CN1281113C - 大规模液体深层发酵生产亮菌菌丝体菌粉及其多糖工艺 - Google Patents
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Abstract
大规模液体深层发酵生产亮菌菌丝体菌粉及其多糖工艺。本发明以大规模液体深层发酵生产亮菌菌丝体菌粉及其多糖为目标，以山东金乡真菌研究所亮菌真菌为出发菌株，采用斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养和三级发酵培养，最终发酵罐体积达10000L-15000L。利用本发酵工艺，在10000L-15000L发酵罐中发酵，发酵液中菌丝体以干重计可达2-3%，干菌粉中多糖含量可达12-18%。如需获取其菌粉，则将发酵液在发酵罐内高速打碎，经浓缩灭菌后，无菌喷雾干燥得菌粉。如需获取其多糖，则将终了发酵液温度加热到90-100℃，搅拌速度为200-250rpm/min，维持2-4小时，用泵将发酵液输送到贮罐中，经板框压滤得到亮菌多糖。
Description
技术领域
本发明涉及一种大规模液体深层发酵生产亮菌菌丝体菌粉及其多糖工艺。
技术背景
亮菌(Armillariella tabescens(Scop.：Fr.)Sing)，英文名Ringles HoneyMushroom，又名发光小蜜环菌、易逝杯伞，属蘑菇目，口蘑菌科，小蜜环菌属。菌盖扁半球形，后渐平展，中部下凹，直径2-7厘米，表面蜜黄色至深蛋壳色，四周较中部色稍浅，有较密的浅朽叶色、黑褐色的毛状小鳞片，边缘完全，有不明显的条纹；菌褶淡肉色，稍稀，长短不一，与菌柄近延生；菌肉白色至白黄色，中部厚，边缘薄，味淡，可口。菌柄圆柱形，长5-12厘米，粗3-8毫米，基部浅棕灰色至深棕灰色，上部色稍淡呈蛋壳色，初时有细绒毛状鳞片，老熟时变得光滑，纤维质，内部松软；孢子广椭圆形，无色，光滑，7.5-10微米×5.3-7.5微米，无拟淀粉性反应，孢子印白色。菌丝能发浅蓝色的荧光。该菌与小蜜环不同之处在于菌盖不粘，无菌环，菌索扁平呈鹿角状。夏秋季生于阔叶树的桩上或树干基部，导致根腐，丛生。在云南、四川、河南、福建、浙江、安徽、河北有分布。
据分析，该菌100克干品含蛋白质18.3克，脂肪1.9克，碳水化合物58.9克，热量329千卡，磷400毫克，核黄素3.96毫克。该菌的菌丝及菌素含有蜜环菌香豆素(即蜜环菌甲素)、麦角甾醇等，其发酵产物制剂有治疗胆囊炎及传染性肝炎的作用。
目前市场上的亮菌制剂是采用亮菌固体培养方式生产，存在生产周期长，生产效率低和容易染菌等缺点。采用三级液体发酵工艺可以快速、大量的生产亮菌菌丝体及其多糖，比固体发酵有较大优势。目前尚未见采用三级液体发酵工艺大规模生产亮菌菌丝体菌粉及其多糖的报道。
发明内容
本发明的目的是以生产亮菌菌丝体菌粉和多糖为目标，发明一种廉价高效的亮菌菌丝体菌粉及其多糖的大规模液体深层发酵工艺，为今后的产业化应用打下基础。
实现本发明的技术方案：以亮菌真菌为出发菌株，采用斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养和三级发酵培养。本菌株购自山东金乡真菌研究所。
实现本发明的具体步骤如下：
(1)取出斜面菌种接入配制的新鲜斜面培养基中，培养温度28-30℃，培养150-180小时。
(2)将步骤1中的斜面菌种转接入装有摇瓶培养基的摇瓶中，28-30℃培养，转速120-180rpm/min，培养96-120小时后进行摇瓶的扩大培养。
(3)将步骤2中的摇瓶菌种转接入装有摇瓶扩大培养基的摇瓶再进行扩大培养，28-30℃培养，转速120-180rpm/min，培养30-60小时后接入一级种子罐进行培养。
(4)将步骤3中的摇瓶菌种转接入一个装有一级种子培养基的发酵罐中，接种量为4-10％，保持罐温28-30℃，罐压0.5-0.9kPa，搅拌速率80-150rpm/min，通气量1∶0.3-0.5v/v.m，发酵90-150小时，然后转接入二级种子培养罐发酵。
