CN103014095B

CN103014095B - 戴氏绿僵菌gyya0601菌株用于产透明质酸的用途

Info

Publication number: CN103014095B
Application number: CN201110280577.9A
Authority: CN
Inventors: 肖建辉; 肖代敏; 刘洪美
Original assignee: Affiliated Hospital of Zunyi Medical University
Priority date: 2011-09-21
Filing date: 2011-09-21
Publication date: 2014-08-06
Anticipated expiration: 2031-09-21
Also published as: CN103014095A

Abstract

本发明公开了戴氏绿僵菌MetarhiziumtaiiGYYA0601菌株CGMCCNO.2880用于发酵生产透明质酸的用途，并公开了发酵和分离方法，不仅可以在实验室中实施，也可很方便实现工业化生产，丝状真菌相比链球菌生产透明质酸具有以下几个优点：首先丝状真菌是一种食药用菌，无致病性，不产溶血素，生物安全性高；其次丝状真菌发酵培养基成分简单，不产透明质酸酶，生产成本低；第三，发酵液无需特殊处理，分离工艺简单、方便，制备透明质酸的费用低，戴氏绿僵菌MetarhiziumtaiiGYYA0601菌株的发酵液中透明质酸的含量可达90.0μg/mL。

Description

戴氏绿僵菌GYYA0601菌株用于产透明质酸的用途

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种戴氏绿僵菌GYYA0601菌株用于发酵生产透明质酸的用途以及发酵生产透明质酸的方法。

背景技术

透明质酸(hyaluronic acid，HA)又名玻璃酸，具有高度的保水、润肤及抗菌入侵的保护作用而广泛用作化妆品的添加剂。HA作为一种生化药物，主要用于治疗关节炎、眼科粘性手术、软组织修复以及外科手术后的粘性抑制剂等。HA是由D-葡糖醛酸和乙酰氨基-D-葡萄糖按1∶1的摩尔比组成的、平均分子量一般为50万～500万的酸性粘多糖。在细胞质膜内壁，在HA合成酶作用下，HA由尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡糖(UDP-GlcNAc)和尿苷二磷酸-葡糖醛酸(UDP-GlcA)两前提物合成。HA无种属差异性，无论何种来源，其结构和组成都是一样的，仅存在相对分子质量的差别。通常，以葡糖醛酸含量表示HA的纯度，化妆品级为中等分子量HA分子，含35％～45％的葡糖醛酸，医药级为高分子量HA分子，含42％～48％的葡糖醛酸。

上世纪30年代，美国Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出HA。70年代，Balazs等从鸡冠和人脐带提取HA，并配制成眼科手术用黏弹性辅助剂NIF-HA，开创了HA医学应用的先河。80年代，日本首先借鉴前人对某些链球菌产生HA这一重要发现，通过工业发酵生产HA。当前，HA的生产仍然主要是动物组织提取法和细菌发酵法。动物组织提取法的原料受限、产量低、分离纯化过程复杂(含硫酸软骨素、硫酸葡胺聚糖等多糖杂质)，生产成本高，所获得的HA分子量也较小，不能满足市场需求。而细菌发酵法具有生产规模不受动物原料限制，发酵液中HA以游离状态存在，易于分离纯化，成本低，易于形成规模化工业生产，无动物来源的致病病毒污染的危险等优点。

