CN105695543B - 一种生物表面活性素的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物表面活性素的生产方法，将解淀粉芽孢杆菌fmb50先后接种于PDA斜面培养基进行培养，培养后再接种于BPY种子培养基继续培养，最后再接种于发酵培养基培养后得到含有生物表面活性素的培养液；然后将培养液加水稀释后调节pH，再通过加入壳聚糖、海藻酸钠和硅藻土进行絮凝后过滤；最后将滤饼使用低级醇溶解提取后过滤，将滤液减压蒸馏得到生物表面活性素粗品。本发明提供的生物表面活性素的生产方法能够实现工业化制备生物表面活性素，并且制备得到的生物表面活性素纯度高，有效弥补了目前生物表面活性素不能大规模生产的不足。
Description
技术领域
本发明涉及用芽孢杆菌属微生物发酵与分离表面活性素(Surfactin)的方法，具体涉及一种生物表面活性素的生产方法。
背景技术
表面活性素(Surfactin)是一种由解淀粉芽孢杆菌合成的环肽，由于其分子结构中存在亲水的肽键和疏水的脂肪酸链，使其具有极强的表面活性。Surfactin能与细胞膜发生作用，造成细胞膜的穿孔导致细胞质外泄，从而干扰正常细胞结构。Surfactin除具有高表面活性能以外，还被证实具有、抗肿瘤、抗支原体及抗病毒功效，因此被广泛用于医药、食品、农业生防及养殖领域。
在Surfactin的发酵过程中，由于其极强的表面活性，在通气和搅拌的过程中，培养液会急剧起泡，不但影响氧气的传递速率，而且造成培养液逃液并增大染菌的风险。由于Surfactin极强的表面活性，普通消泡剂不能起到很好的消泡效果。Davis等研究表明当培养基中铵根被耗尽且处于厌氧环境时，硝酸根作为末端电子受体，Surfactin的产量增加。
Surfactin以胶束形式存在与水溶液中，其分离纯化成本较高。传统的分离方法主要为酸沉淀。Surfactin在酸性条件下生产沉淀析出，但此时大分子蛋白、糖类及色素也随之沉淀，造成样品纯度较低。Sen使用膜对Surfactin进行分离与浓缩；Chen向Surfactin粗提液中加入33％乙醇以破坏Surfactin胶束，并使用100KDa的PES膜截留Surfactin胶束。Chen使用0.2mm的中空纤维式聚氟乙烯(PVDF)膜对Surfactin进行非分散萃取；Juang对Surfactin粗提液进行反胶束萃取。但上述工艺均为实验室手段，进行工业化生产成本较高。因此开发一种适用于工业化生产的分离方法有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于为了解决以上现有技术的不足而提供一种生物表面活性素的生产方法，能够实现工业化大规模生产高纯度生物表面活性素，弥补目前生物表面活性素不能大规模生产的不足。
本发明的技术方案如下：
一种生物表面活性素的生产方法，其特征在于，包括生物表面活性素的发酵制备与分离；
其中发酵制备的过程为：先将保藏号为CGMCC No.6249的解淀粉芽孢杆菌fmb50接种于PDA斜面培养基进行培养，再取PDA斜面培养基培养后的菌种接种于BPY种子培养基继续培养，最后取BPY种子培养基培养后的菌种接种于发酵培养基培养后得到含有生物表面活性素的培养液；
分离的过程为：将发酵培养基培养后得到的培养液加水使稀释因子为2.0-3.0，调pH至4.0-6.0，于30-50℃恒温保持10-60min，然后加入壳聚糖、海藻酸钠和硅藻土，搅拌混合后过滤并弃去原始滤液；然后再加水过滤至后续滤液透光率达到90％以上，停止过滤，将滤饼吹干；按照滤饼含水量加入低级醇，同时加入活性炭，将pH调至7.0以上，使加入低级醇后过滤的滤液透光率为90％以上，然后将滤液减压蒸馏得到生物表面活性素粗品；其中低级醇加入体积的计算公式如下：
y＝(1.665e2-2.3305e+0.8388)x，
上式中，y代表单位质量滤饼所需体积，单位为L/kg，e代表滤液低级醇体积分数，单位为％，x代表滤饼含水比例，单位为％。
进一步地，所述发酵制备的过程中，解淀粉芽孢杆菌fmb50于PDA斜面培养基进行培养的温度为37℃，培养时间12-24h。
