
본 발명의 공정에 사용가능한 효소의 예는 다음과 같다:
- 시판 제품 Pectinex® Ultra Tropical, 조성: 효소: 펙틴 리아제 또는 펙티나제, 보존제: 소르빈산칼륨, 안정화제: 수크로스, 글리세롤, 소르비톨, 염화나트륨, 염화칼륨; 화합물 활성도: 펙틴 리아제 또는 펙티나제 (PECTU) = 5,000 PECTU/g; 대략적인 밀도 1.18 (g/ml); 펙틴 리아제는 이의 비-환원 말단에 4-데옥시-6-O-메틸-알파-D-갈락트-4-에뉴로실 (4-deoxy-6-O-methyl-alpha-D-galact-4-enurosyl) 기를 가진 올리고당을 제공하는 (1,4)-알파-D-갈락투로네이트 메틸 에스테르 ((1,4)-alpha-D-galacturonate methyl ester)의 제거 절단을 촉매하는 효소임; 기타 활성: 셀룰라아제, 폴리갈락투로나아제, 베타-글루카나아제 (엔도-1,3 (4)-).
- 시판 제품 Pectinex® Ultra SP-L, 조성 % w/w: 45% 글리세롤 (CAS No.56-81-5), 45% 물 (CAS No.7732-18-5), 5% 폴리갈락투로나아제 (CAS No.9032-75-1; 효소 농도로 정의됨 (건조 중량 기준)), 5% 염화칼륨 (CAS No.7447-40-7), 화합물 활성도: 폴리갈락투로나아제 (PGNU) = 3300 PGNU/g; 대략적인 밀도 1,17 (g/ml); 폴리갈락투로나아제는 펙테이트 및 기타 갈락투로난에서 (1,4)-알파-D-갈락토시듀론 결합 ((1,4)-alpha-D-galactosiduronic bond)을 가수분해하는 효소임.
- 시판 제품 Viscozyme®, 조성 % w/w: 56.8% 물 (CAS No.7732-18-5), 9% 베타-글루카나아제 (엔도-1,3 (4)-)(CAS No.62213-14-3; 효소 농도 (건조 중량 기준)로 정의됨), 24% 수크로스 (CAS No.57-50-1), 10% 염화나트륨 (CAS No.7647-14-5), 0.20% 소르빈산칼륨 (CAS No.24634-61-5); 화합물 활성도: 베타-글루카나아제 (엔도-1,3 (4)-)(FGB) = 100 FBG/g; 대략적인 밀도 1.21 (g/ml); 엔도-베타-글루카나아제는 베타-D-글루칸의 (1,3)- 또는 (1,4)- 결합을 가수분해하는 효소임, 기타 활성: 자일라나제, 셀룰라제, 헤미셀룰라제.
본 발명의 공정에 대한 제2 및 제3 구현예 (P2 및/또는 P3)에서, 추출 단계 (iii)는 바람직하게는 91℃ 내지 110℃로 구성되는 온도 (예를 들어, 약 100℃) 또는 추출 용매의 끓는 온도에서, 0.5시간 내지 12시간, 바람직하게는 1시간 내지 9시간, 더 바람직하게는 1시간 내지 4시간 (예를 들어, 약 2시간 또는 3시간)으로 구성되는 시간 동안, 제1 부피의 추출 용매로 추출하여, 제1 수성 추출물을 얻는 것을 포함하거나 또는 대안적으로 이로 이루어진 1차 추출 단계 (iii.a); 이어서, 90℃ 내지 110℃로 구성되는 온도 (예를 들어, 약 100℃) 또는 추출 용매의 끓는 온도에서 0.5시간 내지 8시간, 바람직하게는 0.5시간 내지 4시간, 더 바람직하게는 1시간 내지 3시간 (예를 들어, 1.5시간, 또는 2시간, 또는 2.5시간)으로 구성되는 시간 동안 제2 부피의 추출 용매로 추출하여 제2 수성 추출물을 얻는 것을 포함하거나 또는 대안적으로 이로 이루어진 2차 추출 단계 (iii.b); 제1 추출물과 제2 추출물을 합쳐 최종 수성 추출물을 수득하고, 선택적으로, 최종 수성 추출물을 농축하여 농축된 수성 추출물을 수득하는 단계 (iii.c)를 포함하거나 또는 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 공정에 대한 제2 및 제3 구현예 (P2 및 P3)에서, 바람직하게는, 1차 추출 (iii.a)에서, 제1 부피의 추출 용매는 식물성 출발 물질의 중량에 대해 25 내지 100배, 바람직하게는 35 내지 65배, 보다 더 바람직하게는 45 내지 55배로 구성되는 양으로 사용되거나, 예를 들어 50배로 사용된다. 예를 들어, 식물성 출발 물질의 중량에 대해 25 내지 100배로 구성되는 제1 부피의 추출 용매를 효소 가수분해 용매의 부피에 첨가하여, 식물 물질의 중량에 대해 50 내지 200배 (예를 들어, 약 100배)로 구성되는 용매 총 부피를 달성한다.