细菌发酵生产使用的菌种主要归属于链球菌Streptococcus sp.，它有血清A型和C型，A型为人致病菌，C型为动物致病菌。目前生产菌种多为C型兽疫链球菌S.zooepidemicu。尽管细菌发酵具有动物组织提取无可比拟的优势，但链球菌发酵尚存不足：其一，链球菌多为病原菌或机会病原菌，发酵生产存在潜在危害；其二，链球菌的营养需求较高，大规模生产中用这些特殊成分作为培养基，成本太高。其三，HA发酵下游分离纯化时，需要杀灭和除去发酵液中的菌体，杀灭菌体常采用杀菌剂或高温处理，这将影响HA的分子构象和流变学特性。其四，因发酵液的黏度很高，直接过滤或离心除菌体非常困难，需要先进行稀释，再除去菌体，因此，发酵下游分离技术烦琐，增加成本。另外，链球菌是原核生物，兼性厌氧菌，不利于葡萄糖能量代谢转化更多的ATP，从而影响UTP合成及其相应合成HA的两前提物UDP-GlcNAc、UDP-GlcA的生成。因此，寻找新的生产菌种有较高的科学价值和现实意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服当前生产透明质酸方法的不足，提供一种真菌戴氏绿僵菌GYYA0601菌株用于发酵生产透明质酸的用途以及透明质酸的发酵生产方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：

本发明提供了戴氏绿僵菌Metarhizium taii GYYA0601菌株CGMCC NO.2880用于发酵生产透明质酸的用途。戴氏绿僵菌Metarhizium taiiGYYA0601菌株是发明人在贵州省贵阳市羊艾茶场土壤中采集一种虫草，利用多途径多批次和次生子囊孢子微循环产孢方法(参见梁宗琦.中国真菌志(第23卷)虫草属.北京：科学出版社，2007.)分离培养获得二十余株菌株，所采的虫草和分离获得的菌株经鉴定为戴氏虫草Cordyceps taii和戴氏绿僵菌Metarhizium taii。GYYA0601菌株已于2009年1月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，保藏编号为CGMCC No.2880，分类命名为戴氏绿僵菌，拉丁文学名为Metarhiziumtaii。

本发明还提供了透明质酸的发酵生产方法，以戴氏绿僵菌Metarhizium taiiGYYA0601菌株CGMCC NO.2880为菌种采用如下发酵方法制备透明质酸：

(1)菌种活化：将菌种接种于斜面菌种培养基上活化；

(2)摇瓶种子制备：挑取菌丝块到种子培养液中，26～30℃、转速150～200r/min培养3～5天；

(3)发酵：接种摇瓶种子到发酵培养基中，26～30℃、转速150～200r/min培养7～10天，终止发酵，去除菌丝体，获得含透明质酸的发酵液；

(4)分离：调整发酵液的pH值为8.0，加入胰蛋白酶在30～35℃酶解3～5小时，调整pH至6.8～7.2，加入乙醇搅拌后收集沉淀，将沉淀溶于去离子水，滤过，滤液加入乙醇搅拌，静置收集沉淀，用无水乙醇洗涤后再用丙酮洗涤，真空干燥，得透明质酸。

进一步的，上述发酵生产方法中，步骤(4)所述分离为：调整1体积倍发酵液的pH值为8.0，按0.05g/100ml发酵液的比例加入胰蛋白酶，在30～35℃酶解3～5小时，调整pH至6.8～7.2，加入3～5体积倍的无水乙醇搅拌后收集沉淀，将沉淀溶于1体积倍的去离子水，滤过，滤液加入2～4体积倍无水乙醇搅拌，静置收集沉淀，用无水乙醇洗涤后再用丙酮洗涤，60℃真空干燥，得透明质酸。

前述生产方法中，采用普通的培养基培养，发酵液中透明质酸的含量可达31.3μg/mL，而采用如下优选的培养基，发酵液中透明质酸的含量可达90.0μg/mL，优选培养基具体为：

步骤(1)中所述斜面菌种培养基为：蔗糖25g/L、黄豆3g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨2g/L、麦麸3g/L、KH₂PO₄ 1g/L、MgSO₄ 0.5g/L、琼脂18g/L、pH 6.0。步骤(2)中所述种子培养液为：蔗糖15g/L、蛋白胨4g/L、酵母膏2g/L、麦麸5g/L、KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄0.5g/L、pH 6.0。步骤(3)中所述发酵培养基为：甘露糖15～30g，牛肉蛋白胨3～9g，酵母膏0.5～2g，磷酸二氢钾0.5～2.0g，碳酸氢钠0.5～1.5g，初始pH 5～8，蒸馏水1L。