进一步地，所述发酵制备的过程中，解淀粉芽孢杆菌fmb50于BPY种子培养基培养的条件为37℃，180rpm培养10-18h。
进一步地，所述PDA斜面培养基的配方为马铃薯150～200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂粉15-20g/L。
进一步地，所述BPY种子培养基的配方为牛肉膏5g/L、酵母膏5g/L、NaCl 5g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖10g/L、pH 7.0。
进一步地，所述发酵培养基的配方为黄豆粉50-100g/L、麦芽糊精10-30g/L、K2HPO4·3H2O 9g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L、CaCl2 0.1g/L、FeSO4·7H2O 0.01g/L、MnSO4·H2O0.05g/L、尿素1g/L、乳化硅油0.5mL/L、pH 7.0，其中麦芽糊精单独灭菌后加入。
进一步地，以上发酵培养基的培养过程为：发酵培养温度为33℃，菌种接种后维持DO>20％培养至发酵液中还原糖含量降低至5g/L，然后加入麦芽糊精4-8g/L；之后发酵培养至DO<5％且通过提高转速无法控制DO>5％时，加入尿素1g/L，维持空气通量0.7-1VVM，并维持DO<5％，继续发酵；发酵全程中维持pH 6.5以上，当继续发酵培养至pH>7.5、DO>5％或培养时间超过40h即可放罐。
进一步地，分离的过程中加入的低级醇为甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇中的一种。
进一步地，分离的过程中加入壳聚糖的质量浓度为20-80mg/L，加入海藻酸钠的质量浓度为30-50mg/L，加入硅藻土的质量体积百分比为1-3％，加入活性炭的质量浓度为4-10g/L。
进一步地，分离的过程中所述的过滤为使用板框压滤。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)本发明通过将解淀粉芽孢杆菌fmb50进行扩大培养，得到了含有生物表面活性素的发酵产物；再利用生物表面活性素在水溶液中可以形成胶束的特性，提供了一种分阶段的生物活性酸提取手段，区别于传统的离心、萃取方法。
(2)本发明在分离生物表面活性素的过程中使用壳聚糖以及海藻酸钠进行絮凝，然后结合絮凝与低级醇破坏胶束的原理，通过特定的公式计算得到的所用量的低级醇进行生物表面活性素的有效提取，使得到的生物表面活性素的纯度以及回收率远远高于目前实验室传统方法提取所达到的纯度与回收率，同时使用本发明提供的公式计算得到的低级醇用量能够很好地兼顾滤饼以及所用低级醇的特性，达到了很好的提取效果的同时避免了过量加入低级醇提取时所带来的提取液中生物表面活性素含量降低，杂质增加，脱色过程中产物损失率增加等缺陷。
(3)本发明提供的生物表面活性素的生产方法能够实现工业化大规模生产，生产条件易于控制，生产得到的产品纯度高，有效弥补了目前不能大规模制备生物表面活性素的不足。
附图说明
图1为表面活性素标准品液相色谱图；
图2为表面活性素标准品标准曲线。
具体实施方式：
实施例1：黄豆粉浓度对表面活性素产量的影响
将解淀粉芽孢杆菌fmb50(保藏号CGMCC No.6249)在PDA斜面培养基上37℃培养24h，之后接种一环于BPY种子培养基，37℃，180rpm培养18h，按3v/v％接种量接种于下述不同碳源的培养基中，于33℃，180rpm培养36h。
基础组分：葡萄糖20g/L、K2HPO4·3H2O 9g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L、CaCl2 0.1g/L、FeSO4·7H2O 0.01g/L、MnSO4·H2O 0.05g/L、尿素1g/L、pH 7.0、其中葡萄糖单独灭菌。向上述组成中添加单独灭菌的40g/L、60g/L、80g/L、100g/L黄豆粉之一。通过HPLC测定表面活性素的含量(其标准品液相色谱图见图1)，并用外标法计算得到不同含量黄豆粉发酵产生表面活性素的量(表面活性素标准曲线见图2)，见下表1：