본 발명의 공정에 대한 제2 및 제3 구현예 (P2 및 P3)에서, 바람직하게는, 2차 추출 (iii.b)에서, 제2 부피의 추출 용매는 식물성 출발 물질의 중량에 대해 25 내지 75배, 바람직하게는 35 내지 65배, 더 바람직하게는 45 내지 55배로 구성되는 양 (예를 들어, 50배)으로 사용된다.
본 발명의 공정에 대한 제2 및 제3 구현예 (P2 및 P3)에서, 1차 추출 단계 (iii.a) 후 단계 (iii.a)의 여과를 수행한다: 여과물은 단계 (iii.a)에서 수득한 제1 수성 추출물에 상응하고, 잔류물은 2차 추출 단계 (iii.b)를 거친다. 2차 추출 단계 (iii.b) 후, 여과 단계 (iii.b)가 수행되고 여과물은 단계 (iii.b)에서 수득한 제2 수성 추출물에 상응한다. 예를 들어, 단계 (iii.a) 및 (iii.b)의 여과 (또는 추출 단계 (iii)의 여과)는 140 내지 270 메쉬, 바람직하게는 200 메쉬의 필터를 이용해 수행된다. 선택적으로, 제2 및 제3 구현예 (P2 및 P3)에서, 단계 (iii.a)에서 수득한 제1 수성 추출물과 단계 (iii.b)에서 수득한 제2 수성 추출물을 조합하고, 예를 들어 60℃ 내지 90℃, 바람직하게는 70℃ 내지 80℃, 더 바람직하게는 약 75℃로 구성되는 온도에서, 약 0.8 내지 1.5, 바람직하게는 1.00 내지 1.20 (예를 들어, 약 1.05-1.08)으로 구성되는 상대 밀도까지 진공 농축하는 단계 (iii .c)를 거친다.
본 발명의 공정에 대한 제3 구현예 (P3)에서, 바람직하게는, 단계 (vi.c) (설폰화 단계)에서, 단계 (vi.b)로부터 수득되는 콘드로이틴 또는 이의 염 (CS) 100 g 당 1 ml 내지 50 ml, 바람직하게는 2 ml 내지 40 ml, 보다 더 바람직하게는 4 ml 내지 30 ml로 삼산화황 다이메틸-포름아미드 착물 (SO3 DMF)을, 예를 들어 단계 (vi.b)로부터 수득되는 콘드로이틴 또는 이의 염 (CS) 100 g 당 5 ml, 10 ml, 15 ml, 18 ml, 22 ml 또는 25 ml로 삼산화황 다이메틸-포름아미드 착물을 이용한다. 더 바람직하게는, 단계 (vi.b)에서 수득한 콘드로이틴 또는 이의 염 (CS)에 삼산화황 다이메틸-포름아미드 착물을 여러 단계로 첨가하며, 예를 들어 삼산화황 다이메틸-포름아미드 착물 2 ml 내지 8 ml을 첨가한 다음 8 ml 내지 12 ml을 첨가하고 마지막으로 8 ml 내지 12 ml을 추가로 첨가한다. 단계 (vi.c)의 처리는 20℃ 내지 80℃, 바람직하게는 30℃ 내지 70℃, 보다 더 바람직하게는 40℃ 내지 60℃로 구성되는 온도 (예를 들어, 50℃)에서, 1분 내지 4시간, 바람직하게는 10분 내지 2시간, 보다 더 바람직하게는 20분 내지 60분으로 구성되는 시간 (예를 들어, 약 30분) 동안 이루어진다. 바람직한 예에 따라, 설폰화 단계 (vi.c)는, 40℃ 내지 60℃로 구성되는 온도 (예를 들어, 50℃)에서 20분 내지 60분으로 구성되는 시간 (예를 들어, 약 30분) 동안 SO3-DMF (5 ml, 15 ml, 25 ml)를 단계 (iii), (iii.b) 또는 (iii.c)로부터 유래한 수성 추출물약 100 ml에 첨가함으로써 수행된다 (고형분 10-15 g/100 ml 및 상대 밀도 1.05-1.08).