(5)将一级种子罐中的菌种转接入一个装有二级种子培养基的发酵罐中，接种量为4-10％，保持罐温28-30℃，罐压0.5-0.9kPa，搅拌速率80-150rpm/min，通气量1∶0.3-0.5v/v.m，发酵40-60小时，然后转接入三级发酵罐发酵。
(6)将二级种子罐中的菌种转接入一个装有三级发酵培养基的发酵罐中，接种量为4-10％，保持罐温28-30℃，罐压0.5-0.9kPa，搅拌速率80-150rpm/min，通气量1∶0.3-0.5v/v.m，发酵100-150小时。在还原糖含量降低到1.0％以下时放罐。
如需获得菌粉，则终了发酵液在发酵罐中以大于300rpm/min的转速高速打碎1小时，然后将其浓缩，待固形物含量达15-20％后，于120℃灭菌20-30min，采用无菌喷雾干燥得菌粉。
如需获取其多糖，则将终了发酵液温度加热到90-100℃，搅拌速度为200-250rpm/min，维持2-4小时，用泵将发酵液输送到贮罐中，经板框压滤得到亮菌多糖。
本发明中斜面培养基的配方是(g/100ml)：马铃薯10-30，葡萄糖1-3，琼脂1.5-2.5，加水定容至所需体积，pH值自然。
本发明中摇瓶培养、摇瓶扩大培养、一级种子培养和二级种子培养的培养基组成是(g/100ml)：葡萄糖1-3，酵母膏0.3-0.7，蛋白胨0.1-0.3，NaCl0.05-0.2，KH2PO40.05-0.2，MgSO40.03-0.1，加水定容至所需体积，pH值为4.5-5.0。
本发明中所述的三级发酵培养基组成是(g/100ml)：葡萄糖2-4，酵母膏0.5-1.5，蛋白胨0.3-0.7，淀粉0.5-2，生长素0.3-0.7，NaCl 0.05-0.15，(NH4)2SO40.05-0.2，KH2PO4 0.1-0.4，MgSO4 0.05-0.15，加水定容至所需体积，pH值为4.5-5.0。
本发明步骤2和3中摇瓶培养基与摇瓶容积比为1∶5。
本发明步骤4中一级种子罐的容积为100-300L，在该一级种子罐中装有的一级种子培养基相应为50-180L；步骤5中二级种子罐的容积为1000-5000L，在该发酵罐中装有的发酵培养基相应为500-3000L；步骤6中三级发酵罐的容积为10000L-15000L，在该发酵罐中装有的发酵培养基相应为5000L-9000L。
本发明的放罐标准是发酵液开始变得粘稠，还原糖含量降低到1.0％以下，镜检发现菌丝体开始衰老。
菌丝体干重的测定采用烘干法，多糖提取采用乙醇沉淀法，采用文献的方法；冯慧琴，杨庆尧，靡可，沈涌：灰树花液体培养菌丝产多糖的研究。食用菌学报，2000，7(2)：5-10。
本发明的有益效果：本发明适用于大规模液体深层发酵生产亮菌菌丝体菌粉及其多糖，解决了大规模生产培养放大的难题，对于今后的工业化生产和相关的应用产业的发展具有重要意义。本发明在发酵结束后得到的发酵产物颜色呈褐色，具有近似蜂蜜的香味，干燥菌丝体粉末呈褐色。发酵液中菌丝体以干重计为2-3％。本发明所生产的菌粉可用做生产片剂、胶囊剂等的原料；所生产的多糖可用做生产各种液体制剂的原料，干燥后可用做生产片剂、胶囊剂等固体制剂的原料。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1：
在斜面培养基中接种亮菌菌丝体，培养温度28℃，培养时间180小时。将新鲜的斜面菌种接入装有100ml培养基的500ml三角瓶中，28℃摇床培养100小时，摇床转速150rpm/min。然后将所得摇瓶菌种转接入装有100ml培养基的500ml三角摇瓶中进行扩大培养，28℃摇床培养48小时，摇床转速150rpm/min。然后将三角瓶扩大的菌种2200ml转接入装有50L种子培养基的100L一级种子罐中，保持罐温28℃，罐压0.7kPa，搅拌速率100rpm/min，通气量1∶0.5v/v.m，发酵时间100小时。将一级种子罐菌种转接入装有800L种子培养基的1500L二级种子培养罐中，保持罐温28℃，罐压0.7kPa，搅拌速率100rpm/min，通气量1∶0.5v/v.m，发酵时间50小时。将二级种子罐菌种转接入装有8000L发酵培养基的15000L三级发酵罐中，保持罐温28℃，罐压0.7kPa，搅拌速率100rpm/min，通气量1∶0.5v/v.m，发酵时间150小时发酵液中菌丝体以干重计为2.5％，干菌粉中多糖含量为15％。