表1
实施例2：碳源对表面活性素产量的影响
将解淀粉芽孢杆菌fmb50(保藏号CGMCC No.6249)在PDA斜面培养基上37℃培养24h，之后接种一环于BPY种子培养基，37℃，180rpm培养18h，按3v/v％接种量接种于下述不同碳源的培养基中，于33℃，180rpm培养36h。
基础组分：黄豆粉80g/L、K2HPO4·3H2O 9g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L、CaCl2 0.1g/L、FeSO4·7H2O 0.01g/L、MnSO4·H2O 0.05g/L、尿素1g/L、pH 7.0。
向上述组成中添加单独灭菌的下述碳源之一。
10g/L、20g/L、30g/L的糖蜜、葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖浆、麦芽糊精及其组合。
离心培养液，通过下述HPLC方法对上清液中的表面活性素进行定量。
下面显示各碳源发酵产生表面活性素的量，见下表2：
表2
实施例3：10L发酵罐中表面活性素的生产
将解淀粉芽孢杆菌fmb50(保藏号CGMCC No.6249)在PDA斜面培养基上37℃培养24h，之后接种一环于BPY种子培养基，37℃，180rpm培养16h，按1.5v/v％接种量接种于发酵培养基，33℃、培养40h，所述发酵培养基配方为：黄豆粉80g/L、麦芽糊精20g/L、K2HPO4·3H2O 9g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L、CaCl20.1g/L、FeSO4·7H2O 0.01g/L、MnSO4·H2O 0.05g/L、尿素1g/L、乳化硅油0.5mL/L、pH 7.0，其中麦芽糊精单独灭菌后加入。接种后调节空气通量1VVM，转速180rpm时调节溶氧为100％，维持空气通量1VVM，维持转速介于180与600rpm之间进而保持DO>20％，期间通过DNS法测定发酵液中的还原糖含量，当发酵培养至18h时还原糖含量接近5g/L，不利于后续产物积累，此时加入麦芽糊精4g/L；继续培养至20h时，发酵液中DO<5％且通过提高转速无法控制DO>5％，此时取消DO与转速的关联，加入尿素1g/L，维持空气通量0.7-1VVM，维持DO<5％继续发酵。当发酵至pH>7.5、DO>5％或培养时间超过40h即可放罐。以上整个发酵过程中使用0.5M NaOH调节并维持pH 6.5为以上。最终发酵液中Surfactin为14.23g/L。
实施例4：絮凝条件对表面活性素培养液絮凝效果的影响
将壳聚糖用1％的冰醋酸配置成质量浓度为10g/L的溶液，海藻酸钠用水配置成质量浓度为10g/L的溶液。将培养液加水稀释至稀释因子为3.0，分别进行1)将pH调节至4、5、6，同时向其中加入50mg/L壳聚糖；2)将pH调节至5，加入20、30、40、50、60、70和80mg/L壳聚糖；3)将pH调节至5，加入50mg/L壳聚糖，之后加入5、20、35和50mg/L海藻酸钠；4)将pH调节至5，于30、40和50℃加热30min后，加入50mg/L壳聚糖，之后加入35mg/L海藻酸钠，加入2％硅藻土混匀过滤后测定指标。
下面显示pH、壳聚糖、海藻酸钠、温度对培养液絮凝效果的影响，具体见下表3-6：
表3
表4
表5
表6
絮凝条件及其对应回收率与纯度：
将培养液加水稀释至稀释因子为3.0，调节pH 5，维持温度40℃，加入壳聚糖50mg/L，海藻酸钠40mg/L，加入3％硅藻土混匀过滤后加水洗滤饼至透光率99％，弃去滤液。按下式添加乙醇溶解滤饼并调节pH 7后过滤，再次重复2次并收集滤液，至此Surfactin回收率93.79±0.16％、Surfactin纯度84.75±0.42％。
y＝(1.665e2-2.3305e+0.8388)x
y代表单位质量滤饼所需体积(L/kg)，e代表滤液乙醇体积分数(％)，x代表滤饼含水比例(％)。
通过将单位体积Surfactin溶液冷冻干燥来进行纯度测定，公式如下：