본 발명의 공정에 대한 제3 구현예 (P3)에서, 바람직하게는 단계 (vi.d)에서 사용되는 염기성 제제는 바람직하게는 암모니아, 수산화나트륨, 수산화칼륨 및 이들의 혼합물을 포함하거나 또는 대안적으로 이로 이루어진 군으로부터 선택되는 무기 염기성 제제, 바람직하게는 수산화나트륨이다 (예를 들어, 1M, 2M 또는 4M 농도).
본 발명의 공정에 대한 제3 구현예 (P3)에서, 바람직하게는, 단계 (vi.e)는 1.3 내지 1.5로 구성되는 상대 밀도, 바람직하게는 약 1.1의 상대 밀도에 도달할 때까지 18시간 내지 36시간, 바람직하게는 24시간의 시간 동안 투석, 예를 들어 1,000 Da 투석 백을 이용한 투석에 의한 막 여과한 다음 건조, 예를 들어 진공 오븐에서의 건조를 포함한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 본 발명의 공정에 대한 제1 및 제3 구현예 (P1 및 P3)에서, 본 발명의 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 염 (CS)은 5 kDa 초과 내지 50 kDa 미만, 바람직하게는 5 kDa 초과 내지 25 kDa으로 구성되는 중량 평균 분자량을 가지며, 다음을 포함한다:
- 50% 내지 95±0.5%, 바람직하게는 75% 내지 90%로 구성되는 중량%의 6-콘드로이틴 설페이트;
- 5% 내지 20%, 바람직하게는 7% 내지 15%로 구성되는 중량%의 비-설페이트화 콘드로이틴;
- 0.1% 내지 10%, 바람직하게는 0.2% 내지 8%로 구성되는 중량%의 2,6-콘드로이틴 다이설페이트; 및
- 0.01% 내지 5%, 바람직하게는 0.05% 내지 3%로 구성되는 중량%의 4-콘드로이틴 설페이트, 모든 %는 콘드로이틴 설페이트에 함유된 이당류의 총량에 대해 또는 콘드로이틴 설페이트의 총 중량에 대해 표시됨.
본 발명의 바람직한 측면에서, 본 발명의 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 염 (CS)(공정 P1 및/또는 P3)은 5 kDa 초과 내지 10 kDa으로 구성되는 중량 평균 분자량을 가지며, 콘드로이틴은 설페이트 또는 이의 염은 다음을 포함한다:
- 78% 내지 86%로 구성되는 중량%의 6-콘드로이틴 설페이트;
- 8% 내지 13%로 구성되는 중량%의 비-설페이트화 콘드로이틴;
- 0.3% 내지 5%로 구성되는 중량%의 2,6-콘드로이틴 다이설페이트; 및
- 0.1% 내지 1.5%로 구성되는 중량%의 4-콘드로이틴 설페이트, 모든 %는 콘드로이틴 설페이트에 함유된 이당류의 총량에 대해 또는 콘드로이틴 설페이트의 총 중량에 대해 표시됨.
본 발명의 바람직한 측면에서, 본 발명의 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 염 (CS)(공정 P1 및/또는 P3)은 5 kDa 초과 내지 50 kDa 미만, 바람직하게는 5 kDa 초과 내지 25 kDa 미만으로 구성되는 중량 평균 분자량을 가지며, 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 염은 다음을 포함한다:
- 50% 내지 95±0.5%, 바람직하게는 75% 내지 90%로 구성되는 중량%의 6-콘드로이틴 설페이트; 및
- 0.01% 내지 5%, 바람직하게는 0.05% 내지 3%로 구성되는 중량%의 4-콘드로이틴 설페이트, 모든 %는 콘드로이틴 설페이트에 함유된 이당류의 총량에 대해 또는 콘드로이틴 설페이트의 총 중량에 대해 표시됨.