上述的各种培养基也是发明人经过实验而优选出来的：乳糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、可溶性淀粉、木糖、糖蜜、甘露糖、葡萄糖等可用作GYYA0601菌株发酵生产透明质酸的碳源，并优选使用甘露糖；黄豆浆、蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨、鱼蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、牛肉膏、硝酸钠、草酸铵、(NH₄)H₂PO₄、蚕蛹粉可用作GYYA0601菌株发酵生产透明质酸的氮源，并优选牛肉蛋白胨；FeSO₄、Fe₂(SO₄)₃、CaCl₂、KCl、碳酸氢钠、酒石酸钾钠、ZnSO₄、ZnCl₂可用作GYYA0601菌株发酵生产透明质酸的无机盐，并优选碳酸氢钠；酸碱度pH5～8可用作GYYA0601菌株发酵生产透明质酸的初始发酵微环境，并优选pH8。最终确定每1升培养基包括甘露糖15～30g，牛肉蛋白胨3～9g，酵母膏0.5～2g，磷酸二氢钾0.5～2.0g，碳酸氢钠0.5～1.5g，初始酸碱度pH5～8。Metarhizium taii GYYA0601菌株在摇床转速150～200r/min，26～30℃培养7～10天，采用硫酸咔唑法测定其发酵液中透明质酸的含量可达90.0μg/mL。

与现有技术相比，本发明采用丝状真菌戴氏绿僵菌Metarhizium taiiGYYA0601菌株CGMCC NO.2880来发酵生产透明质酸，不仅可以在实验室中实施，也可很方便实现工业化生产，丝状真菌相比链球菌生产透明质酸具有以下几个优点：首先丝状真菌是一种食药用菌，无致病性，不产溶血素，生物安全性高；其次丝状真菌发酵培养基成分简单，不产透明质酸酶，生产成本低；第三，发酵液无需特殊处理，分离工艺简单、方便，制备透明质酸的费用低，戴氏绿僵菌Metarhizium taii GYYA0601菌株的发酵液中透明质酸的含量可达90.0μg/mL。

附图说明

本发明的戴氏绿僵菌(Metarhizium taii)已于2009年1月16号保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.2880。

图1为透明质酸红外光谱图，A为透明质酸标准化学品；B为戴氏绿僵菌GYYA0601菌株发酵生产的样品。

具体实施方式

在贵州省贵阳市羊艾茶场采集到一种虫草，置于无菌试管中，带回实验室按以下两种方法分离和培养。

方法一：根据组织分离法(方中达，植物病原研究法(第3版).北京：中国农业出版社，1998)，将采集到的虫草用水清洗表面泥污，阴干，分别用无菌小刀把菌核和子实体切开，从中用无菌接种针挑取小块组织，70％酒精或0.1％升汞液消毒，无菌蒸馏水清洗2-3次后置入PDA培养基平板，25-28℃培养2-4天，挑取单菌落，即获得纯培养GYYA0601菌株CGMCC No.2880。置于斜面菌种培养基(蔗糖25g/L、黄豆3g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨2g/L、麦麸3g/L、KH₂PO₄ 1g/L、MgSO₄0.5g/L、琼脂18g/L、pH6.0，蒸馏水1L)上备用。

方法二、根据次生子囊孢子微循环法分离(参见梁宗琦.中国真菌志(第23卷)虫草属.北京：科学出版社，2007.)。表面消毒虫草，让其子实体中的子囊自动弹射子囊孢子到PDA培养基平板中，25-28℃培养2-4天，挑取单菌落，即获得纯培养菌株。从6根虫草中一共分离到21株纯培养GYYA0601菌株CGMCCNo.2880，置于斜面菌种培养基(蔗糖25g/L、黄豆3g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨2g/L、麦麸3g/L、KH₂PO₄1g/L、MgSO₄0.5g/L、琼脂18g/L、pH6.0，蒸馏水1L)上备用。