C为Surfactin含量(g/L)，V为冻干液体的体积(mL)，m为体积为V的液体经过冻干燥后固体物质的质量(g)。
本发明中生物表面活性素醇溶回收率是极为重要的指标，其代表预处理中可以从滤饼中溶解出样品的量，其计算方法见以下公式：
其中C0、V0分别为发酵液中Surfactin含量(g/L)和发酵液体积(mL)，C1、V1分别为经醇洗滤饼后得到的滤液中Surfactin含量(g/L)和滤液体积(mL)。
通过后期活性炭的吸附与脱色实验，确定了醇比例为80％-90％。此时，可以兼顾脱色效率、产物损失率与处理体积。如果加入的醇不足，将导致产品的回收率过低；如果加入过量醇进行提取，将导致1)C1*V1增加，但增加不显著；2)处理量显著增加；3)乙醇溶液中Surfactin的浓度降低，杂质增加；4)脱色过程中，产物损失率增加；5)整体回收率、纯度、脱色效率有所降低，处理时间有所增加。因此，通过本发明提供的醇用量的计算公式，能够很好地达到充分提取，尤其是在扩大生产中能够同时兼顾脱色效率、产物损失率与处理体积。
实施例5：活性炭对表面活性素回收率及脱色率的影响
絮凝后Surfactin以胶束的形式存在于滤饼中，通过乙醇洗涤达到溶出Surfactin的目的。按实施例4絮凝条件絮凝并烘干滤饼后加入无水乙醇，调节pH 7过滤得到Surfactin溶液，分别进行1)加入2、4、6、8、10g/L的活性炭；2)将pH调节至5、6、7、8、9，之后加入6g/L的活性炭；3)将10.917g/L的Surfactin溶液用无水乙醇稀释为2.729、5.458、8.187g/L，之后加入6g/L的活性炭；4)将10.917g/L的Surfactin溶液配置成不同乙醇体积分数但Surfactin含量相同的溶液，之后加入6g/L的活性炭；5)加入6g/L的活性炭后分别于5、10、15、20、30、60、120、240、360、480和720min取样。上述溶液混匀12h后测定指标。
下面显示活性炭、pH、Surfactin、乙醇体积分数、时间对回收率及脱色率的影响，见表7-11：
表7
表8
表9
表10
表11
活性炭吸附条件及其对应回收率与纯度：
按实施例4絮凝条件絮凝后，计算所需乙醇体积并加入6g/L活性炭，混匀过夜并过滤。再次重复上述过程2次并收集滤液，至此Surfactin回收率为90.69±0.18％，Surfactin纯度93.15±0.21％。
实施例7：工业化生产表面活性素
5000L发酵罐中表面活性素的生产：
按实施例1进行斜面培养与一级种子液培养后，以0.2％的接种量接入500L种子罐中，培养基为BPY，装液量为350L。调节pH 6.9，转速100rpm，罐压0.04MPa，通气量15m2/h培养10h。之后按3％的接种量接入5000L发酵罐中，发酵培养基除黄豆粉为50g/L外其余组分同实施例3，装液量为3000L。此发酵罐溶氧水平大于实施例3中的发酵罐，相应的调整转速、发酵终点。调节pH 6.9，转速60rpm，罐压0.05MPa，通气量20m2/h培养11h，然后转速调为40rpm，于14h加入尿素1g/L，培养至pH>7.5、DO>5％放罐，总共培养时间为34h。经HPLC测定培养液中Surfactin为8.4g/L。
发酵液体积共3400L，加水3000L稀释后，加入500L提前稀释的絮凝剂FL4540(爱森)，絮凝搅拌1小时。加入中粉珍珠岩60Kg，细粉20Kg，0.2Mpa压力进行板框压滤，弃去滤液后水洗至透光率大于90％，打入压缩空气吹干滤饼。经过长时间吹干后，滤饼含水量约80％，分批称量滤饼，并按照实施例4中的公式加入乙醇使乙醇终浓度在80％，并按乙醇体积加入6g/L活性炭，搅拌混匀30min后通过板框压滤，收集滤液。通过真空泵将液体抽至真空干燥器中，将循环水温度设定在55℃，真空度设为0.09MPa，减压蒸馏至体积减少85％以上，共得到表面活性素粗品溶液约320L。将粗品溶液用乙醇稀释100倍，通过HPLC测定表面活性素的含量，粗品溶液中表面活性素含量为68.75g/L，回收率为77.03％，同时进行纯度测定，纯度为85.75％。