본 발명의 추가의 바람직한 측면에서, 본 발명의 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 염 (CS) (공정 P1 및/또는 P3)은 5 kDa 초과 내지 10 kDa으로 구성되는 중량 평균 분자량을 가지며, 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 염은 다음을 포함한다:
- 78% 내지 86%로 구성되는 중량%의 6-콘드로이틴 설페이트; 및
- 0.1% 내지 1.5%로 구성되는 중량%의 4-콘드로이틴 설페이트, 모든 %는 콘드로이틴 설페이트에 함유된 이당류의 총량에 대해 또는 콘드로이틴 설페이트의 총 중량에 대해 표시됨.
본 발명의 추가의 바람직한 측면에서, 본 발명의 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 염 (CS)(공정 P1 및/또는 P3)은 5 kDa 초과 내지 50 kDa 미만, 바람직하게는 5 kDa 초과 내지 25 kDa 미만의 중량 평균 분자량을 가지며, 다음을 포함한다:
- 50% 내지 95±0.5%, 바람직하게는 75% 내지 90%로 구성되는 중량%의 6-콘드로이틴 설페이트;
- 5% 내지 20%, 바람직하게는 7% 내지 15%로 구성되는 중량%의 비-설페이트화 콘드로이틴;
- 0.1% 내지 10%, 바람직하게는 0.2% 내지 8%로 구성되는 중량%의 2,6-콘드로이틴 다이설페이트;
- 0.01% 내지 5%, 바람직하게는 0.05% 내지 3%로 구성되는 중량%의 4-콘드로이틴 설페이트;
- 0.01% 내지 5%, 바람직하게는 0.05% 내지 3%로 구성되는 중량%의 4,6-콘드로이틴 다이설페이트; 및
- 0.01% 내지 5%, 바람직하게는 0.05% 내지 3%로 구성되는 중량%의 2,4-콘드로이틴 다이설페이트, 모든 %는 콘드로이틴 설페이트에 함유된 이당류의 총량에 대해 또는 콘드로이틴 설페이트의 총 중량에 대해 표시됨.
일 구현예에서, 본 발명의 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 염 (CS)(공정 P1 및/또는 P3)은 5 kDa 초과 내지 10 kDa으로 구성되는 중량 평균 분자량을 가지며, 콘드로이틴 설페이트 또는 염은 다음을 포함한다:
- 78% 내지 86%로 구성되는 중량%의 6-콘드로이틴 설페이트;
- 8% 내지 13%로 구성되는 중량%의 비-설페이트화 콘드로이틴;
- 0.3% 내지 5%로 구성되는 중량%의 2,6-콘드로이틴 다이설페이트; 및, 또한
- 각각 0.1% 내지 1.5%로 구성되는 중량%의, 4-콘드로이틴 설페이트, 4,6-콘드로이틴 다이설페이트 및 2,4-콘드로이틴 다이설페이트.
실험 파트
I. 제2 구현예 (P2)에 따른 히알루론산의 제조 방법.
(I) 트레멜라 푸치포르미스 (Tremella fuciformis) 종에 속하는 건조된 진균을 준비하고,
(ii) 그라인딩 (grinding)에 의해 상기 건조된 진균 (약 20 메쉬)을 파쇄 또는 분쇄하여 파쇄/분쇄된 건조 진균을 수득하고,
(pre-iii) 펙티나제를 효소로 사용하여, 파쇄/분쇄된 건조 진균 및 효소 펙티나제 (Pectinex® Ultra Tropical, 부피 0.01%)에 증류수 (50 부피/중량)를 첨가하고, 약 50℃에서 약 3시간 동안 가열하여 효소 가수분해를 수행함으로써 가수분해 혼합물을 수득하고;
(iii. a) 가수분해 혼합물에 증류수 (50 부피/중량)를 첨가하고 약 100℃에서 약 2.5시간 동안 가열 (끓임)하고 200 mesh 체로 여과하고 여과물과 고체 잔류물을 수집함으로써, 1차 추출을 수행하고;
(iii.b) 증류수 (50 부피/중량)를 첨가하고 약 100℃에서 약 2시간 동안 가열 (끓임)하고, 이어서 200 mesh 체로 여과하고 여과물을 수집함으로써, 1차 추출 (iii.a)로부터 수득한 상기 고체 잔류물에 대해 2차 추출을 수행하고; 및 1차 추출 (iii.a)로부터 수득한 여과물을 2차 추출 (iii.b)로부터 수득한 여과물과 합쳐 수성 추출물을 수득하고;
(iii.c) 수성 추출물을 약 75℃에서 농축하여 상대 밀도가 약 1.05인 농축된 수성 추출물을 수득하고; 이어서
(iv) 교반 하에, 농축된 수성 추출물에 95% 에탄올 (부피/부피 = 3)을 서서히 첨가하여 12시간 동안 방치하고; 에탄올을 제거하고 추출물을 보관하고;
(vii) 추출물에 증류수를 첨가하고 동결 건조하여, 100 내지 300 kDa의 평균 분자량 및 생성물 PR1의 총 중량에 대해 95% 내지 99%로 구성되는 중량%의 순도를 갖는 히알루론산 또는 이의 염 (HA)을 포함하거나 또는 대안적으로 이로 이루어진 생성물 PR1을 수득한다.