所述GYYA0601菌株CGMCC No.2880具有如下的微生物学特征：

1、形态学特性

(1)无性世代：菌丝有隔无色至暗色，平展。菌落中央白色，外围产孢结构及分生孢子形成明显的8～10条墨绿色环带。分生孢子瓶梗(8.0～22.5μm×0.9～1.8μm)近柱形，具短尖，单生于气生菌丝或紧密地轮生于分生孢子梗或原瓶梗上，也可通过微循环产孢直接从次生子囊孢子上产生。分生孢子(3.9～13.1μm×2.4～3.2μm)多串生，柱状，中部稍缢缩，两端圆或一端稍细，未见双生孢子。由次生子囊孢子微循环产孢形成的分生孢子，形状大小基本与前者相同。

(2)有性世代：戴氏绿僵菌GYYA0601菌株是戴氏虫草Cordyceps taii(参见梁宗琦.中国真菌志(第23卷)虫草属.北京：科学出版社，2007.)。

2、培养性状

(1)查氏(Czapek Dox)培养基，28℃培养3天、5天、7天、9天、11天、13天的菌落直径分别为0.98cm、1.70cm、2.50cm、3.05cm、3.80cm、4.45cm，13天时的菌落中央部分为黄绿色，微隆起，周边大部分(4/5面积)为墨绿至草绿色产孢结构及孢子，粒状，环带不明显，菌落边缘菌丝乳白至淡乳黄，绒状，平展。背面中央近芥黄，边缘乳白色。

(2)PDA培养基，28℃培养3天、5天、7天、9天、11天、13天的菌落直径分别为1.21cm、2.15cm、3.10cm、4.25cm、5.35cm、5.78cm，13天时的菌落有8～10条鲜明的墨绿色产孢环带，粒状，最外层环带为淡黄绿至乳黄色，菌落边缘，由里朝外菌丝层绒状、平展，乳黄至乳白色，最边缘的菌落成白色蜡状平展。背面中央色深，深黄褐至芥黄。

(3)沙氏(Sabouraud’s)培养基，28℃培养3天、5天、7天、9天、11天、13天的菌落直径分别为1.21cm、2.03cm、3.13cm、3.85cm、4.45cm、5.25cm，13天时的菌落平展，有5～6条不同颜色的产孢环带，中央白色，近中央微隆起，米黄至黄绿色，周围是草绿粒状物环带，然后是土黄、棕黄和黄绿的粒状物环带相间，产孢环带外围乳白至乳黄绒状菌丝层，最外缘对光看有蜡状晕圈。菌落平板背面芥黄，中央皱缩。

3、生理特性

Metarhizium taii GYYA0601菌株(CGMCC NO.2880)产孢能力强，培养5-7天后均能产生大量孢子，且无需特殊培养基。

4、代谢特性

Metarhizium taii GYYA0601菌株(CGMCC N0.2880)能代谢生成具广谱抗生活性的抗生素。

实施例1：采用上述菌株制备透明质酸

Metarhizium taii GYYA0601菌株CGMCC No.2880移植到斜面菌种培养基(蔗糖25g/L、黄豆3g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨2g/L、麦麸3g/L、KH₂PO₄ 1g/L、MgSO₄ 0.5g/L、琼脂18g/L、pH 6.0)上，24～28℃培养7～15天，接着挑取菌丝块到摇瓶种子培养液(蔗糖15g/L、蛋白胨4g/L、酵母膏2g/L、麦麸5g/L、KH₂PO₄1g/L，MgSO₄0.5g/L、pH 6.0)中，26～30℃、转速150～200r/min培养3～5天，按3～5％的体积比接种到发酵培养基(甘露糖15～30g，牛肉蛋白胨3～9g，酵母膏0.5～2g，磷酸二氢钾0.5～2.0g，碳酸氢钠0.5～1.5g，初始pH5～8，蒸馏水1L)中，摇床转速150～200r/min，26-30℃培养7～10天，终止发酵，抽滤去除菌丝体，获得发酵液，发酵液中含有透明质酸。采用硫酸咔唑法测定GYYA0601菌株CGMCC No.2880发酵液中透明质酸的含量为90.0μg/mL。