本实施例中斜面培养基组成是(g/100ml)：马铃薯20，葡萄糖2，琼脂2，加水定容至所需体积，pH值为自然。
本实施例中摇瓶培养、摇瓶扩大培养、一级种子培养和二级种子培养的培养基组成是(g/100ml)：葡萄糖2，酵母膏0.5，蛋白胨0.2，NaCl0.1，KH2PO40.1，MgSO4 0.05，加水定容至所需体积，pH值为4.5-5.0。
本实施例中所述的三级发酵培养基组成是(g/100ml)：葡萄糖3，酵母膏1.0，蛋白胨0.5，淀粉1，生长素0.5，NaCl0.1，(NH4)2SO4 0.1，KH2PO4 0.2，MgSO4 0.1，加水定容至所需体积，pH值为4.5-5.0。
本实施例中发酵结束标准是：发酵液开始变得粘稠，还原糖含量降低到1.0％以下，镜检发现菌丝体开始衰老。
获取菌粉的方法是：终了发酵液在发酵罐中以320rpm/min的转速高速打碎1小时，然后将其浓缩，待固形物含量达18％后，于120℃灭菌30min，采用无菌喷雾干燥得菌粉。
获取多糖的方法是：在本发明所述的发酵终止后，将温度加热到90℃，搅拌速度为220rpm/min，维持3小时，用泵将发酵液输送到贮罐中，经板框压滤，滤液经浓缩，使最后体积为原液的1/5，加入适量乙醇使乙醇浓度达75％，醇析24小时，取沉淀用去离子水溶解，喷雾干燥得到亮菌多糖。
实施例2：
在斜面培养基中接种亮菌菌丝体，培养温度28.5℃，培养时间168小时。将新鲜的斜面菌种接入装有100ml培养基的500ml三角瓶中，28.5℃摇床培养96小时，摇床转速150rpm/min。然后将所得摇瓶菌种转接入装有100ml培养基的500ml三角摇瓶中进行扩大培养，28.5℃摇床培养56小时，摇床转速150rpm/min。然后将三角瓶扩大的菌种2500ml转接入装有60L种子培养基的100L一级种子罐中，保持罐温28.5℃，罐压0.7kPa，搅拌速率110rpm/min，通气量1∶0.5v/v.m，发酵时间98小时。将一级种子罐菌种转接入装有800L发酵培养基的1500L二级种子培养罐中，保持罐温28.5℃，罐压0.7kPa，搅拌速率110rpm/min，通气量1∶0.5v/v.m，发酵时间56小时。将二级种子罐菌种转接入装有9000L发酵培养基的15000L三级发酵罐中，保持罐温28.5℃，罐压0.7kPa，搅拌速率110rpm/min，通气量1∶0.5v/v.m，发酵时间132小时发酵液中菌丝体以干重计为2.8％，干菌粉中多糖含量为17％。
本实施例中斜面培养基组成是(g/100ml)：马铃薯20，葡萄糖2，琼脂2，加水定容至所需体积，pH值为自然。
本实施例中摇瓶培养、摇瓶扩大培养、一级种子培养和二级种子培养的培养基组成是(g/100ml)：葡萄糖2，酵母膏0.5，蛋白胨0.2，NaCl 0.1，KH2PO4 0.1，MgSO4 0.05，加水定容至所需体积，pH值为4.5-5.0。
本实施例中所述的三级发酵培养基组成是(g/100ml)：葡萄糖4，酵母膏1.5，蛋白胨0.5，淀粉1.5，生长素0.5，NaCl 0.1，(NH4)2SO4 0.1，KH2PO4 0.2，MgSO4 0.1，加水定容至所需体积，pH值为4.5-5.0。
本实施例中发酵结束标准是：发酵液开始变得粘稠，还原糖含量降低到1.0％以下，镜检发现菌丝体开始衰老。
获取菌粉的方法是：终了发酵液在发酵罐中以320rpm/min的转速高速打碎1小时，然后将其浓缩，待固形物含量达20％后，于120℃灭菌30min，采用无菌喷雾干燥得菌粉。
