CN113321580A - 一种生产苹果酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种生产苹果酸的方法，包括如下步骤：取苹果酸发酵液，离心去除沉淀，收集上清液，然后添加活性炭，搅拌，再添加硅藻土，搅拌均匀，板框过滤，收集滤液，再进行微滤膜过滤，收集微滤液，通过装填有强碱弱酸型两性离子交换树脂的色谱柱，使其中的苹果酸被吸附，然后用热水洗脱吸附于树脂上的苹果酸，反复洗脱，将得到的洗脱液合并，减压蒸馏，真空干燥，得到苹果酸产品。

Description

一种生产苹果酸的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生产苹果酸的方法。
背景技术
L-苹果酸在食品、医药、日用化工等领域均有广泛的用途，其制备方法包括生物发酵法和化学合成法，生物发酵法绿色环保，已经成为制备苹果酸的趋势。
L-苹果酸的生产主要是生物发酵为主，如何提高生物发酵效率是研究人员一直需要解决的技术问题。针对这一技术问题，申请人作了大量研究，例举如下：CN108300739B，一种用于L-苹果酸的分离方法，采用曲霉混合发酵培养的方式，比常规的米曲霉发酵方法，能够提高苹果酸的产量，而且大大降低了黄曲霉毒素的产生，同时在发酵工艺中添加碳酸钙来维持碳酸钙浓度，提高了发酵效率。CN107083407B，一种L-苹果酸的制备、分离以及除杂纯化方法，对现有苹果酸发酵菌株进行通透化处理，提高了苹果酸的产率；通过添加CTAB结合温度压强的改变，实现菌株培养与透性化处理的耦合，可以在不需要对培养好的细胞进行后续透性化处理的情况下减小菌体细胞壁和细胞膜对底物和产物的传质限制，避免后续透性化处理细胞的步骤及相关设备运转的投入，为提高苹果酸产量提供了一个简便方法。其他单位对苹果酸的分离纯化也做了大量研究，CN103483561A，一种发酵液中分离纯化聚苹果酸的方法，实现了发酵液中聚苹果酸与大分子蛋白、多糖等物质的分离，首先采用高速离心实现菌液分离，然后采用超滤膜分离浓缩发酵液中的聚苹果酸，最后超滤浓缩液经冷冻干燥得到纯度≥95.0％的聚苹果酸。但是该超滤膜浓缩处理的发酵液的量较少，处理速度慢，而且成本较高，不利于工业化规模化生产。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种生产苹果酸的方法。
本发明的技术方案是通过如下方式来实施的：
一种生产苹果酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
取苹果酸发酵液，3000rpm离心5min，去除沉淀，收集上清液，然后添加活性炭，搅拌30min，再添加硅藻土，搅拌均匀，板框过滤，收集滤液，再进行微滤膜过滤，收集微滤液，通过装填有强碱弱酸型两性离子交换树脂的色谱柱，使其中的苹果酸被吸附，然后用70℃热水洗脱吸附于树脂上的苹果酸，反复洗脱3-5次，将得到的洗脱液合并，减压蒸馏，真空干燥，得到苹果酸产品。
优选地，所述活性炭的添加量为0.5%质量体积比。
优选地，所述硅藻土的添加量为0.2%质量体积比。
优选地，所述微滤膜截留分子量为5000Da，微滤温度为30℃。
进一步地，所述苹果酸发酵液按照如下步骤制备：
按照米曲霉种子液∶发酵罐培养基为1∶10的体积比例转入发酵罐中培养，温度33℃，培养48h，然后添加碳酸钙和纳他霉素，继续发酵36h，然后控制温度为39℃，压强为2个大气压，保温保压发酵12h，停止发酵，得到苹果酸发酵液；发酵过程中，通过自动流加氨水控制pH在6.3；并通过流加浓度为200g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在不低于10g/L。
优选地，所述碳酸钙的添加量为80g/L。
优选地，所述纳他霉素的添加量为5mg/L。
优选地，所述发酵罐培养基组分为：碳酸钙80g/L，葡萄糖60g/L，木糖50 g/L，玉米浆12g/L，硫酸铵2g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，七水硫酸亚铁10mg/L，六水合硫酸镍10mg/L，pH值6.2。
优选地，所述米曲霉种子液的制备方法为：将米曲霉菌液按照10％体积比的接种量接入种子罐培养基中进行培养，在温度为33℃，摇床转速为200r/min，培养12h得到种子液。
更优选地，所述种子罐培养基组分为：蔗糖3g，硝酸钠0.2g，硫酸铵0.5g，磷酸二氢钾0.1g，磷酸氢二钾0.1g，一水硫酸锰0.1g，七水硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.01g，氯化钠0.01g，pH值6.0，定容至1L。
本发明的有益效果主要包括但是并不限于几个方面：
苹果酸脱氢酶的酶活力增加，保证草酰乙酸往苹果酸合成转化；琥珀酸脱氢酶使发酵生成的苹果酸再转化为琥珀酸，对苹果酸的积累有不利的影响。发酵过程中，苹果酸脱氢酶在发酵初期已达到较高的水平，选择在发酵初始阶段添加0.1mg/L六水合硫酸镍对苹果酸脱氢酶的活性有激活作用。而发酵中后期，苹果酸产量大幅提升，此时琥珀酸脱氢酶也随之达到或接近峰值，添加纳他霉素能够抑制琥珀酸脱氢酶的活力；如果纳他霉素在发酵初期选择添加，其对苹果酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶均会产生较强的抑制作用，不利于苹果酸的合成；而且纳他霉素添加量需要控制在合理的水平，避免过度影响TCA循环而导致菌体死亡。本发明发酵液中分离纯化苹果酸产品，具备收率和纯度高的优点，并且操作工艺简单，生产成本低。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
一种生产苹果酸的方法，其包括如下步骤：