Claims (9)
1.一种生物表面活性素的生产方法，其特征在于，包括生物表面活性素的发酵制备与分离；其中发酵制备的过程为：先将保藏号为CGMCC No.6249的解淀粉芽孢杆菌fmb50接种于PDA斜面培养基进行培养，再取PDA斜面培养基培养后的菌种接种于BPY种子培养基继续培养，最后取BPY种子培养基培养后的菌种接种于发酵培养基培养后得到含有生物表面活性素的培养液；分离的过程为：将发酵培养基培养后得到的培养液加水使稀释因子为2.0-3.0，调pH至4.0-6.0，于30-50℃恒温保持10-60min，然后加入壳聚糖、海藻酸钠和硅藻土，搅拌混合后过滤并弃去原始滤液；然后再加水过滤至后续滤液透光率达到90％以上，停止过滤，将滤饼吹干；按照滤饼含水量加入低级醇，同时加入活性炭，将pH调至7 .0以上，使加入低级醇后过滤的滤液透光率为90％以上，然后将滤液减压蒸馏得到生物表面活性素粗品；其中低级醇加入体积的计算公式如下：
y＝(1.665e2-2.3305e+0.8388)x，上式中，y代表单位质量滤饼所需体积，单位为L/kg，e代表滤液低级醇体积分数，单位为％，x代表滤饼含水比例，单位为％；
所述发酵培养基的配方为黄豆粉50-100g/L、麦芽糊精10-30g/L、K2HPO4·3H2O 9g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L、CaCl2 0.1g/L、FeSO4·7H2O 0.01g/L、MnSO4·H2O 0.05g/L、尿素1g/L、乳化硅油0.5mL/L、pH7.0，其中麦芽糊精单独灭菌后加入。
2.根据权利要求1所述的生物表面活性素的生产方法，其特征在于，所述发酵制备的过程中，解淀粉芽孢杆菌fmb50于PDA斜面培养基进行培养的温度为37℃，培养时间12-24h。
3.根据权利要求1所述的生物表面活性素的生产方法，其特征在于，所述发酵制备的过程中，解淀粉芽孢杆菌fmb50于BPY种子培养基培养的条件为37℃，180rpm培养10-18h。
4.根据权利要求1所述的生物表面活性素的生产方法，其特征在于，所述PDA斜面培养基的配方为马铃薯150～200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂粉15-20g/L。
5.根据权利要求1所述的生物表面活性素的生产方法，其特征在于，所述BPY种子培养基的配方为牛肉膏5g/L、酵母膏5g/L、NaCl 5g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖10g/L、pH 7.0。
6.根据权利要求1所述的生物表面活性素的生产方法，其特征在于，发酵培养基的培养过程为：发酵培养温度为33℃，菌种接种后维持DO>20％培养至发酵液中还原糖含量降低至5g/L，然后加入麦芽糊精4-8g/L；之后发酵培养至DO<5％且通过提高转速无法控制DO>5％时，加入尿素1g/L，维持空气通量0.7-1VVM，并维持DO<5％，继续发酵；发酵全程中维持pH6.5以上，当继续发酵培养至pH>7.5、DO>5％或培养时间超过40h即可放罐。
7.根据权利要求1所述的生物表面活性素的生产方法，其特征在于，分离的过程中加入的低级醇为甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇中的一种。
8.根据权利要求1所述的生物表面活性素的生产方法，其特征在于，分离的过程中加入壳聚糖的质量浓度为20-80mg/L，加入海藻酸钠的质量浓度为30-50mg/L，加入硅藻土的质量体积百分比为1-3％，加入活性炭的质量浓度为4-10g/L。
9.根据权利要求1所述的生物表面活性素的生产方法，其特征在于，分离的过程中所述的过滤为使用板框压滤。
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Granted publication date: 20190604 |
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