透明质酸的分离制备：调整1体积倍发酵液的pH值为8.0，按0.05g/100ml发酵液的比例加入胰蛋白酶，在30～35℃酶解3～5小时，调整pH至6.8～7.2，加入3～5体积倍的乙醇搅拌后收集沉淀，将沉淀溶于1体积倍的去离子水，采用50000Da透析袋去离子水透析或者超滤膜进行超滤，透析袋内液或滤液加入2～4体积倍乙醇搅拌，静置收集沉淀，用无水乙醇洗涤2次，再用丙酮洗涤1次，真空干燥，得透明质酸。所得透明质酸能被透明质酸酶水解，其光谱学特征与透明质酸标准品一致(见图1)。

Claims

1.戴氏绿僵菌Metarhizium taii GYYA0601菌株 CGMCC NO.2880 用于发酵生产透明质酸的用途。

2.透明质酸的发酵生产方法，其特征在于：以戴氏绿僵菌Metarhizium taii GYYA0601菌株 CGMCC NO.2880为菌种采用如下方法制备透明质酸：

（1）菌种活化：将菌种接种于斜面菌种培养基上活化；

（2）摇瓶种子制备：挑取菌丝块到种子培养液中，26～30℃、转速150～200r/min培养3～5天；

（3）发酵：接种摇瓶种子到发酵培养基中，26～30℃、转速150～200r/min培养7～10天，终止发酵，去除菌丝体，获得含透明质酸的发酵液；

（4）分离：调整发酵液的pH值为8.0，加入胰蛋白酶在30～35℃酶解3～5小时，调整pH至6.8～7.2，加入乙醇搅拌后收集沉淀，将沉淀溶于去离子水，滤过，滤液加入乙醇搅拌，静置收集沉淀，用无水乙醇洗涤后再用丙酮洗涤，真空干燥，得透明质酸。

3.按照权利要求2所述透明质酸的发酵生产方法，其特征在于：步骤（4）所述分离为：调整1体积倍发酵液的pH值为8.0，按0.05g/100ml发酵液的比例加入胰蛋白酶，在30～35℃酶解3～5小时，调整pH至6.8～7.2，加入3～5体积倍的无水乙醇搅拌后收集沉淀，将沉淀溶于1体积倍的去离子水，滤过，滤液加入2～4体积倍无水乙醇搅拌，静置收集沉淀，用无水乙醇洗涤后再用丙酮洗涤，60℃真空干燥，得透明质酸。

4.按照权利要求2所述透明质酸的发酵生产方法，其特征在于：步骤（1）中所述斜面菌种培养基为：蔗糖25g/L、黄豆3g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨2g/L、麦麸3g/L、KH₂PO₄ 1g/L、MgSO₄ 0.5g/L、琼脂18g/L、pH 6.0。

5.按照权利要求2所述透明质酸的发酵生产方法，其特征在于：步骤（2）中所述种子培养液为：蔗糖15g/L、蛋白胨4g/L、酵母膏2g/L、麦麸5g/L、KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄0.5g/L、pH 6.0。

6.按照权利要求2所述透明质酸的发酵生产方法，其特征在于：步骤（3）中所述发酵培养基为：甘露糖15～30g，牛肉蛋白胨3～9g，酵母膏0.5～2g, 磷酸二氢钾0.5～2.0g, 碳酸氢钠0.5～1.5g，初始pH 5～8, 蒸馏水 1L。