将米曲霉ACCC30584菌液（浓度为1×108CFU/mL)按照10％(体积比)的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为33℃，摇床转速为200r/min，培养12h得到种子液，其中，种子罐的培养基组分为（1L）：蔗糖3g，硝酸钠0.2g，硫酸铵0.5g，磷酸二氢钾0.1g，磷酸氢二钾0.1g，一水硫酸锰0.1g，七水硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.01g，氯化钠0.01g，pH值6.0；
按照种子液∶发酵罐培养基为1∶10的体积比例转入发酵罐中培养，温度33℃，培养48h，然后添加碳酸钙和纳他霉素，碳酸钙的添加量为80g/L，纳他霉素的添加量为5mg/L，继续发酵36h，然后控制温度为39℃，压强为2个大气压，保温保压发酵12h，停止发酵，得到苹果酸发酵液；发酵过程中，通过自动流加氨水控制pH在6.3；并通过流加浓度为200g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在不低于10g/L；
所述发酵罐培养基组分为：碳酸钙80g/L，葡萄糖60g/L，木糖50 g/L，玉米浆12g/L，硫酸铵2g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，七水硫酸亚铁10mg/L，六水合硫酸镍10mg/L，pH值6.2。
取上述L-苹果酸发酵液100L，3000rpm离心5min，去除沉淀，收集上清液，然后添加0.5%质量体积比的活性炭，搅拌30min，再添加0.2%质量体积比的硅藻土，搅拌均匀，板框过滤，收集滤液，再进行微滤膜过滤，截留分子量为5000Da，微滤温度为30℃；收集微滤液，通过装填有强碱弱酸型两性离子交换树脂的色谱柱，使其中的苹果酸被吸附，然后用70℃热水洗脱吸附于树脂上的苹果酸，反复洗脱3次，将得到的洗脱液合并，减压蒸馏，真空干燥，得到L-苹果酸产品；收率为83%，产品纯度大于98%，硫酸盐、氯化物、重金属含量，比旋光度以及透光率等相关指标符合相关标准要求。
实施例2
一种生产苹果酸的方法，其包括如下步骤：
将米曲霉ACCC30584菌液（浓度为1×108CFU/mL)按照10％(体积比)的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为33℃，摇床转速为200r/min，培养12h得到种子液，其中，种子罐的培养基组分为（1L）：蔗糖3g，硝酸钠0.2g，硫酸铵0.5g，磷酸二氢钾0.1g，磷酸氢二钾0.1g，一水硫酸锰0.1g，七水硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.01g，氯化钠0.01g，pH值6.0；
按照种子液∶发酵罐培养基为1∶10的体积比例转入发酵罐中培养，温度33℃，培养48h，然后添加碳酸钙，碳酸钙的添加量为80g/L，继续发酵36h，然后控制温度为39℃，压强为2个大气压，保温保压发酵12h，停止发酵，得到苹果酸发酵液；发酵过程中，通过自动流加氨水控制pH在6.3；并通过流加浓度为200g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在不低于10g/L；
所述发酵罐培养基组分为：碳酸钙80g/L，葡萄糖60g/L，木糖50 g/L，玉米浆12g/L，硫酸铵2g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，七水硫酸亚铁10mg/L，pH值6.2。
苹果酸分离纯化方法同实施例1。
实施例3
一种生产苹果酸的方法，其包括如下步骤：
将米曲霉ACCC30584菌液（浓度为1×108CFU/mL)按照10％(体积比)的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为33℃，摇床转速为200r/min，培养12h得到种子液，其中，种子罐的培养基组分为（1L）：蔗糖3g，硝酸钠0.2g，硫酸铵0.5g，磷酸二氢钾0.1g，磷酸氢二钾0.1g，一水硫酸锰0.1g，七水硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.01g，氯化钠0.01g，pH值6.0；
按照种子液∶发酵罐培养基为1∶10的体积比例转入发酵罐中培养，温度33℃，培养48h，然后添加碳酸钙和纳他霉素，碳酸钙的添加量为80g/L，纳他霉素的添加量为5mg/L，继续发酵36h，然后控制温度为39℃，压强为2个大气压，保温保压发酵12h，停止发酵，得到苹果酸发酵液；发酵过程中，通过自动流加氨水控制pH在6.3；并通过流加浓度为200g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在不低于10g/L；
所述发酵罐培养基组分为：碳酸钙80g/L，葡萄糖60g/L，木糖50 g/L，玉米浆12g/L，硫酸铵2g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，七水硫酸亚铁10mg/L，pH值6.2。
苹果酸分离纯化方法同实施例1。
实施例4
一种生产苹果酸的方法，其包括如下步骤：
将米曲霉ACCC30584菌液（浓度为1×108CFU/mL)按照10％(体积比)的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为33℃，摇床转速为200r/min，培养12h得到种子液，其中，种子罐的培养基组分为（1L）：蔗糖3g，硝酸钠0.2g，硫酸铵0.5g，磷酸二氢钾0.1g，磷酸氢二钾0.1g，一水硫酸锰0.1g，七水硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.01g，氯化钠0.01g，pH值6.0；