II. 제3 구현예 (P3)에 따른 콘드로이틴 설페이트의 제조 방법.
(i) 트레멜라 푸치포르미스 (Tremella fuciformis) 종에 속하는 건조된 진균을 준비하고;
(ii) 그라인딩에 의해 상기 건조된 진균을 파쇄 또는 분쇄하여 (약 20 메쉬의) 파쇄/분쇄된 건조 진균을 수득하고;
(pre-iii) 펙티나제를 효소로 사용하여, 파쇄/분쇄된 건조 진균 및 효소 펙티나제 (Pectinex® Ultra Tropical, 부피 0.01%)에 증류수 (50 부피/중량)를 첨가하고, 약 50℃에서 약 2시간 동안 가열하여 효소 가수분해를 수행함으로써, 가수분해 혼합물을 수득하고 (pH 5 내지 7);
(iii.a) 가수분해 혼합물에 증류수 (50 부피/중량)를 첨가하고 약 100℃에서 약 2.5시간 동안 가열 (끓임)하고, 이어서 200 mesh 체로 여과하고 (필요한 경우, 여과 전에 원심분리함) 여과물 및 고체 잔류물을 수집함으로써 1차 추출을 수행하고;
(iii.b) 증류수 (50 부피/중량)를 첨가하고 약 100℃에서 약 1.5시간 동안 가열 (끓임)하고, 이어서 200 mesh 체로 여과하고 여과물을 수집함으로써 1차 추출로부터 수득한 고체 잔류물에 대해 2차 추출을 수행하고; 및 1차 추출 (iii.a)에서 수득한 여과물을 2차 추출 (iii.b)에서 수득한 여과물과 조합하여 수성 추출물을 수득하고;
(iii.c) 수성 추출물을 약 75℃에서 농축하여 상대 밀도가 약 1.05-1.08인 농축된 수성 추출물을 수득하고; 이어서
(vi.c) 농축된 수성 추출물 100 ml 당 SO3 DMF 5 ml, 15 ml, 55 ml을 첨가하여 약 75℃에서 약 30분 동안 설폰화 (또는 설페이트화) 반응을 수행하고;
(vi.d) NaOH로 pH 최대 약 7으로 중화하고;
(vi.e) 수득한 용액을 약 1.1의 상대 밀도에 도달할 때까지 적어도 24시간 동안 투석 백 (1,000 Da)에 넣는다. 진공 오븐에서 건조시켜, 5 kDa 초과 내지 10 kDa (예를 들어, 약 8 kDa)으로 구성되는 평균 분자량을 갖는 콘드로이틴 설페이트 또는 이의 염 (CS)을 포함하거나 또는 대안적으로 이로 이루어진 생성물 PR2를 수득하며, 여기서 CS는 표 1에 기재된 화합물 CS.1과 유사한 조성을 가지며 생성물 PR2의 총 중량에 대해 89 중량% 내지 94.5 중량%로 구성되는 순도를 갖는다.