获取多糖的方法是：在本发明所述的发酵终止后，将温度加热到100℃，搅拌速度为220rpm/min，维持3小时，用泵将发酵液输送到贮罐中，经板框压滤，滤液经浓缩，使最后体积为原液的1/5，加入适量乙醇使乙醇浓度达75％，醇析24小时，取沉淀用去离子水溶解，喷雾干燥得到亮菌多糖。
实施例3：
在斜面培养基中接种亮菌菌丝体，培养温度29℃，培养时间160小时。将新鲜的斜面菌种接入装有100ml培养基的500ml三角瓶中，29℃摇床培养96小时，摇床转速150rpm/min。然后将所得摇瓶菌种转接入装有100ml培养基的500ml三角摇瓶中进行扩大培养，29℃摇床培养44小时，摇床转速150rpm/min。然后将三角瓶扩大的菌种2500ml转接入装有50L种子培养基的100L一级种子罐中，保持罐温29℃，罐压0.7kPa，搅拌速率100rpm/min，通气量1∶0.5v/v.m，发酵时间96小时。将一级种子罐菌种转接入装有500L发酵培养基的1000L二级种子培养罐中，保持罐温29℃，罐压0.7kPa，搅拌速率100rpm/min，通气量1∶0.5v/v.m，发酵时间40小时。将二级种子罐菌种转接入装有5000L发酵培养基的10000L三级发酵罐中，保持罐温29℃，罐压0.7kPa，搅拌速率100rpm/min，通气量1∶0.5v/v.m，发酵时间120小时发酵液中菌丝体以干重计为2.5％，干菌粉中多糖含量为13％。
本实施例中斜面培养基组成是(g/100ml)：马铃薯20，葡萄糖2，琼脂2，加水定容至所需体积，pH值为自然。
本实施例中摇瓶培养、摇瓶扩大培养、一级种子培养和二级种子培养的培养基组成是(g/100ml)：葡萄糖2，酵母膏0.5，蛋白胨0.2，NaCl 0.1，KH2PO4 0.1，MgSO4 0.05，加水定容至所需体积，pH值为4.5-5.0。
本实施例中所述的三级发酵培养基组成是(g/100ml)：葡萄糖3，酵母膏1.2，蛋白胨0.5，淀粉0.9，生长素0.4，NaCl 0.1，(NH4)2SO4 0.1，KH2PO4 0.2，MgSO4 0.1，加水定容至所需体积，pH值为4.5-5.0。
本实施例中发酵结束标准是：发酵液开始变得粘稠，还原糖含量降低到1.0％以下，镜检发现菌丝体开始衰老。
获取菌粉的方法是：终了发酵液在发酵罐中以320rpm/min的转速高速打碎1小时，然后将其浓缩，待固形物含量达16％后，于120℃灭菌30min，采用无菌喷雾干燥得菌粉。
获取多糖的方法是：在本发明所述的发酵终止后，将温度加热到100℃，搅拌速度为220rpm/min，维持3小时，用泵将发酵液输送到贮罐中，经板框压滤，滤液经浓缩，使最后体积为原液的1/5，加入适量乙醇使乙醇浓度达75％，醇析24小时，取沉淀用去离子水溶解，喷雾干燥得到亮菌多糖。
实施例4：
在斜面培养基中接种亮菌菌丝体，培养温度30℃，培养时间150小时。将新鲜的斜面菌种接入装有100ml培养基的500ml三角瓶中，30℃摇床培养94小时，摇床转速150rpm/min。然后将所得摇瓶菌种转接入装有100ml培养基的500ml三角摇瓶中进行扩大培养，30℃摇床培养44小时，摇床转速150rpm/min。然后将三角瓶扩大的菌种2600ml转接入装有50L种子培养基的100L一级种子罐中，保持罐温30℃，罐压0.7kPa，搅拌速率100rpm/min，通气量1∶0.5v/v.m，发酵时间92小时。将一级种子罐菌种转接入装有500L发酵培养基的1000L二级种子培养罐中，保持罐温30℃，罐压0.7kPa，搅拌速率100rpm/min，通气量1∶0.5v/v.m，发酵时间40小时。将二级种子罐菌种转接入装有5000L发酵培养基的10000L三级发酵罐中，保持罐温30℃，罐压0.7kPa，搅拌速率100rpm/min，通气量1∶0.5v/v.m，发酵时间100小时发酵液中菌丝体以干重计为2.2％，干菌粉中多糖含量为12％。
本实施例中斜面培养基组成是(g/100ml)：马铃薯20，葡萄糖2，琼脂2，加水定容至所需体积，pH值为自然。