按照种子液∶发酵罐培养基为1∶10的体积比例转入发酵罐中培养，温度33℃，培养48h，然后添加碳酸钙，碳酸钙的添加量为80g/L，继续发酵36h，然后控制温度为39℃，压强为2个大气压，保温保压发酵12h，停止发酵，得到苹果酸发酵液；发酵过程中，通过自动流加氨水控制pH在6.3；并通过流加浓度为200g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在不低于10g/L；
所述发酵罐培养基组分为：碳酸钙80g/L，葡萄糖60g/L，木糖50 g/L，玉米浆12g/L，硫酸铵2g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，七水硫酸亚铁10mg/L，六水合硫酸镍10mg/L，pH值6.2。
苹果酸分离纯化方法同实施例1。
实施例5
各因素对米曲霉发酵苹果酸产量的影响：实验流程参照申请人之前的专利技术“一种采用米曲霉发酵产苹果酸的工艺，CN106929548B”。
L-苹果酸的测定：采用2,7—萘二酚显色法，取样品溶液（发酵液）1.0 mL，加入6.0mL分析纯的浓硫酸，再加入0.1 mL 2,7—萘二酚溶液，接着在100℃水浴中加热20 min，取出待冷却至室温后，于385 nm下进行比色测定，以蒸馏水作对照校正仪器零点。用标准样品先作标准曲线，以苹果酸含量为横坐标，385 nm处吸收值即OD385为纵坐标，通过未知样品在385 nm处的OD值，则可在标准曲线上查得相应的L-苹果酸含量。
各组别发酵液中L-苹果酸的产量见表1：
表1
Figure 102688DEST_PATH_IMAGE002
实施例4
在实施例2的基础上，验证纳他霉素添加量对L-苹果酸产量的影响。具体见表2：
表2
纳他霉素添加浓度（mg/L） L-苹果酸产量（g/L）
0 96.3
2.5 109.5
5 120.4
7.5 118.9
10 114.3
12.5 110.7
15 108.2
而发酵中后期，苹果酸产量大幅提升，此时琥珀酸脱氢酶也随之达到或接近峰值，添加纳他霉素能够抑制琥珀酸脱氢酶的活力；纳他霉素添加量需要控制在合理的水平，以10mg/L以内较为合适，避免过度影响TCA循环而导致菌体活力大幅下降甚至死亡。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方式对本案作了详尽的说明，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所作的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种生产苹果酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
取苹果酸发酵液，3000rpm离心5min，去除沉淀，收集上清液，然后添加活性炭，搅拌30min，再添加硅藻土，搅拌均匀，板框过滤，收集滤液，再进行微滤膜过滤，收集微滤液，通过装填有强碱弱酸型两性离子交换树脂的色谱柱，使其中的苹果酸被吸附，然后用70℃热水洗脱吸附于树脂上的苹果酸，反复洗脱3-5次，将得到的洗脱液合并，减压蒸馏，真空干燥，得到苹果酸产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活性炭的添加量为0.5%质量体积比。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硅藻土的添加量为0.2%质量体积比。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微滤膜截留分子量为5000Da，微滤温度为30℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述苹果酸发酵液按照如下步骤制备：
按照米曲霉种子液∶发酵罐培养基为1∶10的体积比例转入发酵罐中培养，温度33℃，培养48h，然后添加碳酸钙和纳他霉素，继续发酵36h，然后控制温度为39℃，压强为2个大气压，保温保压发酵12h，停止发酵，得到苹果酸发酵液；发酵过程中，通过自动流加氨水控制pH在6.3；并通过流加葡萄糖溶液将残糖控制在不低于10g/L。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述碳酸钙的添加量为80g/L。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述纳他霉素的添加量为5mg/L。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵罐培养基组分为：碳酸钙80g/L，葡萄糖60g/L，木糖50 g/L，玉米浆12g/L，硫酸铵2g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，七水硫酸亚铁10mg/L，六水合硫酸镍10mg/L，pH值6.2。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述米曲霉种子液的制备方法为：将米曲霉菌液按照10％体积比的接种量接入种子罐培养基中进行培养，在温度为33℃，摇床转速为200r/min，培养12h得到种子液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述种子罐培养基组分为：蔗糖3g，硝酸钠0.2g，硫酸铵0.5g，磷酸二氢钾0.1g，磷酸氢二钾0.1g，一水硫酸锰0.1g，七水硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.01g，氯化钠0.01g，pH值6.0，定容至1L。
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