Claims (8)
- 하기 단계들을 포함하는, 히알루론산 또는 이의 염의 제조 방법:
(i) 쌍핵균류 아계 (Dikarya subkingdom), 바람직하게는 담자균 문 (Basidiomycota Division)에 속하는 하나 이상의 천연 진균을 포함하거나 또는 대안적으로 이로 이루어진 식물 기원의 물질을 식별하는 단계;
(ii) 선택적으로, 식물성 출발 물질을 파쇄 또는 분쇄하여, 파쇄 또는 분쇄된 식물 기원의 출발 물질을 수득하는 단계;
(pre-iii) 단계 (i) 또는 단계 (ii)로부터 수득한 식물성 출발 물질을 수성 가수분해 용매, 바람직하게는 수 중에서, 10-90℃ 범위의 온도에서 효소적 가수분해를 수행하는 단계로서, 가수분해 용매의 부피에 분산된 식물성 출발 물질에 효소, 바람직하게는 단백질분해 효소를 첨가하여, 단계 (pre-iii)의 혼합물을 수득하는, 단계;
(iii) 상기 단계 (pre-iii)의 혼합물에 함유된 식물 기원의 출발 물질을 수성 추출 용매, 바람직하게는 물로, 91-110℃의 범위 또는 끓는 온도에서 추출하여, 수성 추출물을 수득하는 단계;
(iv) 단계 (iii)에서 수득한 수성 추출물에 석출 용매, 바람직하게는 알코올을 첨가하여, 액체 생성물을 수득하는 단계;
(vii) 단계 (iv)에서 수득한 액체 생성물을, 단계 (vii.a) 및 선택적으로, 단계 (vii.b)를 수행함으로써, 가공 처리하는 단계:
(vii. a) 단계 (iv)에서 수득한 액체 생성물로부터, 바람직하게는 15-25℃ 범위의 실온에서 실온보다 낮은 압력 하에 가열함으로써, 석출 용매를 제거하는 단계;
(vii.b) 물을 첨가하여 희석하는 단계;
(viii) 건조, 바람직하게는 농축 및 건조하여, 10 kDa 내지 600 kDa 범위의 중량 평균 분자량을 가진 히알루론산 또는 이의 염을 포함하거나 또는 대안적으로 이로 구성된 생성물 PR2를 수득하는 단계. - 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 진균이 트레멜라 푸치포르미스 (Tremella fuciformis)(Berk. 1856) 종에 속하는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계 (pre-iii)에서 효소는 펙티나제, 셀룰라제, 프로테이나제 및 이들의 혼합물을 포함하거나 또는 대안적으로 이로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출 단계 (iii)가 하기 단계들을 포함하거나 또는 대안적으로 이로 이루어지는, 방법:
(iii. a) 단계 (pre-iii)의 혼합물에 함유된 식물 기원의 물질을, 제1 부피의 추출 용매로 91-110℃ 범위의 온도에서 또는 끓는 온도에서 0.5-12시간 범위의 기간 동안 1차 추출을 수행하여, 제1 수성 추출물과 고체 잔류물을 수득하는 단계; 그 후
(iii.b) 단계 (iii.a)에서 수득한 고체 잔류물을 제2 부피의 추출 용매로 90-110℃ 범위의 온도에서 0.5-8시간 범위의 기간 동안 2차 추출을 수행하여 제2 수성 추출물을 수득하고; 상기 제1 추출물과 제2 추출물을 조합해 제2 수성 추출물을 제조하는 단계; 및 선택적으로,
(iii.c) 상기 제1 수성 추출물과 제2 수성 추출물을 농축하여 농축된 수성 추출물을 수득하는 단계. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소적 가수분해 단계 (pre-iii)에서, 식물성 출발 물질의 중량에 대해 25-100배, 바람직하게는 35-75배 범위의 함량 (중량/중량)으로 수성 용매, 바람직하게는 물이 식물성 출발 물질에 첨가되고, 상기 효소가 0.001% 내지 1%, 바람직하게는 0.005% 내지 0.01% 범위의 부피 %로 첨가되고, 제조되는 혼합물은 10-90℃, 바람직하게는 20-65℃ 범위의 온도까지 0.5-12시간, 바람직하게는 1-8시간 동안 가열하여, 추출 단계 (iii) 또는 제1 추출 단계 (iii.a)에 투입할 단계 (pre-iii)의 혼합물을 수득하는, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법으로 수득되는 히알루론산 또는 이의 염은 중량 평균 분자량이 50 kDa 내지 350 kDa, 바람직하게는 100 kDa 내지 300 kDa 범위인, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (iv)에서 석출 용매가 에탄올인, 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 건조 단계 (viii)가 동결-건조를 포함하거나 또는 대안적으로 이로 구성되는, 방법.
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