本实施例中摇瓶培养、摇瓶扩大培养、一级种子培养和二级种子培养的培养基组成是(g/100ml)：葡萄糖2，酵母膏0.5，蛋白胨0.2，NaCl 0.1，KH2PO4 0.1，MgSO4 0.05，加水定容至所需体积，pH值为4.5-5.0。
本实施例中所述的三级发酵培养基组成是(g/100ml)：葡萄糖2.2，酵母膏1.4，蛋白胨0.5，淀粉0.9，生长素0.4，NaCl 0.1，(NH4)2SO4 0.1，KH2PO4 0.2，MgSO4 0.1，加水定容至所需体积，pH值为4.5-5.0。
本实施例中发酵结束标准是：发酵液开始变得粘稠，还原糖含量降低到1.0％以下，镜检发现菌丝体开始衰老。
获取菌粉的方法是：终了发酵液在发酵罐中以320rpm/min的转速高速打碎1小时，然后将其浓缩，待固形物含量达15％后，于120℃灭菌30min，采用无菌喷雾干燥得菌粉。
获取多糖的方法是：在本发明所述的发酵终止后，将温度加热到100℃，搅拌速度为220rpm/min，维持3小时，用泵将发酵液输送到贮罐中，经板框压滤，滤液经浓缩，使最后体积为原液的1/5，加入适量乙醇使乙醇浓度达75％，醇析24小时，取沉淀用去离子水溶解，喷雾干燥得到亮菌多糖。
Claims (3)
1、一种亮菌液体深层发酵生产工艺，其特征是：以亮菌真菌为出发菌株，采用斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养和三级发酵培养得亮菌菌丝体发酵液，将发酵液在发酵罐内高速打碎，经浓缩灭菌后，无菌喷雾干燥得菌粉；或发酵结束后将发酵液继续加热到90-100℃，搅拌维持2-4小时，发酵液经板框压滤得到亮菌多糖；
摇瓶培养、摇瓶扩大培养、一级种子培养和二级种子培养的培养基组成以g/100ml计为：葡萄糖1-3，酵母膏0.3-0.7，蛋白胨0.1-0.3，NaCl 0.05-0.2，KH2PO4 0.05-0.2，MgSO4 0.03-0.1，加水定容至所需体积，pH值为4.5-5.0；
摇瓶培养的培养条件是培养温度28-30℃，转速120-180rpm/min，培养96-120小时，然后转接入摇瓶进行扩大培养；
摇瓶扩大培养的培养条件是培养温度28-30℃，转速120-180rpm/min，培养30-60小时，然后转接入一级种子罐培养，接种量为4-10％；
一级种子培养的培养条件是培养温度28-30℃，罐压0.5-0.9kPa，搅拌速率80-150rpm/min，通气量1∶0.3-0.5v/v.m，发酵90-150小时，然后转接入二级种子罐培养，接种量为4-10％；
二级种子培养的培养条件是培养温度28-30℃，罐压0.5-0.9kPa，搅拌速率80-150rpm/min，通气量1∶0.3-0.5v/v.m，发酵40-60小时，然后转接入三级发酵罐培养，接种量为4-10％；
三级发酵培养基组成以g/100ml计为：葡萄糖2-4，酵母膏0.5-1.5，蛋白胨0.3-0.7，淀粉0.5-2，生长素0.3-0.7，NaCl 0.05-0.15，(NH4)2SO40.05-0.2，KH2PO4 0.1-0.4，MgSO4 0.05-0.15，加水定容至所需体积，pH值为4.5-5.0；培养条件是培养温度28-30℃，罐压0.5-0.9kPa，搅拌速率80-150rpm/min，通气量1∶0.3-0.5v/v.m，发酵100-150小时；
三级发酵培养，可选择10000L-15000L发酵罐进行发酵培养。
2、根据权利要求1所述的亮菌液体深层发酵生产工艺，其特征是：将三级发酵培养所得发酵液在发酵罐中以大于300rpm/min的转速高速打碎1小时，然后将其浓缩，待固形物含量达15％-20％后，于120℃灭菌20-30min，采用无菌喷雾干燥得菌粉。
3、根据权利要求1所述的亮菌液体深层发酵生产工艺，其特征是：将三级发酵培养所得发酵液温度加热到90-100℃，搅拌速度为200-250rpm/min，维持2-4小时，用泵将发酵液输送到贮罐中，经板框压滤得到亮菌多糖。
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